Name: Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Öğrenin, tavuk retina hücre kültüründe Fura-2 AM ile kalsiyum görüntüleme yöntemini kullanarak nöron ve glia hücrelerinin potasyum klorür ve ATP uyaranlarına verdiği farklı yanıtları nasıl izleyeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hibeler, sponsorlar ve finansman kaynakları: MH, doktora CNPq bursu sahibidir. HRF, CNPq tarafından desteklenen bir doktora sonrası burs alıcısıdır (HRF hibe numarası 152071/2020-2). RAMR, CNPq ve FAPERJ (hibe numaraları E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 ve 312157/2016-9 ve INCT-INNT (Ulusal Translasyonel Sinirbilim Enstitüsü) tarafından desteklenmektedir.

Hayvanları içeren tüm deneyler, Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin "Laboratuvar Hayvanları Bakımı İlkeleri" (NIH, Bethesda, ABD) kurallarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir; döllenmiş Beyaz Leghorn tavuk yumurtası için IBCCF-035 izin numarası.
1. Çözeltilerin hazırlanması
<ol><li>Krebs çözeltisini hazırlayın: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 6 mM glikoz, 10 mM HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).</li>
	<li>Tuzlu tampon hazırlayın (Ca2+ ve Mg2+ içermeyen çözelti - CMF): 76.55 g/L NaCl, 3.05 g/L KCl, 1.65 g/L Na2HPO4, 0.610 g/L KH2PO4, 21.95 g/L glikoz ve 7.90 g/L NaHCO3.</li>
	<li>Kuluçka çözeltisi hazırlayın (Krebs çözeltisinde Fura-2 ile:) 5 μM Fura-2-asetoksimetil ester (Fura-2),% 0.1 yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (BSA) ve% 0.02 Poloxamer 407.</li>
	<li>Karışık popülasyon veya glia kültürü için, DMEM / F12'yi% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve ortam olarak 40 mg / L gentamisin ile hazırlayın.</li>
	<li>Nöron ile zenginleştirilmiş kültür için,% 1 FCS, nöronal hücre kültürü takviyesi, 40 mg / L ve gentamisin ile DMEM / F12'yi ortam olarak hazırlayın.</li>
</ol>2. Retina diseksiyonu ve hücre kültürü hazırlama
<ol><li>Hava hücresinin bulunduğu 8 günlük civciv embriyosu (E8) yumurtasını açın.</li>
	<li>Yumurta içeriğini bir Petri kabına çıkarın ve bir çift cımbızla kafasını keserek embriyo ötenazisine devam edin.</li>
	<li>Kafayı temiz bir Petri kabına getirin ve yıkamak için biraz kalsiyum ve magnezyum içermeyen çözelti (CMF) dökün.</li>
	<li>Gözleri çıkarın, süreçte zarar vermemeye özen gösterin. NOT: Göz boşluğundan çıkarmadan önce göz katmanlarını kesmekten veya parçalamaktan kaçının.</li>
	<li>Gözleri CMF içeren temiz bir Petri kabına getirin.</li>
	<li>Lensi çıkararak göz diseksiyonuna başlayın.</li>
	<li>Lensin bıraktığı delikten başlayarak gözde 3 veya 4 uzunlamasına kesik yapın. Cımbızı çekerek, göz sklerasını zıt yönlerde tutarak kesikler yapın.</li>
	<li>Şeffaf vitreus gövdesini dikkatle çıkarın, retinanın ona bağlı olmadığından emin olun.</li>
	<li>Retinayı pigmentli epitelden ayırın ve kalan dokuları çıkarın.</li>
	<li>Berrak retinayı küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Retinayı başka bir alıcıya aktarın ve CMF'yi çıkarmak için kısaca santrifüj yapın (1 dakika boyunca ~ 1.800 x g).</li>
	<li>Retinayı 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe ederek 1 mL% 0.25 tripsin ile enzimatik olarak ayırın.</li>
	<li>% 10 FCS içeren 1 mL ortam ekleyerek reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>Retinayı 2 veya 3 kez ortamla yıkayın. Yıkama, ortam ekleme ve santrifüjleme ile çıkarma döngülerinden oluşur (1 dakika boyunca ~ 1.800 x g).</li>
	<li>Retina başına 2 mL tam ortam ekleyin ve retinayı yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça mekanik olarak ayırın. NOT: Burada, araştırmacılar hangi kültür türünün hazırlanacağını seçebilirler. Zenginleştirilmiş bir nöronal kültür için, DMEM-F12 + nöronal takviye +% 1 FCS + antibiyotik kullanın. Karışık popülasyon veya saflaştırılmış glia için DMEM-F12 +% 10 FCS + antibiyotik kullanın.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve istenen yoğunluğa kadar seyreltin. NOT: İdeal olarak, bu ~ 2 x 106 hücre veya daha az hücreli düşük yoğunluklu bir kültür olmalıdır.</li>
	<li>Her bir kapak kaymasına 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
	<li>Kapak kayması tedavisi<ol>
<li>37 °C'de sterilize edilmiş arıtılmış suda 10-50 μg/mL poli-L-lizin 1 mL'de en az 1 saat (ideal olarak gece boyunca) inkübe edin.</li>
		<li>Poli-L-lizin çözeltisini çıkarın ve kapak kapaklarını sterilize edilmiş arıtılmış suyla 2-3 kez yıkayın.</li>
		<li>UV ışıkları açıkken bir güvenlik kabininde kapakların kurumasına izin verin. Bu noktada, bunları 4 ° C'de kapalı bir kapta 1 aya kadar saklayın.</li>
		<li>İsteğe bağlı adım: Nöron ile zenginleştirilmiş kültürler için, PBS'de 50 μL 10-20 ng / mL laminin veya 37 ° C'de 2 saat boyunca her bir kapak kaymasına orta derecede ekleyin. Kuluçkadan sonra, laminin çözeltisi fazlalığını çıkarın ve kapak kayması kullanıma hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri cama yapışana kadar %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de inkübe edin. Bu yaklaşık 1-2 saat sürmelidir.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa 1 mL tam ortam ekleyin ve plakayı deney gününe kadar inkübatöre geri koyun. Gerekirse, ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.</li>
</ol>3. Fura-2 ile hücrelerin yüklenmesi
<ol><li>50 μL DMSO ile 50 μg'lık bir Fura-2 şişesini yeniden oluşturun.</li>
	<li>Çalışan Fura-2 çözeltisini hazırlamak için, DMSO'da 3 μL% 10 Poloxamer 407, 7.5 μL Fura-2 ve Krebs çözeltisi q.s.p.'yi 1.5 mL'ye ekleyin.</li>
	<li>Karışımı bir su banyosunda 7 dakika boyunca sonikleştirin.</li>
	<li>Fura-2'de inkübe etmeden önce kapak fişini Krebs çözeltisi ile hücre kültürü 3x ile yıkayın.</li>
	<li>37 °C'de ve 30 dakika boyunca %5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, 3x tekrar yıkayın ve Krebs içeren ve ışıktan korunan başka bir alıcıya aktarın. NOT: Çalışma Fura-2 çözümü, ışıktan korunursa 24 saat boyunca sabit kalır.</li>
</ol>4. Hücrelerin kalsiyum görüntülemesi
<ol><li>Her çalıştırmadan önce, deney sırasında sızıntıyı önlemek için kapak kaydırma desteğine ve haznesine silikon ekleyin.</li>
	<li>Mikroskop merceğinde tuz kristalleşmesini önlemek için kapak kapağının altını damıtılmış suyla yıkayın.</li>
	<li>Kapak fişini desteğin üzerine koyun, kenarlıklara hafifçe bastırın.</li>
	<li>Destek ve odacığı mikroskopa takın ve hücreleri Krebs çözeltisi ile perfüzyona başlayın. NOT: Tek hücreli kalsiyum görüntüleme deneyleri sırasında hücre perfüzyonu 0,5 mL/dak akış hızına kalibre edilir ve platform çözeltisinin tamamen değiştirilmesi 8-10 s sürer.</li>
	<li>Hücrelere bir göz atın ve uygun bir görüş alanı seçin.</li>
	<li>Hücre gövdelerini farklı morfolojilerine göre manuel olarak seçin.</li>
	<li>Herhangi bir uyaran uygulamadan önce, temel stabilizasyonu bekleyin. Her uyaran yaklaşık 30 saniye sürmelidir. NOT: Her deneyden hemen önce tüm çözümleri hazırlayın.</li>
	<li>340 ve 380 nm'de alternatif uyarılmayı (750 milisaniye) takiben 510 nm'de yayılan floresan oranını ölçerek [Ca2+]i'deki varyasyonları değerlendirin.</li>
	<li>Bir floresan analiz yazılımı kullanarak elde edilen değerleri işlemek.</li>
	<li>Deneysel sonuçları, her satırın tek bir hücreyi ve her satırın bir zaman noktasını temsil ettiği bir tabloda ifade edin.</li>
</ol>5. Veri işleme
<ol><li>Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak, tekil hücrelerin Fura-2 floresan oranı değerlerinin varyasyonunu ayrı ayrı veya hepsinin aynı anda çizin.</li>
	<li>Belirlenen uyarana reaktif hücrelerin sayısını ölçmek için, kalsiyum bazal seviyelerinde %30'luk bir artış artışı ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes%3A+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new%2C+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%3A+From+Basic+to+Bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li>
<li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li>
<li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li>
<li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem%2Fprogenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
<li>Ribeiro-Resende, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+GD3+synthase+display+morphological+abnormalities+in+the+sciatic+nerve+and+neuronal+disturbances+during+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration.</a> PLoS One. 9 (10), 108919(2014).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+type+1+cannabinoid+receptor+%28CB1R%29+promotes+neurogenesis+in+murine+subventricular+zone+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures.</a> PLoS One. 8 (5), 63529(2013).</li>
<li>Kubrusly, R. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-glial+cannabinoid+receptors+modulate+signaling+in+the+embryonic+avian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina.</a> Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).</li>
<li>Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+Receptors+Amplify+CNS+Damage+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li>
<li>Faroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+mediated+by+P2X7+receptors+controls+myelination+in+sciatic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).</li>
<li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+Induce+Cell+Death+and+Promote+P2X7+Receptor+Signaling+in+Retinal+Glial+Progenitors+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture.</a> Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).</li>
<li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-Induced+Calcium+Shifts+in+Chick+Retinal+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells.</a> PLoS One. 11 (4), 0153677(2016).</li>
<li>Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+receptors+for+glutamate+and+GABA+in+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons.</a> Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).</li>
<li>Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+coupling+of+NMDA+receptor+with+ip3+production+in+cultured+cells+of+the+avian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina.</a> Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).</li>
<li>López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+amino+acid-induced+phosphoinositide+hydrolysis+in+M%C3%BCller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia.</a> Glia. 9 (2), 127-135 (1993).</li>
<li>Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dopamine+research+in+retina+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods of dopamine research in retina cells.</a> Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).</li>
<li>Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+P2X7+Receptor%3A+Involvement+in+Neuronal+Physiology+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).</li>
<li>Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+P2X7+Receptors+Revisited%3A+Do+They+Really+Exist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).</li>
<li>Schitine, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+of+GAT-3+in+avian+M%C3%BCller+cells+is+regulated+by+neurons+via+a+glutamatergic+input%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input.</a> Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).</li>
<li>Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+potentiates+the+release+of+GABA+mediated+by+NMDA+receptor+activation%3A+Involvement+of+A1+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors.</a> Neuroscience. 281, 208-215 (2014).</li>
<li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li>
<li>Passos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Serotonergic+System+by+Kainate+in+the+Avian+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience.+9%2C+499%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Retina dokusunu, KCl veya ATP'nin aracılık ettiği kalsiyum yanıtlarının sırasıyla nöronal ve glial yanıtlara açıkça bölümlere ayrıldığını göstermek için kullandık (Şekil 1). Literatürdeki bazı veriler, P2X7 reseptörlerinin nöronal aktiviteyi ve sinaptik nörotransmitter salınımını20 düzenleyen nöronlarda eksprese edildiğini ima etse de, diğer yazarlar nöronal P2X7 reseptörlerinin varlığını sorgulamaktadır. Gerçekten de, mevcut sonuçlar, primer glial P2X7 reseptörlerini...

Kalsiyumun ikinci bir haberci olarak evrensel özellikleri nedeniyle, bu iyon çok sayıda sinyal aktivitesinde rol oynar: gen transkripsiyonu, doğum ve ölüm, çoğalma, göç ve farklılaşma, sinaptik iletim ve plastisite. Bu nedenle, kalsiyum aktivasyon dinamiklerini sadakat ve çeviklikle izleyebilen bir yöntem, benzersiz mekansal-zamansal tepkileri gözlemlemenin bir yolunu sağlayacaktır. Böyle bir yöntem, kalsiyum kaymalarını fonksiyonel verileri, farklı yanıtlarına göre spesifik hücre fenotipleriyle ilişkilendiren hücresel kalsiyum görüntüleme tekniğidir.
Ca2+ probları ilk olarak 1980'lerde geliştirildi ve daha sonraki iyileştirmeler bu moleküllerin canlı hücre tahlillerinde kullanılmasına izin verdi1. Kimyasal bir gösterge olarak, Fura-2 kantitatif [Ca2+]i ölçümleri için standart olarak kabul edilir. Bu göstergenin asetoksimetil (AM) esteri (yani, Fura-2 AM) hücre zarına kolayca nüfuz eder ve inkübasyon seyreltmesinden 20 kat daha büyük hücre içi konsantrasyonlara ulaşabilir (örneğin, [5 μM]o / [100 μM]i). Fura-2'nin bir diğer avantajı, iyi fotobeyazlatma direncine sahip olmasıdır; Bu nedenle, bu göstergenin daha uzun süre görüntülenmesi, floresan yeteneklerini büyük ölçüde etkilemeyecektir. Son olarak, Fura-2, ~ 100 nM'den ~ 100 μM'ye kadar çok çeşitli kalsiyum seviyelerine duyarlıdır ve dinlenme [Ca2 +] i2 ile karşılaştırılabilir olan ~ 145 nM'lik bir Kd'ye sahiptir. Daha sonra, boya yüklemesinden etkilenmeyen oranmetrik problarla birlikte daha iyi floresan mikroskoplar ve hesaplama yöntemleri ile hücre kalsiyum görüntüleme geliştirilmiştir.
Her hücre, nihai cevaba belirli bir imza olarak katkıda bulunan farklı kalsiyum cihazlarını (pompalar, taşıyıcılar, reseptörler ve kanallar) ifade eder. Önemli ipucu, fenotipik ifadeleriyle ilişkili farklı hücre tiplerinin seçici yanıtlarını bulmaktır. Buna göre, kalsiyum kaymaları yoluyla çalışan en az iki farklı reseptör vardır: Ca2 + 'ya hızlı modda nüfuz eden iyonotropik reseptörler ve sinyal yolaklarına ve inositol trifosfat ve siklik ADP-riboz3 gibi ikinci haberciler tarafından aktive edilen Ca2 + 'yı serbest bırakan hücre içi stoklara bağlı yavaş metabotropik reseptörler.
Örneğin, progenitör hücreler olgunlaşmamış retinada nestin eksprese eder ve GABA (veya mussimol) tarafından depolarize edilen GABAA reseptörlerini gösterir4. Bu, yüksek hücre içi Cl− seviyelerine sahip Cl-elektrokimyasal gradyanı nedeniyle olur; Doku geliştikçe, KCC2 taşıyıcıları progenitörler üzerinde uyarılmadan olgun GABAerjik nöronlar üzerinde inhibisyona geçer5. Öte yandan, doğum sonrası kemirgenlerin olgunlaşmamış subventriküler bölgesinde (SVZ) sox-2 eksprese eden kök hücreler de yavaş bir şekilde Ca2 + 'yı artıran histamin tarafından aktive edilen metabotropik H1 reseptörleri sunar6. Proteaz ile aktive edilmiş reseptör-1 (PAR-1) ailesinden ikinci bir metabotropik reseptör, trombin ve aşağı akış tarafından G (q / 11) ve fosfolipaz C'ye (PLC) aktive edilir, multipotent SVZ nöral kök hücrelerinden üretilen oligodendrositlerde (O4 ve PLP'yi eksprese eden) yavaş Ca2 + kaymaları verir7.
Genel olarak, nöronlar voltaja bağımlı kalsiyum kanallarının yanı sıra glutamaterjik (AMPA, NMDA, kainat) ve periferik ve merkezi nikotinik reseptörler olarak Ca2 + 'ya geçirgen olan majör nörotransmitter reseptörlerini eksprese eder. Potasyum klorür genellikle subventriküler bölge9 veya retina10'dan itibaren dorsal kök ganglion nöronları8 veya merkezi nöronlar olarak periferik nöronları aktive etmek için depolarizan bir ajan olarak kullanılır. Öte yandan, ATP, seçici Ca2 + geçirgen P2X üyelerini P2X7 ve P2X4 olarak aktive eden ana gliotransmitter (D-serine ek olarak) olarak kabul edilmektedir. Her iki reseptör de, vericiler tarafından aktive edilen en büyük Ca2+ akımları olarak kabul edilen NMDA reseptörleri tarafından gösterilenlere benzer şekilde eşdeğer Ca2+ akımları sunar11. P2X7 reseptörleri mikroglia üzerinde yüksek oranda eksprese edilir, ancak astrositler ve oligodendrositler üzerinde daha düşük bir yoğunlukta, proinflamatuar sitokinlerin salınımında rol oynar12. P2X7 reseptörleri ayrıca retinadaki Schwann hücreleri13 ve Müller glia üzerinde de eksprese edilir14,15.
Retinanın beyinde görülen hemen hemen tüm vericileri gösterdiği bilinmektedir. Örneğin, dikey eksen (fotoreseptörler, bipolar ve retinal ganglion hücreleri) esas olarak glutamaterjiktir, kalsiyum geçirgen AMPA veya kainat reseptörleri OFF-bipolar hücrelerde eksprese edilir ve mgluR6 ON-bipolar hücrelerde eksprese edilir16. İlginçtir ki, her üç reseptör de kalsiyum ve inositol trifosfat yolaklarına bağlı olan Müller glia'da da bulunur17,18. Yatay ve amakrin hücreler tarafından yapılan yatay inhibitör eksen, sadece GABA'yı değil, aynı zamanda dopamin, asetilkolin ve diğer klasik nörotransmiterleri de salgılar. Amakrin hücreler, kuş retina kültürlerinde bulunan ve glutamaterjik, pürinerjik, nikotinik ve voltaja bağımlı kalsiyum kanalları gibi çeşitli kalsiyum ile çalışan kanallar gösteren ana hücre tipleridir. Bu nedenle, bu, nöronlar ve glia arasındaki kalsiyum kaymalarının farklı özelliklerini değerlendirmek için mükemmel bir modeldir.
Bu nedenle, gelişim sırasında seçici fenotipik belirteçlere özetlenen farklı reseptörlerin ve kanalların farklı agonist yanıt paternleri ile kombinasyonu, seçici sinyal cihazları aracılığıyla çalışan gövde, progenit, nöron, astrosit, oligodendrosit ve mikroglia'da benzersiz imzalara izin verir.

<table><tbody><tr><td>15 mm lamel</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>111550</td><td>Hücre desteği</td></tr><tr><td>510 nm uzun geçiren filtre</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Takviyesi</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP dijital kamera</td><td>Roper Scientific, Trenton, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Neon</td><td>1466</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12</td><td>Gibco</td><td>12400-24</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Excel Yazılımı</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Supplement</td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Axiovert 200; Carl Zeiss</td><td>B 40-080</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2</td><td>Moleküler Problar</td><td>F1221</td><td>Oranlı Ca 2 + göstergesi</td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Calbiochem</td><td>1405-41-0</td><td>antibiyotikler</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 aparatı</td><td>Sutter Aleti, Novato, CA</td><td>DG-4PLUS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Hücre yapışmasına yardımcı olun</td></tr><tr><td>Metafluor yazılımı</td><td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>129</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Isofar</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Vetec</td><td>306</td><td></td></tr><tr><td>PH3 platformu</td><td>Warner Intruments, Hamden, CT</td><td>64-0286</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Moleküler Problar</td><td>P6866</td><td>noniyonik, yüzey aktif madde</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Hücre yapışmasına yardımcı olun</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA % 0.25</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Ayrışma enzimi</td></tr></tbody></table>

kalsiyum görüntüleme tekniği ile nöron-glia devresindeki değişimlerin görselleştirilmesi

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Burada, kalsiyum kaymaları açısından dinamik olarak incelenen glia (astrositler, oligodendrositler ve mikroglia) ve / veya periferik (dorsal kök ganglionları) ve merkezi dokulardan (korteks, subventriküler zon, organoid) nöronlara dayanan devrelerin seçici in vitro modelleri hakkında rapor verdik. Sonuçları göstermek için seçilen model, karmaşık hücresel etkileşimlere sahip basit bir doku olan retinadır. Kalsiyum, önemli hücresel rollerin çoğunda yer alan evrensel bir habercidir. Kültürdeki retinal nöron-glial hücrelerin kalsiyum kaymalarını öngörerek nasıl hazırlanabileceğini ve değerlendirilebileceğini adım adım bir protokolle açıklıyoruz. Bu modelde, nöronları KCl ve ATP'ye seçici tepkilerine dayanarak glia'dan ayırıyoruz. Kalsiyum geçirgen reseptörleri ve kanalları seçici olarak farklı bölmelerde eksprese edilir. Kalsiyum yanıtlarını analiz etmek için, Fura-2 gibi oranmetrik floresan kalıpları kullanıyoruz. Bu prob, Ca2 + serbest ve Ca2 + 'ya bağlı formlara dayanarak serbest Ca2 + konsantrasyonunu ölçer ve iki dalga boyunda algılanan floresan yoğunluğuna dayanan iki farklı tepe noktası sunar.

Burada, nöronların ve glia'nın kalsiyum kaymaları açısından nasıl sinyal verdiğini araştırmak için embriyonik gün 8 civcivlerinden kültürdeki retina hücrelerini kullandık. Kültürler esas olarak tarif edildiği gibi15,19 olarak karışık nöron-glial hücreler (≥ 1 x 106 hücre / çanak yoğunluğunda) in vitro olarak 7 günlük bir aşamada hazırlandı (Şekil 1A). Alternatif olarak, düşük yoğunlukta (5 x 105 hücre / çanak) h...

Hücre kalsiyum görüntüleme, benzersiz fonksiyonel imzalar veren kalsiyum geçirgen kanalların / reseptörlerin ekspresyonuna dayanarak, bireysel hücrelerin, kültürdeki karışık popülasyonların ve hatta uyanmış hayvanların dinamik sinyalizasyonunu incelemek için çok yönlü bir metodolojidir.

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Bu prosedürün genel amacı, potasyum klorür veya ATP uyaranlarına dayalı nöronal veya glia yanıtlarını ayırt etmek için canlı hücrelerdeki sitozolik kalsiyum konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemektir. Kalsiyum, nörotransmisyon, plastisite ve apoptoz dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerde yer alan önemli bir ikinci habercidir. Daha iyi floresan mikroskopların ve hesaplama yöntemlerinin geliştirilmesiyle ilişkili olan Fura-2 gibi yüksek seçici floresan kalsiyum boyasının ortaya çıkışı, canlı hücreler ve organizmalar üzerindeki görüntü kalsiyum sinyallemesine yüksek derecede uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlüklü optik veriler sağlamıştır.Bu protokol zenginleştirilmiş nöron, saflaştırılmış glia veya karışık popülasyon kültürlerine uyarlanabilir. Hangi hücre tiplerinin potasyum klorür ve ATP'ye diferansiyel tepkiye dayanarak uyaranları belirlemeye yanıt verdiğini izler. Potasyum klorür hücrenin membran potansiyelini değiştirir.Ve bu, esas olarak nöronlar tarafından ifade edilen voltaj kapılı kalsiyum kanallarını açar. Öte yandan, ATP, esas olarak glial hücrelerde bulunan P2X7 büyük parça kanalını aktive eder. Potasyum klorür ve ATP uyaranlarını diğer ilaçlarla birleştirerek, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artmasına bağlı olarak sinir sisteminin hangi bölmesinin bunlara yanıt verdiğini görmek mümkündür.Bu prosedür için bazı cerrahi aletlere veya cımbızlara ihtiyacınız olacak. Bir biyogüvenlik kabini kullanın ve kontaminasyonu önlemek için en iyi uygulamaları gerçekleştirin. Tavuk retina kültürünü başlatmak için, hava hücresinin bulunduğu alttan döllenmiş bir yumurtayı dikkatlice açın.İçeriği bir Petri kabına çıkarın ve bir çift cımbızla kafasını keserek embriyo donasyonuna devam edin. Kafa çıkarıldıktan sonra, temiz bir Petri kabına getirin ve ona biraz kalsiyum ve magnezyum içermeyen çözelti ekleyin. Daha sonra, bu süreçte onlara zarar vermemeye özen göstererek gözleri çıkarın.Gözü CMF çözeltisi içeren başka bir Petri kabına getirin. Bir çift cımbızla, lensi çıkararak gözü parçalamaya başlayın. Daha sonra, lensin bıraktığı delikten başlayarak, gözde üç veya dört uzunlamasına kesik yapın.Şeffaf vitreus gövdesini dikkatli bir şekilde çıkarın. Retinanın ona bağlı olmadığından emin olun. Daha sonra, retinayı pigmentli epitelden yavaşça ayırın.Kalan epitel dokusunu çıkarın. Retina tamamen berrak olduğunda, küçük parçalar halinde kesin. Otomatik pipet yardımıyla tüm retina dokusunu alın.Tüm CMF'yi çıkarmak için retinayı kısaca santrifüj edin. 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin. Ve dokuyu 10 dakika boyunca 37 C'de inkübe edin.%10 fetal buzağı serumu içeren 1 mL ortam ekleyerek tripsin reaksiyonunu durdurun. Tüm tripsini çıkarmak için retinayı santrifüj edin. Hücreleri% 10 FCS içeren bir ortamla iki veya üç kez yıkayın.Daha sonra, retina başına 2 mL orta ekleyin ve yavaşça mekanik olarak ayırın. Hücreleri seyreltin, böylece bir hemositometre ile düzgün bir şekilde sayabilirsiniz. Hücre yapışmasına yardımcı olmak için poli-L-lizin ve laminin ile korunan 15 mm'lik kapak kapakları kullanın.Her bir kapak kapağında seyreltilmiş hücrelerinizin 50 L'lik pipeti. Hücreleri% 5 CO2 atmosferinde 37 C'de inkübe edin. Ve camı takmak için onları soğutun.Bu yaklaşık bir ila iki saat sürmelidir. 1 mL ortam ekleyin ve deney gününe kadar inkübatöre geri koyun. Gerekirse, ortamın yarısını her iki ila üç günde bir değiştirin.50 L DMSO ile 50 g'lık bir Fura-2 şişesini yeniden oluşturun. Krebs çözeltisi, deney sırasında hücreleri aktarmak için iyi bir seçenektir, çünkü floresan ölçümüne müdahale etmez. Başlamadan önce çözeltiyi önceden 37'ye ısıtın.Poloxamer 407'yi ekleyin. Fura-2 ve DMSO ekleyin. Bir su banyosunda yedi dakika boyunca sonikleştirin.Üç kuyucuğa Krebs çözeltisi ve bir başkasında çalışan Fura-2 çözeltisi ekleyerek 6 delikli bir plaka hazırlayın. Fura-2 kuyusuna eklemeden önce hücrelerinizi içeren kapak kapağını üç kez yıkayın. Hücreleri karanlık bir inkübatörde 30 dakika boyunca 37 C ve% 5 CO2 atmosferinde inkübe edin.Kuluçkadan sonra, üç kez tekrar yıkayın. Krebs içeren başka bir alıcıya aktarın ve ışıktan koruyun. Hazırlanan Fura-2'yi, hücrelerle daha fazla örtü slipini inkübe etmek için yeniden kullanmak mümkündür.Çözelti sızıntısını önlemek için her çalıştırmadan önce kapak kaydırma desteğine ve haznesine silikon ekleyin. Krebs çözeltisinden kapak kapağını çıkarın ve mikroskop merceğinde tuz kristalleşmesini önlemek için tabanı damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın. Kapak fişini desteğin üzerine koyun, kenarlıklara dikkatle bastırın.Kapak kaydırma desteğini ve odacığı mikroskopa takın ve hücreleri Krebs çözeltisi ile perfüze etmeye başlayın. Uygun hücreleri seçin ve iyi bir alan seçin. Farklı morfolojilerine göre hücre gövdelerini seçerek ilgilenilen bölgeleri manuel olarak belirleyin.Kalsiyum konsantrasyonunun varyasyonları, 340 ve 380 nm'de alternatif uyarılmayı takiben 510 nm'de yayılan floresan oranını ölçerek değerlendirildi. Potasyum klorür eklendikten sonra, birçok hücrenin parladığını ve floresan tepkisinin grafikte yükseldiğini görmek mümkündür. Potasyum klorür, esas olarak nöronlarda bulunan voltaj kapılı kalsiyum kanallarını açar.Grafikteki her bir çizgi, benzersiz ilgi alanını temsil eder. Bu nedenle, deney sırasında bireysel hücre tepkilerini izlemek mümkündür. ATP uyaranları, esas olarak glial hücreler tarafından eksprese edilen P2X7 reseptörünü açar.Bu zenginleştirilmiş bir nöron kültürüdür. Bu nedenle, burada birkaç glial hücre vardır. Bu kadar az hücrenin ATP uyaranlarına yanıt vermesinin nedeni budur.Elde edilen değerler Metafluor yazılımı kullanılarak işlendi. Deneysel sonuçlar, her satırın tek bir hücreyi ve her satırın bir zaman noktasını temsil ettiği bir Excel tablosunda ifade edilir. Excel yazılımını kullanarak, tek tek hücrelerin kalsiyum varyasyonlarını ayrı ayrı veya hepsinin aynı grafikte çizmek mümkündür.Herhangi bir uyarana reaktif hücrelerin miktarını ölçmek için,% 30'luk bir artış kalsiyum bazal seviyelerini artırın. Burada, 50 mm potasyum klorür ve 1 mm ATP uyaranları aldıktan sonra, nöronların ve glia'nın kalsiyum kaymaları açısından nasıl sinyal verdiğini araştırmak için embriyonik gün 8 civcivlerinden kültürdeki retina hücrelerini kullanıyoruz. Her deneyde, yaklaşık 100 hücre kolayca analiz edildi.Şekil A, bir hafta boyunca muhafaza edilen hem nöronları hem de glia'yı içeren karışık bir kültürü temsil eder. Yanıtları ölçtüğümüzde, analiz edilen hücrelerin yaklaşık yarısının potasyum klorüre cevap verdiğini ve diğer yarısının ATP'ye cevap verdiğini görmek mümkündür. Şekil B, nöron bakımından zenginleştirilmiş bir kültürü ifade eder.Sadece üç gün boyunca inkübe edildi, bu nedenle çoğu glial hücre henüz farklılaşmadı. Bu durumda, hücrelerin% 89'u potasyum klorüre cevap verir ve nöronların prevalansını güçlendirir. Şekil C, saflaştırılmış bir glia kültürünü göstermektedir.Bu hücreler her üç günde bir orta değişikliklerle 10 gün boyunca muhafaza edildi. Bu süreden sonra çoğu nöron ölür ve sadece glia bırakır. Aslında, bu kültür yalnızca ATP tarafından aktive edildi.Bu metodoloji, kalsiyumun ikinci bir haberci olarak evrensel özellikleri nedeniyle yaygın olarak kullanılmıştır. Fenotipik analiz, bu metodolojiyi kalsiyum görüntülemeden sonra sabit hücrelerin immünokimyası ile tamamlayarak geliştirilebilir. Bu protokol, diğer kalsiyum kanallarını ifade eden diğer karışık hücre sistemlerine de uyarlanabilir.Önemli ipucu, fenotipik ifadeleriyle ilişkili farklı hücre tiplerinin seçici yanıtlarını bulmaktır.

visualizing-shifts-on-neuron-glia-circuit-with-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nöron ağları geliştirme spontan aktivite, kalsiyum duyarlı göstergesi boyalar AM ester formları kullanarak ölçülebilir. Nöronal aktivasyon gösteren hücre içi kalsiyum değişiklikler, bir veya iki foton görüntüleme göstergesi floresan geçici değişiklikler olarak algılanır. Bu protokol, gelişimsel bağımlı nöron ağları bir dizi için adapte...

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri...

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Biz yukarıda ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde çift optik pencerelerden nöronal aktivite ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi vivo içindekullanma.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Öğrenin, tavuk retina hücre kültüründe Fura-2 AM ile kalsiyum görüntüleme yöntemini kullanarak nöron ve glia hücrelerinin potasyum klorür ve ATP uyaranlarına verdiği farklı yanıtları nasıl izleyeceğinizi.

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet