Name: Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, mikrobiyal metabolizmayı optogenetik yöntemlerle dinamik olarak düzenleyerek kimyasal ve protein üretimini nasıl artırabilirsiniz. Bu protokol, mavi ışıkla kontrol edilen fermantasyon sistemlerinin kurulumunu gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma ABD Enerji Bakanlığı, Bilim Ofisi, DE-SC0019363 Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi Ödül Numarası, NSF KARİYER Ödülü CBET-1751840, Pew Charitable Trusts ve Camille Dreyfus Öğretmen-Akademisyen Ödülü tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+shine+of+yeast+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The rise and shine of yeast optogenetics.</a> Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).</li>
<li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction%3A+Dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151(2020).</li>
<li>Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+metabolism+through+dynamic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering metabolism through dynamic control.</a> Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).</li>
<li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+modalities+of+dynamic+control+in+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+rapid+optogenetic+circuits+for+dynamic+control+in+yeast+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).</li>
<li>Lalwani, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+the+lac+operon+for+bacterial+chemical+and+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production.</a> Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+engineered+cellular+metabolism+for+microbial+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production.</a> Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).</li>
<li>Baumschlager, A., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+approaches+for+optogenetics+and+tools+for+transcriptional+light-control+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria.</a> Advanced Biology. 5 (5), 2000256(2021).</li>
<li>Dvorak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+substrate+toxicity+by+IPTG+in+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29+carrying+a+synthetic+metabolic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway.</a> Microbial Cell Factories. 14, 201(2015).</li>
<li>Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+in+metabolic+engineering%3A+Theories%2C+tools%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications.</a> Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).</li>
<li>Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Chemical+and+Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of metabolism.</a> Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+amplification+circuits+for+light-induced+metabolic+control%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).</li>
<li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurospora+crassa+Inducible+Q+System+Enables+Simultaneous+Optogenetic+Amplification+and+Inversion+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+Bidirectional+Control+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+gene+copy+number+amplification+in+Pichia+pastoris+by+vector+integration+into+the+ribosomal+DNA+locus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus.</a> FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).</li>
<li>Nordén, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+dosage+greatly+enhances+recombinant+expression+of+aquaporins+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris.</a> BMC Biotechnology. 11, 47(2011).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+control+of+metabolic+flux+through+assembly+of+synthetic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles.</a> Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).</li>
<li>Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbes+to+synthesize+plant+isoprenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids.</a> Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).</li>
<li>Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+tac+promoter+and+lacI%28q%29+for+the+controlled+expression+of+Zymomonas+mobilis+fermentative+genes+in+Escherichia+coli+and+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis.</a> Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).</li>
<li>Steen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+the+production+of+n-butanol%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.</a> Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).</li>
<li>Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+central+carbon+metabolism+for+improved+pathway+yields+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).</li>
<li>Jayaraman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-mediated+transcriptional+activation+and+repression+of+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria.</a> Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994(2016).</li>
<li>Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RGB+color+vision+into+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering RGB color vision into Escherichia coli.</a> Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-powered+Escherichia+coli+cell+division+for+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+flux+control+of+triosephosphate+isomerase+on+glycolysis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).</li>
<li>Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+synechocystis+PCC6803+UirS-UirR+as+a+UV-violet%2Fgreen+photoreversible+transcriptional+regulatory+tool+in+E.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).</li>
<li>Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichromatic+control+of+gene+expression+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multichromatic control of gene expression in escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).</li>
<li>Stewart, C. J., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+an+automated+illuminating%2C+culturing%2C+and+sampling+system+for+microbial+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894(2017).</li>
<li>Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li>
<li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterisation+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLoS Biology. 18 (7), (2020).</li>
<li>Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+and+biosensors+set+the+stage+for+metabolic+cybergenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).</li>
<li>Melendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li>
<li>Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+Bacillus+subtilis+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Xia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modification+of+pseudomonas+aeruginosa+enables+controllable+twitching+motility+and+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).</li>
<li>Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+manipulation+enables+prevention+of+biofilm+formation+of+engineered+pseudomonas+aeruginosa+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalede açıklanan optogenetik devreler ve yöntemler için çeşitli patent başvurularında bulunmuşlardır.

Dinamik kontrol, metabolik mühendislik ve rekombinant protein üretimi için verimi artırmak amacıyla uzun zamandır uygulanmaktadır4. Enzimatik ekspresyondaki kaymalar en tipik olarak IPTG21, galaktoz22 ve tetrasiklin23 gibi kimyasal indükleyiciler kullanılarak uygulanır, ancak sıcaklık ve pH gibi proses koşulları kullanılarak da aracılık edilir. Gen ekspresyonunun optogenetik kontrolü, fermantasyon parametrelerinde veya ortam b...

Biyolojik süreçlerin ışığa duyarlı proteinlerle kontrolü olan optogenetik, kimyasal ve protein üretimi için mikrobiyal fermantasyonları dinamik olarak kontrol etmek için yeni bir strateji sunar1,2. Mühendislik metabolik yolaklarının yükü ve bazı ara ürünlerin ve ürünlerin toksisitesi genellikle hücre büyümesini bozar3. Bu tür gerilimler zayıf biyokütle birikimine ve üretkenliğin azalmasına neden olabilir3. Bu zorluk, fermantasyonların metabolik kaynakları sırasıyla biyokütle birikimine veya ürün sentezine ayıran bir büyüme ve üretim aşamasına geçici olarak bölünmesiyle ele alınabilir4. Kısa bir süre önce, bu iki fazlı fermantasyonda büyümeden üretime geçişin, aydınlatma koşullarındaki değişikliklerle tetiklenebileceğini gösterdik5,6,7. Işık girdilerinin yüksek ayarlanabilirliği, tersine çevrilebilirliği ve ortogonalitesi8, geleneksel iki fazlı fermantasyonların dinamik kontrolünde kullanılan kimyasal indükleyicilerle çoğaltılması zor veya imkansız olan ışık kontrollü fermantasyonlara benzersiz avantajlar sunar4,9,10,11.
Erythrobacter litoris'ten türetilen mavi ışığa duyarlı EL222 proteini, Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13'te metabolik mühendislik için birkaç optogenetik devre geliştirmek için kullanılmıştır. EL222, mavi ışık aktivasyonu (465 nm) üzerine konformasyonel bir kaymaya uğrayan ve konyak DNA dizisine (C120) bağlanmasını sağlayan bir ışık-oksijen-voltaj sensörü (LOV) alanı içerir13. EL222'nin viral VP16 aktivasyon alanına (VP16-EL222) kaynaştırılması, sentetik promotör PC120'den S. cerevisiae7 ve diğer organizmalarda14 gen ekspresyonunu geri dönüşümlü olarak aktive edebilen mavi ışığa duyarlı bir transkripsiyon faktörü ile sonuçlanır. EL222'ye dayanan çeşitli devreler geliştirilmiş ve S. cerevisiae'de kimyasal üretim için kullanılmıştır, örneğin temel ışıkla aktive olan OptoEXP sistemi7 gibi, ilgilenilen genin doğrudan PC120'den ifade edildiği (Şekil 1A). Bununla birlikte, fermantasyonların üretim aşamasında tipik olarak karşılaşılan yüksek hücre yoğunluklarındaki ışık penetrasyonu endişeleri, bizi OptoINVRT ve OptoQ-INVRT devreleri gibi karanlıkta indüklenen ters devreler geliştirmeye motive etmiştir (Şekil 1B)5,7,13. Bu sistemler, sırasıyla S. cerevisiae ve N. crassa'dan galaktoz (GAL) veya kinik asit (Q) regülonlarını kullanır, karşılık gelen baskılayıcılarını (GAL80 ve QS) VP16-EL222 ile kontrol eder, ışıkta gen ekspresyonunu bastırır ve karanlıkta güçlü bir şekilde indükler. OptoEXP ve OptoINVRT devrelerinin birleştirilmesi, gen ekspresyonunun çift yönlü kontrolü ile sonuçlanır ve büyüme fazının mavi ışıkla ve üretim fazının karanlıkla indüklendiği iki fazlı fermantasyonları mümkün kılar (Şekil 2A)5,7.
Üretim aşamasında gen ekspresyonunu indüklemek için karanlık yerine ışık kullanmak, optogenetik kontrollerin yeteneklerini büyük ölçüde genişletecek, ancak aynı zamanda fermantasyonun bu aşamasında tipik olarak karşılaşılan yüksek hücre yoğunluklarının ışık penetrasyon sınırlamalarının üstesinden gelmeyi gerektirecektir. Bu amaçla, mavi ışık stimülasyonuna transkripsiyonel yanıtı yükselten OptoAMP ve OptoQ-AMP olarak bilinen devreler geliştirdik. Bu devreler, sırasıyla GAL veya Q regülasyonlarının transkripsiyonel aktivatörleri Gal4p veya QF2'nin üretimini kontrol etmek için VP16-EL222'nin vahşi tip veya aşırı duyarlı mutantlarını kullanır ve ışıkla daha fazla duyarlılık ve daha güçlü gen ekspresyonu elde eder12,13 (Şekil 1C). OptoAMP devreleri, optik yoğunlukta (600 nm'de ölçülen) 5 L biyoreaktörlerde tam ve homojen ışık indüksiyonu elde edebilir; OD600) sadece ~% 0.35 aydınlatma ile en az 40 değerleri (dökme yüzeyin sadece% ~% 7'sinde% 5 ışık dozu). Bu, 0'e yakın aydınlatma gerektiren OptoEXP'e kıyasla daha yüksek bir hassasiyet derecesi gösterir12. Yüksek hücre yoğunluklarında ışıkla gen ekspresyonunu etkili bir şekilde indükleme yeteneği, fermantasyonların dinamik kontrolü için yeni fırsatlar yaratır. Bu, kimyasal üretimi optimize etmek için benzersiz ışık programlarıyla büyüme, indüksiyon ve üretim aşamalarının oluşturulduğu üç fazlı fermantasyonlar gibi ikiden fazla zamansal fazda çalışan fermantasyonları içerir (Şekil 2B)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg"> Resim 1: S. cerevisiae'nin dinamik kontrolü için optogenetik devreler. OptoEXP, OptoINVRT ve OptoAMP devreleri ışığa duyarlı VP16-EL222 sistemine dayanmaktadır. (A) OptoEXP devresinde, mavi ışığa maruz kalmak, DNA bağlayıcı bir alanı açığa çıkaran ve PC120'den transkripsiyona izin veren VP16-EL222'nin konformasyonel bir değişimine ve dimerizasyonuna neden olur. Rakam Zhao ve ark.7'den değiştirilmiştir. (B) OptoINVRT devreleri, karanlıkta ifadeyi indüklemek için GAL (gösterilen) veya Q regülonlarını kullanır. GAL tabanlı devrelerde, VP16-EL222 ve GAL4 yapısal olarak ifade edilirken, PC120, GAL80 baskılayıcısının ifadesini çalıştırır (Q tabanlı devrelerde, GAL4 ve GAL80, sırasıyla QF2 ve QS ile değiştirilir ve GAL promotörü yerine sentetik bir QUAS içeren promotör kullanılır). Işıkta, Gal80p, PGAL1'den ilgili genin aktivasyonunu önler. Karanlıkta, GAL80, PGAL1'in Gal4p tarafından aktive edilmesine izin veren kurucu bir degron alanına (küçük kahverengi alan) kaynaştırılarak eksprese edilmez ve hızla parçalanır. Rakam Zhao ve ark.5'ten değiştirilmiştir. (C) OptoAMP devreleri ayrıca GAL (gösterilmiştir) veya Q regülonlarını kontrol etmek için VP16-EL222 kullanır. Bu devrelerde, GAL80 baskılayıcı (veya QS) yapısal olarak ifade edilir ve karanlıkta sıkı bastırma sağlayan ışığa duyarlı bir degron (küçük mavi alan) ile kaynaştırılır. PC120 ve aşırı duyarlı VP16-EL222 mutant ekspresyonu, ışıkta PGAL1'i (veya QUAS içeren bir promotörü) güçlü bir şekilde aktive eden ışıkla GAL4'ün (veya QF2'nin) ekspresyonunu kontrol eder. GAL türevi devreler, artan aktiviteye sahip PGAL1-M veya PGAL1-S gibi PGAL1'in mühendislik formlarını ve GAL regulonu (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7) tarafından kontrol edilen vahşi tip promotörleri kullanabilir. Şekil Zhao ve ark.12'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg"> Şekil 2: Zaman içinde iki ve üç fazlı fermantasyonlar. (A) Ters çevrilmiş devrelerle çalıştırılan iki fazlı fermantasyonlar, ışıkla çalışan bir büyüme fazı ve karanlık bir üretim fazından oluşur. Büyüme aşamasında, üretim yolu baskılanmış kaldıkça biyokütle birikir. İstenilen OD600'e ulaştıktan sonra, hücreler üretim aşaması için taze ortamda yeniden askıya alınmadan önce metabolik olarak ayarlanmak üzere karanlığa kaydırılır. (B) Üç fazlı bir süreçte, büyüme, inkübasyon ve üretim aşamaları, karanlık bir büyüme periyodu, darbeli inkübasyon ve tamamen aydınlatılmış üretim aşamasından oluşabilecek benzersiz ışık programları ile tanımlanır. Biorender ile oluşturulan figür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Optogenetik devreler, E. coli'de kimyasal ve protein üretiminin dinamik kontrolü için de geliştirilmiştir. OptoLAC devreleri, YF1/FixJ iki bileşenli sistem6 tabanlı ışığa duyarlı pDawn devresini kullanarak bakteriyel LacI baskılayıcıyı kontrol eder (Şekil 3). OptoINVRT5'e benzer şekilde, OptoLAC devreleri ışıktaki gen ekspresyonunu bastırmak ve karanlıkta indüklemek için tasarlanmıştır. OptoLAC devrelerini kullanan ekspresyon seviyeleri, standart izopropil β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) indüksiyonu ile elde edilenlerle eşleşebilir veya aşabilir, böylece gelişmiş ayarlanabilirlik ve geri dönüşümlülük sunarken kimyasal indüksiyonun gücünü koruyabilir6. Bu nedenle, OptoLAC devreleri, E. coli'de metabolik mühendislik için etkili optogenetik kontrol sağlar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg"> Resim 3: E. coli'nin dinamik kontrolü için OptoLAC devreleri. OptoLAC devreleri, karanlıkta aktivasyon ve ışıkta baskı sağlamak için pDawn sistemini ve lac operonu'yu uyarlar. Karanlıkta, YF1 FixJ'yi fosforile eder, bu da daha sonra cI baskılayıcısını ifade etmek için PFixK2 promotörünü aktive eder. CP baskılayıcı, lacI baskılayıcının PR promotöründen ekspresyonunu önler, bu da lacO içeren bir promotörden ilgilenilen genin transkripsiyonuna izin verir. Tersine, mavi ışık YF1 net kinaz aktivitesini azaltır, FixJ fosforilasyonunu ve dolayısıyla lacI ekspresyonunu baskılayan ve lakO içeren promotörden ekspresyonu önleyen cI ekspresyonunu tersine çevirir. Şekil Lalwani ve ark.6'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Burada, kimyasal veya protein üretimi için S. cerevisiae ve E. coli'nin ışık kontrollü fermantasyonları için temel protokolleri açıklıyoruz. Hem maya hem de bakteriler için, öncelikle OptoINVRT ve OptoLAC devreleri tarafından sağlanan ışık odaklı bir büyüme aşaması ve karanlığa bağlı bir üretim aşaması ile fermantasyonlara odaklanıyoruz. Daha sonra, OptoAMP devreleri tarafından sağlanan üç fazlı (büyüme, indüksiyon, üretim) ışık kontrollü fermantasyon için bir protokol tanımladık. Ayrıca, mikroplakalardan laboratuvar ölçeğindeki biyoreaktörlere kadar optogenetik olarak kontrol edilen fermantasyonların nasıl ölçeklendirileceğini açıklıyoruz. Bu protokolle, kimyasal veya protein üretimi için ışık kontrollü fermantasyonlar gerçekleştirmek için eksiksiz ve kolayca tekrarlanabilir bir kılavuz sağlamayı amaçlıyoruz.

<table><tbody><tr><td><>S. cerevisiae></güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu kültür plakası</td> <kullanarak güçlüIşık kontrollü kimyasal üretim <td>ABD Bilimsel</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Agar tozu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>303991049</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>&mu ile Biyospektrometre; küvet</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Mavi LED panel</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>EZ-L439 OptoINVRT7 Plazmid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Referans 1'e bakın</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560L</td><td></td></tr><tr><td>Kuantum metre</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>Çoğaltma kaplama cihazı</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37848-0000</td><td></td></tr><tr><td>Replika kaplama pedleri</td><td>Sunrise Science Products</td><td>3005-012</td><td></td></tr><tr><td>SC-His powder</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1303-030</td><td></td></tr><tr><td>SC Komple toz</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>Steril sızdırmazlık filmi</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-SEAL-PLT</td><td></td></tr><tr><td>YPD agar plakaları</td><td>VWR</td><td>100217-054</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td><>E. coli</td><td></td><td></td><td></td>6X kullanılarak güçlüışık kontrollü protein üretimi</tr> <tr><td>SDS Numune Tamponu</td><td>Cepham Yaşam Bilimleri</td><td>10502</td><td></td></tr><tr><td>%12 Akrilamid protein jelleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0341BOX</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu kültür plakası</td><td>ABD Bilimsel</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>&mu ile BiyoSpektrometre; küvet</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Mavi LED panel</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td> Elektroforez güç kaynağı Bio-Rad 1645050 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB suyu (Miller)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP97235</tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thomas Scientific</td><td>SX0425-1</td><td></td></tr><tr><td>OptoLAC plazmitleri</td><td>N/A</td><td>N/A Referans</td><td>2'ye bakın</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>Kuantum metre</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SOC ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521<</td><td></td></tr><tr><td>güçlü>S kullanarak üç fazlı fermantasyon. cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"S. cerevisiae kullanarak ışık kontrollü kimyasal üretim" protokolü ile aynı malzemeler artı aşağıdakiler:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-L580 OptoAMP4 Plazmid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bkz. Referans 10</td></tr><tr><td><güçlü>Işık kontrollü bir biyoreaktörde kimyasal üretim</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>Kontrol istasyonlu Biyoreaktör</td><td>Eppendorf</td><td>B120110001</td><td></td></tr><tr><td>&mu ile Biyospektrometre; küvet</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu</td><td>VWR Scientific</td><td>89501-620 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Mavi LED panel</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>BPT boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-15</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>M9 Minimal Tuzlar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1374401</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrosantrifüj Thermo Fisher Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0503-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>Kuantum metre</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SC Komple toz</td><td>Gündoğumu Bilim Ürünleri</td><td>1459-100</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrobiyal kimyasal ve protein Üretimi için işık kontrollü fermantasyonlar

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Mikrobiyal hücre fabrikaları, yenilenebilir hammaddelerden kimyasallar ve rekombinant proteinler üretmek için sürdürülebilir bir alternatif sunmaktadır. Bununla birlikte, bir mikroorganizmanın genetik modifikasyonlarla aşırı yüklenmesi, konakçı uygunluğunu ve verimliliğini azaltabilir. Bu sorun, dinamik kontrol kullanılarak aşılabilir: hücresel büyüme ve üretimi dengelemek için tipik olarak kimyasal veya besin bazlı katkı maddeleri kullanan enzimlerin ve yolakların indüklenebilir ekspresyonu. Optogenetik, gen ekspresyonunu dinamik olarak düzenlemek için invaziv olmayan, yüksek oranda ayarlanabilir ve geri dönüşümlü bir yöntem sunar. Burada, kimyasalların veya rekombinant proteinlerin üretimi için mühendislik ürünü Escherichia coli ve Saccharomyces cerevisiae'nin ışık kontrollü fermantasyonlarının nasıl kurulacağını açıklıyoruz. Gelişmiş fermantasyon kontrolü ve üretkenliği için mikrobiyal büyüme ve üretimi ayırmak için seçilen zamanlarda ve dozajlarda ışığın nasıl uygulanacağını ve en iyi sonuçlar için temel optimizasyon hususlarını tartışıyoruz. Ek olarak, laboratuvar ölçeğinde biyoreaktör deneyleri için ışık kontrollerinin nasıl uygulanacağını açıklıyoruz. Bu protokoller, gelişmiş fermantasyon performansı için mühendislik mikroorganizmalarında optogenetik kontrollerin benimsenmesini kolaylaştırır.

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik düzenlemesi, biyoyakıtlar, dökme kimyasallar, proteinler ve doğal ürünler dahil olmak üzere çeşitli ürünler üretmek için başarıyla uygulanmıştır5,6,7,12,13. Bu işlemlerin çoğu, hücre büyümesinin ışıkta gerçekleşmesi (düşük hücre yoğunluğu ışık penetrasyonu ile minimum zorluklar yarattığında) ve hücreler büyüdükten sonra ür...

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Optogenetik, tipik indükleyicilere kıyasla çeşitli kimyasalların ve proteinlerin daha yüksek titrelerini elde etmek için kullanılmıştır. Bu protokolü kullanarak, diğerleri ışık tabanlı kontrol ile kendi süreçlerini geliştirebilirler. Optogenetik kontrol noninvaziv, yüksek oranda ayarlanabilir ve geri dönüşümlüdür.Bu nitelikler, mikrobiyal süreçlerin kolaylaştırılmış bir optimizasyonuna izin verir ve hatta üç fazlı fermantasyonlar ve çok renkli kontrol gibi benzersiz fırsatlar sunar. Herhangi bir yeni kimyasal için, optimum ışık koşulları farklı olacaktır. Bu nedenle, bu protokoldeki parametreler kullanılarak düşük üretim gözlenirse, farklı ışık koşulları test edilmelidir.OptoINVRT plazmidleri için gerekli bir belirteç olan HIS3 oksitrofisi ile bir Saccharomyces cerevisiae suşu elde ederek başlayın. Saccharomyces cerevisiae'ye özgü bir geni kontrol etmeye çalışıyorsanız, devam etmeden önce genin endojen kopyasının silindiğinden emin olun. Gerinim yapısına başlamak için, EZL439 gibi OptoINVRT7 devresini içeren plazmidi doğrusallaştırın.PIGA bir promotörün ışıkta bastırılması ve karanlıkta etkinleştirilmesi için bileşenleri içeren EZL439 kullanıyorsanız, Pme1 kısıtlama bölgesinde doğrusallaştırın. Standart lityum asetat dönüşüm yöntemlerini kullanarak, plazmidi bir HIS3 oksotrofik suşa entegre edin. Dönüşümü takiben, hücreleri bir dakika boyunca 150 G'de santrifüj edin.Hücreleri 200 mikrolitre taze SC-HIS ortamında nazikçe yeniden askıya alın. Tüm hücre hacmini bir SC-HIS agar plakasına yerleştirin ve koloniler ortaya çıkana kadar iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Standart lityum asetat dönüşüm protokollerini kullanarak yetkin hücreler hazırlayın.PIGA1M veya PIGA1S promotörlerinin aşağı akışını optogenetik olarak kontrol etmek istediğiniz genleri içeren plazmid ile hücreleri dönüştürün. Transformasyondan sonra, kültürü bir dakika boyunca 150 G'de santrifüj edin ve hücre peletini 200 mikrolitre taze SC bırakma ortamında nazikçe yeniden askıya alın. Bir maya ekstraktı pepton dekstroz agar plakası üzerindeki tüm hücre hacmini, Delta bölgelerine entegre edilirse veya bir seçim işaretleyicisi içeren bir plazmid ile dönüştürülürse bir SC bırakma plakasını plakalayın.Optogenetik olarak kontrol edilen geni bastırmak için hücreleri sabit mavi ışık altında 16 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. 465 nanometre dalga boyundaki herhangi bir ışık kaynağını kullanın ve ışık yoğunluğu saniyede metrekare başına yaklaşık 80 ila 110 mikromol olacak şekilde plakanın yaklaşık 40 santimetre üzerine bir LED panel yerleştirin. Bir kuantum ölçer kullanarak yoğunluğu ölçün.Delta bölgelerine entegre ediliyorsa, plakayı, çeşitli entegrasyon kopya numaralarını seçmek için mililitre başına 400 mikrogram ile mililitre başına 1.200 mikrogram arasında bir dizi Zeocin konsantrasyonu içeren maya özü pepton dekstroz plakaları üzerine çoğaltın. Kopya plakaları, koloniler görünene kadar iki ila üç gün boyunca sabit veya darbeli mavi ışık altında 30 santigrat derecede inkübe edin. Ön taramayı gerçekleştirmek için, her plakadan sekiz koloni seçin ve bunları 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyularında% 2 glikoz ile desteklenmiş bir mililitre SC-HIS ortamını aşılamak için kullanın.Hücreleri, sürekli mavi ışık aydınlatması altında dakikada 200 devirde sallanan 30 santigrat derecede gece boyunca büyütün. Ertesi gün, 600 nanometrede 0.01 ila 0.3 arasında değişen optik yoğunluk değerlerini elde etmek için her kültürü taze bir SC-HIS ortamında% 2 glikoz ile seyreltin ve kültürleri, optik yoğunluk iki ila dokuz arasında ulaşana kadar 30 santigrat derecede sabit veya darbeli ışık altında dakikada 200 devir sallama durumunda büyütün. Ardından, plakaları alüminyum folyo ile sarın, ışık panelini kapatın ve plakaları karanlıkta dakikada 200 devirle 30 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.24 kuyucuk plakasındaki kültürleri 234 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve hücreleri% 2 glikoz ile bir mililitre taze sentetik tam bırakma ortamında yeniden askıya alın. İstenilen ürünün buharlaşmasını önlemek için steril mikroplaka sızdırmazlık bandı kullanarak plakaları kapatın. Mühürlü plakaları karanlıkta 48 saat boyunca dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede sallayarak fermente edin.Fermantasyonları hasat etmek için, plakaları 234 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantın 800 mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İlgilenilen kimyasala bağlı olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, gaz kromatografisi kütle spektrometresi veya kullanılan cihaz için en uygun numune hazırlama tekniğini kullanarak başka bir analitik yöntem kullanarak analiz yapın. Her plakadan sekiz koloni seçin ve bunları 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarında% 2 glikoz ile bir mililitre SC-HIS ortamını aşılamak için kullanın.Hücreleri karanlıkta gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün ve dakikada 200 devir sallayın. Ertesi sabah, her kültürü% 2 glikoz ila 0.1 optik yoğunluk ile taze bir SC-HIS ortamında seyreltin. Işığa maruz kalmayı önlemek için plakaları alüminyum folyoya sarın ve kültürü karanlıkta 30 santigrat derecede büyütün ve dakikada 200 devir üç optik yoğunluğa ulaşana kadar sallayın.Daha sonra, plakaları darbeli ışık altında 30 santigrat derecede 12 saat boyunca inkübe edin ve dakikada 200 devir sallayın. Kültürleri beş dakika boyunca 234 G'de santrifüj yapın ve% 2 glikoz ile taze SC-HIS ortamında yeniden askıya alın. İstenilen ürünün buharlaşmasını önlemek için steril mikroplaka sızdırmazlık bandı kullanarak plakaları kapatın.Kapatılmış plakaları dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede sallayarak 48 saat boyunca ışıkta fermente edin. Optogenetik fermantasyonlar yapıldıktan sonra, kimyasal üretim iki devre ile indüksiyon sırasında bir dizi hücre yoğunluğunda test edildi. OptoINVRT7 devresi, OptoINVRT1 ve 2 devrelerine kıyasla 7.0 ve 8.75 indüksiyon değerinin optimal hücre yoğunluğuna sahip yüksek laktik asit ve izobutanol titreleri göstermiştir.OptoAMP devrelerini kullanan fermantasyonlar, farklı hafif hizmet döngüleri tarafından tanımlanan üç aşamada incelenmiştir. Laktik asit üretimi, darbeli bir büyüme fazı ve tamamen aydınlatılmış indüksiyon ve üretim aşamaları kullanılarak optimize edilebilir. İzobutanol üretimi, darbeli bir büyüme fazı, tamamen aydınlatılmış indüksiyon fazı ve darbeli üretim fazı kullanılarak optimize edilmiştir.Naringenin biyosentezi, darbeli bir büyüme tamamen aydınlatılmış indüksiyon ve karanlık üretim fazı kullanılarak en iyi şekilde optimize edilmiştir. OptoLAC sistemi, E.Coli'de, IPDG ile kimyasal indüksiyon kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırılabilir veya daha yüksek olan titrelerde transkripsiyon faktörü FDER üretmek için kullanılmıştır. Mevalonat üretmek için OptoLAC devreleri uygulanmıştır ve üretim, IPDG indüksiyonu kullanılarak elde edilen titreleri aşmaktadır.Biyoreaktör düzeyinde mevalonat üretimi, mikroplaka seviyelerinin ötesindeki bakterilerde kimyasal ve protein üretimi için optogenetik düzenlemenin ölçeklenebilirliğini ve ayarlanabilirliğini göstermektedir. Işık yoğunluğunun aydınlatılan basamaklar için uygun aralıkta olduğundan ve karanlık gerektiren basamaklarda ışık kontaminasyonunun önlendiğinden emin olmak önemlidir. Bu teknik, mayada izobutanolün rekor titrelerini elde etmenin, konsorsiyum popülasyonlarını ışıkla stabilize etmenin ve hatta sentetik ışık kontrollü organeller kullanarak metabolik akıyı kontrol etmenin yolunu açtı.

light-controlled-fermentations-for-microbial-chemical-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Hemmerich, J. ve diğerleri. Otomatik Mikrobiyoreaktör Teknolojisi Kullanarak Heterolog Protein Üretiminin Optimizasyonu İçin Protokol. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, farklı ortam formülasyonlarına yanıt olarak bakteriyel büyüme ve floresan protein salgısını izlemek için otomatik bir mikrobiyoreaktör kullanımını göstermektedir. Sekretör floresan protein ifade eden genetik olarak modifiye edilmiş bir bakteri, antibiyotik seçimi altında kültürlenir ve besin çeşitliliğindeki kuyulara...

Otomatik Mikrobiyoreaktörle Farklı Ortam Formülasyonlarında Bakteriyel Büyümenin İzlenmesi

Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Bu el yazması mikrobiyal yetiştirme ortamının terzi tasarımı için genel bir yaklaşımı açıklar. Bu güvenilirlik ve sıvı ortam işleme hızı artırmak için laboratuvar robot tarafından desteklenen yeterli ekimi verimi için deneysel tasarım ve microbioreactor teknoloji Kriging tabanlı birleştiren yinelemeli bir iş akışı tarafından etkin hazırlık.

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

Zorunlu anaerobik organizmalar oksijene maruz kaldıktan sonra büyüyemedikleri için anaerobik kültür tekniklerinin kullanımı vazgeçilmezdir. Burada, medya hazırlığından gaz ve uçucu yağ asidi nicelleştirmesine kadar bir biyogaz bitkisinden elde edilen karışık bir kültürü yetiştirmek için basit ve etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Kesinlikle Anaerobik/Anoksik Koşullarda Mikroorganizmaların Yetiştirilmesi için Orta Hazırlık

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Bu protokol, enzim üretimini artırmak için döner bir katı hal fermantasyon sisteminde buğday kepeğini kullanır. Kitin gibi indükleyicilerle desteklenen substrat, kontrollü koşullar altında mantar büyümesini destekler. Sonuçlar, daldırılmış fermantasyona kıyasla 4-6 kat daha yüksek enzim verimini göstererek, yöntemin çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için uyarlanabilirliğini ve etkinliğini göstermektedir.

Filamentli Mantarlar ile Polimer Hidrolitik Hücre Dışı Enzim Üretimi için Katı Hal Fermantasyon Sistemlerinin Tasarımı

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu yöntem biyolojik polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerin kombinatoryal sentezi ve bu kütüphanelerin protein serbest high-throughput algılama anlatılmaktadır.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve...

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

Öğrenin, mikrobiyal metabolizmayı optogenetik yöntemlerle dinamik olarak düzenleyerek kimyasal ve protein üretimini nasıl artırabilirsiniz. Bu protokol, mavi ışıkla kontrol edilen fermantasyon sistemlerinin kurulumunu gösterir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Daha fazla video keşfet