Aptamer Afinite Boncukları Kullanılarak Gram-Negatif Bakterilerin Akış Yoluyla Ayrılması için Mikroakışkan Akustoforez
17 Ekim 2022
Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır.
Bu protokol, aptamer modifiye mikro boncuklar kullanılarak Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde ayrılması için kullanılabilecek mikroakışkan akustoforez teknolojimizi açıklamaktadır. Mikroakışkan akustoforez sistemleri, makul verim ve temassız hücre izolasyonu ile Gram-negatif bakteri ayrımını sağlar. Mikroakışkan akustoforez, bakterileri tıbbi ve çevresel örneklerden izole etmek için optimize edilebilir.
Başlamak için, hedef çıkışta PS boncuklarını toplayan ve numune girişine bir PS numune karışımı enjekte ettikten sonra geri kalanını atan mikroakışkan bir akustoforez çipi tasarlayın. Borosilikat camına bağlanmış silikon tabakanın üstündeki ve altındaki katmanlarla bir çip hazırlayın. Ve eloksal kullanarak üçüncü bir borosilikat cam tabakası 1000 volt ve 400 santigrat derece ekler.
10 mikrolitreden az siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak mikroakışkan kanal boyunca borosilikat cam tabakaya bir PZT takın. GN ve GP bakterilerini Luria-Bertani ortamında aşılayın ve 16 saat boyunca dakikada 37 santigrat derece ve 220 devirde inkübe edin. Kültürlenmiş bakterileri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 9.056 RCF'de santrifüj edin.
Ardından 1X PBS tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen GN ve GP bakterilerini bağlanma tamponunda yeniden askıya alarak analiz için hazırlayın. 10 mikrometre streptavidin kaplı mikro boncuk karışımını kullanmadan önce tekrar askıya alın.
Karışımı 20 saniye boyunca vorteksleyin. Aptamer'i üç dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre ederek ve ardından iki dakika boyunca sıfır santigrat derecede yeniden katlayarak hazırlayın. Yeniden askıya alınmış streptavidin kaplı mikro boncuk karışımının 250 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpe 100 mikrolitre biyotinile DNA aptamer ekleyin.
Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ederken dakikada 25 devirde döndürün. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 40 saniye boyunca 9.056 RCF'de santrifüj edin. Daha sonra tüpü 200 mikrolitre Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkayın.
Yıkanmış numune tüpüne mililitre BSA başına 10 mikrolitre 100 miligram ekleyin ve dakikada 25 devirde dönerken oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, aptamer modifiye mikro boncukları Tris-HCl tamponunda iki kez 9.056 RCF'de santrifüjleme ile oda sıcaklığında 40 saniye yıkayın. PEEK tüplerini iki numune ve tampon enjekte etmek için iki girişe ve atıkları toplamak ve boşaltmak için iki çıkışa bağlayın.
10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, mikroakışkan aküstoforez kanalını kabarcıksız demineralize su ile doldurun. Sıvı akışını kontrol etmek için iki veya daha fazla çıkış kanalına sahip hassas bir basınç kontrolörü hazırlayın. Cihazı hazırladıktan sonra, hassas basınç kontrol cihazını kullanarak numune girişine iki kilopaskal ve tampon girişine dört kilopaskal basınç uygulayarak numuneyi ve tamponu enjekte edin.
Bir mikroskop kullanarak, bir boncuk üzerine odaklanın ve PZT'yi kullanarak mikroakışkan kanalın merkezine taşıyın. Tek kanallı bir fonksiyon üreteci kullanarak 3.66 megahertz'lik bir rezonans frekansı oluşturun ve bir güç amplifikatörü kullanarak tipik bir sinyali 16 desibel yükseltin. Bir floresan mikroskobu ve saniyede 1.200 kare hızında çalışan yüksek hızlı bir kamera ile akustoakışkan çip üzerindeki ayırma ve zenginleştirme işlemlerini gözlemleyin.
Bu çalışmada tanıtılan akustophoretic çip, PZT'nin voltajı arttıkça, 10 mikrometre büyüklüğündeki boncukların merkezi konsantrasyonunun arttığını doğruladı. PZT voltajının beş voltunda, 10 mikrometre büyüklüğündeki boncukların çoğu merkezde yoğunlaşmıştı. Çıkışta toplanan boncuk sayısının enjekte edilen toplam 10 mikrometre büyüklüğündeki boncuk sayısına oranı, geri kazanım oranı olarak adlandırıldı.
10 mikrometre büyüklüğündeki boncuk sayısının toplanan toplam boncuk sayısına oranı saflık olarak adlandırıldı. Sonuçlar, cihazın 10 mikrometre boyutundaki boncuklar için yüksek bir ayırma verimliliğine sahip olduğunu gösterdi. Her aptamer modifiye mikro boncuğuna bağlı GN ve GP bakterilerinin sayısı, yüksek hızlı kameralı bir mikroskop kullanılarak ölçüldü.
Beş GN bakterisinin tümü boncuklara bağlanırken, test edilen maddelere önemli ölçüde daha az GP bakterisi bağlandı. Sinyal gücü, GN ve GP bakterileri arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi. PZT'yi tutturmak için kullanılan yapıştırıcı, oluklu mukavvanın doğruluğu için mümkün olduğunca az kullanılmalı ve PZT ve mikrokanal paralel olmalıdır.
Bu cihaz, bakteriyel bulaşıcı hastalıkların erken tanı döneminde canlı bakterileri veya bakteri kaynaklı biyobelirteçleri tespit etmek için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Gram-negatif bakterilerin çeşitli ortamlardan hızlı ve verimli bir şekilde ayrıştırılması için mikroakışkan akustoferez teknolojisini sunmaktadır. Yöntem, izolasyon sürecini geliştirmek için aptamerle modifiye edilmiş mikroboncuklar kullanarak, makul bir verimlilikle temassız hücre ayrıştırmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Akustoforez
- Mikrobiyoloji
Arka Plan
- Mikroakışkan sistemler, sıvıların mikro ölçekte hassas bir şekilde manipüle edilmesine olanak tanır.
- Akustoforez, parçacık manipülasyonu için akustik dalgaların kullanıldığı bir tekniktir.
- Gram-negatif bakteriler, yapısal özellikleri nedeniyle izolasyon sürecinde önemli zorluklar oluşturur.
- Aptamerler, belirli hedeflere seçici olarak bağlanabilen kısa, tek zincirli oligonükleotidlerdir.
Çalışmanın Amacı
- Bakterilerin verimli bir şekilde ayrıştırılması için mikroakışkan bir akustoforesis çipi geliştirmek.
- Hem tıbbi hem de çevresel örnekler için izolasyon sürecini optimize etmek.
- Ayrıştırma verimliliğini artırmada aptamerle modifiye edilmiş mikroboncukların etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Mikroakışkan bir akustoferez çipinin tasarlanması.
- Çip üretimi için silikon ve borosilikat cam katmanlarının bağlanması.
- Ayırma işlemi için çipe PS örnek karışımının enjekte edilmesi.
- Belirli voltaj ve sıcaklık koşulları altında anodizasyon uygulanması.
Temel Sonuçlar
- Mikroakışkan akustoforez sistemi, Gram-negatif bakterileri başarıyla izole etmiştir.
- Yüksek verimli ve temassız ayırma gerçekleştirilmiştir.
- Aptamerle modifiye edilmiş mikroboncuklar, izolasyon verimliliğini önemli ölçüde artırmıştır.
- Yöntem, hem tıbbi hem de çevresel örneklere uygulanabilirlebilir.
Sonuçlar
- Mikroakışkan akustoforesis, bakteriyel izolasyon için gelecek vadeden bir tekniktir.
- Aptamer modifikasyonları, işlemin seçiciliğini ve verimliliğini artırır.
- Bu teknoloji, mikrobiyolojideki çeşitli uygulamalar için faydalı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu mikroakışkan akustoforez yöntemi, erken evre enfeksiyon hastalığı teşhisleri ve çevresel izlemede kritik bir darboğaz olan karmaşık matrislerden Gram-negatif bakterilerin hızlı ve yüksek saflıkta izole edilmesini sağlar. Etiketsiz akustik ayırmayı aptamer tabanlı özgünlükle birleştiren bu teknoloji, antimikrobiyal keşif ve biyobelirteç doğrulama iş akışlarında hedef risk azaltma sürecini destekler. 10 kat konsantrasyonda gösterilen >%98 geri kazanım ve %97,8 saflık, preklinik örnek hazırlama işlemleri için santrifüjasyon veya filtrasyona ölçeklenebilir ve temassız bir alternatif sunar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Heterojen biyolojik veya çevresel örneklerden canlı patojenleri izole ederek, Gram-negatif bakteriyel hedeflerin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Geleneksel ayırma tekniklerine kıyasla örnek işleme süresini kısaltır ve biyomoleküler hasarı minimize eder.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşimi ve etki mekanizması çalışmaları için saflaştırılmış bakteriyel fraksiyonlar sağlayarak mekanistik risk azaltmaya destek olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fenotipik tarama analizleri için saflaştırılmış bakteriyel girdiler oluşturarak, kontamine Gram-pozitif türlerden kaynaklanan yanlış pozitifleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir akustoforetik odaklama ve aptamer aracılı yakalama yoluyla numune hazırlama sürecini standartlaştırır.
- Ölçeklenebilirlik: Çatallı kanal tasarımı, tarama kaskadlarında daha yüksek verimlilik için eş zamanlı işlemeye, saflaştırmaya ve konsantrasyona olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Kan veya idrar gibi klinik benzeri matrislerden Gram-negatif bakterilerin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlayarak, keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Biyobelirteç Uyumu: Erken tanı uygulamalarında canlı bakterilerin veya türetilmiş biyobelirteçlerin tespitini kolaylaştırarak, translasyonel biyobelirteç gelişimini destekler.
- Risk Ayarlı İlerleme: Yüksek geri kazanım ve saflık metrikleri, öncü bileşik değerlendirmesinde kullanılan alt analizlerdeki güvenilirliği artırır.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uygundur; özellikle Gram-negatif bakteri saflığının kritik olduğu hedef doğrulama, assay hazırlığı ve mekanistik çalışmalar için örnek hazırlama sürecini desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Hedef riskini azaltmak amacıyla, karma kültürlerden veya çevresel örneklerden spesifik Gram-negatif suşları izole ederek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Girişim yapan bileşenlerin taşınmasını minimuma indirerek, tarama güvenilirliğini artıran ve analize hazır bakteriyel popülasyonların elde edilmesini sağlar.
- Analizler: Floresan mikroskopi ve yüksek hızlı görüntüleme aracılığıyla kantitatif çıktılar sağlayarak, boncuk-bakteri bağlanma oranlarının ve sinyal gücünün karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Tıbbi açıdan ilgili örneklerden izolasyona olanak tanıyarak preklinik iş akışlarıyla bağlantı kurar ve enfeksiyöz hastalık modeli geliştirmede sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çip tabanlı tasarım ve basınç kontrollü akışkanlar, laboratuvarlar arası standartlaşmaya ve yeniden tasarım gerekmeden çeşitli örnek tiplerine uyarlanmaya imkan verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Örnek safsızlıklarından kaynaklanan mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Hassas akustik kuvvet kontrolü ve standartlaştırılmış aptamer-boncuk hazırlama süreci aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Yüksek sadakatli biyolojik girdiler sunarak antimikrobiyal programlardaki devam/durdurma kararının güvenilirliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Saflaştırılmış bakteriyel fraksiyonlardan elde edilen daha temiz mekanistik verilere dayanarak, aday bileşiklerin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Mikroakışkan tasarım, akustoforetik parametre optimizasyonu ve aptamer-boncuk konjugasyon protokollerinde uzmanlık gerektirir.
- Piezoelektrik transdüserlere, fonksiyon jeneratörlerine, güç amplifikatörlerine ve yüksek hızlı görüntüleme kapasitesine sahip floresan mikroskopiye bağımlıdır.
- Tampon çözelti koşullarının, akış hızlarının (2 kPa örnek, 4 kPa tampon) ve PZT voltaj kalibrasyonunun kullanıcılar arasında standardize edilmesini gerektirir.
- Farklı bakteri türlerine veya örnek matrislerine adaptasyon, aptamer seçiminin ve akustik rezonans frekansının yeniden optimize edilmesini gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, aşırı siyanoakrilat kullanımı durumunda akustik alan homojenliğini etkileyen yapıştırıcı kaynaklı kanal tırtıklanmaları yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
