Name: Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Keşfedin, 3D kanser hücre kürelerinde mitokondriyal enerji metabolizmasını Seahorse hücre dışı akı analizi ile inceleyin. Bu yöntem, tek küre düzeyinde hassas veri toplama sağlar ve ilaç keşfi için üstün fizyolojik bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.J.C, Sygnature Discovery Ltd ile BBSRC MIBTP CASE Award tarafından desteklenmiştir (BB/M01116X/1, 1940003)

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Ana bulgular ve çıktılar Bu makale, XFe96 XF Analyzer ile bir dizi kanser kaynaklı hücre hattı kullanarak tek 3D sferoidlerin mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Zorla toplama için hücre kovucu teknolojiler kullanılarak A549, HepG2 / C3A, MCF7 ve SK-OV-3 hücresel sferoidlerin hızlı bir şekilde yetiştirilmesi için bir yöntem geliştirilmiş ve tanımlanmıştır. Bu protokol, (1) küresel kültür protokollerinin optimizasyonu ve sferoidlerin orijinal kültürl...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Biyolojik araştırmalarda in vitro modellerdeki ilerlemeler son 20 yılda hızla ilerlemiştir. Bu tür modeller artık çip üzerinde organ modalitelerini, organoidleri ve 3D mikrodoku sferoidlerini içeriyor ve bunların hepsi in vitro ve in vivo çalışmalar arasındaki çeviriyi geliştirmek için ortak bir odak noktası haline geldi. Gelişmiş in vitro modellerin, özellikle de sferoidlerin kullanımı, doku mühendisliği, kök hücre araştırması, kanser ve hastalık biyolojisi 1,2,3,4,5,6,7 ve genetik toksikoloji 8,9,10, nanomalzemeler toksikolojisi 11 dahil olmak üzere güvenlik testleri dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarını kapsamaktadır. 12,13,14 ve ilaç güvenliği ve etkinliği testi8,15,16,17,18,19.
Normal hücre morfolojisi biyolojik fenotip ve aktivite için kritik öneme sahiptir. Hücreleri 3D mikrodoku sferoidlerine kültürlemek, hücrelerin in vivo olarak gözlemlenene daha çok benzeyen ancak klasik tek katmanlı hücre kültürü teknikleriyle yakalanması zor olan bir morfoloji, fenotipik fonksiyon ve mimari benimsemelerini sağlar. Hem in vivo hem de in vitro , hücresel fonksiyon, hücresel iletişim ve programlama ile sınırlı olmayan hücresel mikro çevreden doğrudan etkilenir (örneğin, hücre-hücre birleşme oluşumları, hücre nişleri oluşturma fırsatları); yakın çevrelerde hormonlara ve büyüme faktörlerine hücre maruziyeti (örneğin, enflamatuar yanıtın bir parçası olarak hücresel sitokin maruziyeti); fiziksel ve kimyasal matrislerin bileşimi (örneğin, hücrelerin sert doku kültürü plastiğinde mi yoksa elastik bir doku ortamında mı yetiştirildiği); ve en önemlisi, hücresel metabolizmanın beslenme ve oksijene erişimin yanı sıra laktik asit gibi metabolik atık ürünlerin işlenmesinden nasıl etkilendiği.
Metabolik akı analizi, tanımlanmış in vitro sistemlerdeki hücresel metabolizmayı incelemenin güçlü bir yoludur. Spesifik olarak, XF teknolojisi, bozulmamış hücrelerin ve dokuların hücresel biyoenerjetik özelliklerindeki canlı, gerçek zamanlı değişikliklerin analizine izin verir. Birçok hücre içi metabolik olayın saniyeler ila dakikalar arasında meydana geldiği göz önüne alındığında, gerçek zamanlı fonksiyonel yaklaşımlar, bozulmamış hücrelerde ve dokularda in vitro hücresel metabolik akıdaki gerçek zamanlı değişiklikleri anlamak için çok önemlidir.
Bu yazıda kanserden türetilmiş hücre hatları A549 (akciğer adenokarsinomu), HepG2/C3A (hepatosellüler karsinom), MCF-7 (meme adenokarsinomu) ve SK-OV-3 (over adenokarsinomu) hücre hatlarının in vitro 3D sferoid modeller kullanılarak zorla agregasyon yaklaşımları kullanılarak geliştirilmesi için protokoller sunulmaktadır (Şekil 1). Ayrıca, (i) Agilent XFe96 XF analizörü kullanılarak tek 3D sferoidlerin mitokondriyal enerji metabolizmasının nasıl araştırılacağını ayrıntılı olarak açıklar, (ii) tek 3D sferoidleri kullanarak XF analizlerini optimize etmenin yollarını vurgular ve (iii) bu yaklaşımı kullanarak 3D sferoid metabolizmasını araştırmanın önemli hususlarını ve sınırlamalarını tartışır. En önemlisi, bu makalede, hücresel sferoidlerde oksidatif fosforilasyonu ve dolayısıyla mitokondriyal fonksiyonu belirlemek için oksijen tüketim hızının (OCR) hesaplanmasına izin veren veri kümelerinin nasıl toplandığı açıklanmaktadır. Bu protokol için analiz edilmemiş olsa da, hücre dışı asitleşme hızı (ECAR), XF deneylerinde OCR verileriyle birlikte ölçülen başka bir parametredir. Bununla birlikte, ECAR genellikle XF veri kümelerinden kötü veya yanlış yorumlanır. Teknoloji üreticisinin temel yaklaşımlarını izleyerek ECAR'ı hesaplamanın sınırlamaları hakkında bir yorum sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td></td> <td>ECACCnbsp;#86012804</td><td>Akciğer karsinomu hücre hattı</td></tr><tr><td>Agilent Denizatı XF RPMI Ortamı, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>XF tahlil ortamı, fenol kırmızısı, sodyum bikarbonat, glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat içermeyen 1 mM HEPES ile</td></tr><tr><td>Agilent Denizatı XFe96 Hücre Dışı Akı Analizörü</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Tek sferoidlerde küresel oksijen alım oranlarını ölçmek için alet</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>A8674</td><td>Mitokondriyal solunum kompleksi III inhibitörü</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Mitokondriyal protnofor birleştirici</td></tr><tr><td></td><td>Floresan bazlı tahliller</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için siyah duvarlı mikroplaka Greiner Bio-One 655076CELLSTAR hücre itici yüzey 96 U kuyu mikroplakaları</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Sferoid oluşturmak için mikroplakalar</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>3D mikrodoku sferoidlerinde hücre canlılığının belirlenmesi için test</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems bir biyoteknoloji markası</td><td>3439-100-01</td><td>Kürelerin bağlanmasını kolaylaştırmak için XFe96 küresel mikroplakaları kaplamak için moleküler hücre yapıştırıcısı</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoz</td><td>Merck Yaşam Bilimleri</td><td>G8270</td><td>Hücre kültürü büyümesi ve XF tahlil ortamı için takviye</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>HepG2/C3A sferoidleri için kültür ortamı</td></tr><tr><td>EVOS XL Çekirdek Görüntüleme Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Faz kontrastlı görüntüleme mikroskobu</td></tr><tr><td>EZ-PCR Mikoplazma test kiti</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>20-700-20</td><td>Hücre kültürlerinde mikoplazma taraması</td></tr><tr><td>FIJI Sadece Görüntü J</td><td></td><td></td><td>Harmanlanmış görüntülerin analizi</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Hücre kültürü ortamı için takviye</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>#CRL-10741</td><td>Karaciğer karsinom hücre hattı, ana HepG2 hücre hattının klonal bir türevi</td></tr><tr><td>Laktat-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Sfeorid kültür ortamı</td></tr><tr><td>L-glutamin (200 mM çözeltisi)</td><td></td> içinde laktat ölçümü için test<td>G7513</td><td>Hücre kültürü büyümesi ve XF tahlil ortamı için takviye</td></tr><tr><td>M50 Stereo mikroskop</td><td>Leica Mikrostemleri</td><td>LEICAM50</td><td>Stereo diseksiyon mikroskobu; sfeorid kullanımı için kullanılır</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td> <td># 86012803</td><td>Meme adenokarsinomu hücre hattı</td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes</td> <td>Merck Life Science'dan</td> oligomisin <td>O4876</td><td>ATP Sentaz İnhibitörü</td></tr><tr><td>Penisisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Hücre kültürü ortamına eklenen antibiyotikler</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>Spehroidlerde dsDNA'nın analizi</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Mitokondriyal Solunum Kompleksi I İnhibitörü</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>A549, MCF7 ve SK-OV-3 için kültür ortamı sferoidler</td></tr><tr><td>Denizatı Analitiği</td><td>Agilent Teknolojileri A.Ş.</td><td>Yapı 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Küresel FluxPak</td><td>Agilent Teknolojileri A.Ş.</td><td>102905-100</td><td>Her Denizatı XFe96 Küresel FluxPak şunları içerir: 6 Denizatı XFe96 Küresel Mikroplakalar (102978-100), 6 XFe96 sensör kartuşu ve 1 şişe Denizatı XF Kalibrant Çözeltisi 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Serolojik pipet: 5, 10 ve 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>Hücre kültürü için sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACCnbsp</td><td>;#HTB-77</td><td>Yumurtalık adenokarsinomu hücre hattı</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat (100 mM çözelti)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Hücre kültürü büyümesi ve XF tahlil ortamı için takviye</td></tr><tr><td>T75 cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Hücre kültürlerinin bakımı için doku kültürü ile muamele edilmiş şişeler</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Hücre ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>Dalga kontrol yazılımı</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Geniş delikli</td><td>uç STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Küresel kullanım için geniş açıklıklı pipet uçları</td></tr></tbody></table>

hücre dışı akı analizi kullanarak tek 3d mikrodoku sferoidlerinin mitokondriyal enerji metabolizmasını keşfetmek

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Sferoidler olarak adlandırılan üç boyutlu (3D) hücresel agregalar, son yıllarda in vitro hücre kültürünün ön saflarında yer almaktadır. Hücreleri iki boyutlu, tek hücreli tek katmanlı (2D kültür) olarak kültürlemenin aksine, küresel hücre kültürü, hücre dışı matris proteinlerinin ekspresyonu, hücre sinyalizasyonu, gen ekspresyonu, protein üretimi, farklılaşma ve proliferasyon dahil olmak üzere in vivo olarak var olan fizyolojik hücresel mimariyi ve özellikleri teşvik eder, düzenler ve destekler. 3D kültürün önemi, onkoloji, diyabet, kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği dahil olmak üzere birçok araştırma alanında kabul edilmiştir. Son on yılda, sferoidler üretmek ve metabolik işlevlerini ve kaderlerini değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirilmiştir.
Hücre dışı akı (XF) analizörleri, bir XF24 adacık yakalama plakası veya bir XFe96 küresel mikroplaka kullanarak sferoidler gibi 3D mikro dokularda mitokondriyal fonksiyonu keşfetmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, farklı protokoller ve XF teknolojisini kullanarak sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasının araştırılmasının optimizasyonu ayrıntılı olarak tanımlanmamıştır. Bu yazıda, XFe96 XF analizörü ile küresel mikroplakalar kullanılarak tek bir 3D sferoidde mitokondriyal enerji metabolizmasının araştırılması için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır. Farklı kanser hücre hatları kullanarak, XF teknolojisinin sadece farklı boyutlarda değil, aynı zamanda farklı hacimlerde, hücre sayılarında, DNA içeriğinde ve tipinde 3D sferoidlerde hücresel solunum arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir.
Oligomisin, BAM15, rotenon ve antimisin A'nın optimal mitokondriyal efektör bileşik konsantrasyonları, 3D sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasının spesifik parametrelerini araştırmak için kullanılır. Bu yazıda ayrıca sferoidlerden elde edilen verileri normalleştirme yöntemleri tartışılmakta ve XF teknolojisini kullanarak küresel metabolizmayı keşfederken göz önünde bulundurulması gereken birçok husus ele alınmaktadır. Bu protokol, gelişmiş in vitro sferoid modellerde araştırma yapılmasına yardımcı olacaktır.

İyi biçimlendirilmiş, kompakt sferoidler elde etmek için, her hücre hattı tohumlama yoğunluğu ve ekim süresi için ayrı ayrı optimize edilmiştir (Şekil 3). A549, HepG2 / C3A ve SK-OV-3 hücre hatları başlangıçta, kültürde 7 gün sonrasına kadar açıkça tanımlanmış çevrelere sahip yuvarlak sferoidlere ilerlemeyen gevşek agregalar oluşturdu. Tersine, MCF-7 hücreleri 3 gün içinde sferoidler oluşturabilir. Tüm sferoid modeller için kültür periyodundan sonra ilk hücre tohumlama yoğunluğu ile küresel ...

Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Protokolümüz, araştırmacıların mitokondriyal enerji metabolizmasını ve dikişsiz sferoidleri araştırmalarına izin vererek, birkaç farklı hücre hattı, hücre sayısı ve fenotipler arasında karşılaştırmalar yapılmasına izin verir. Çalışmamız, hücre tek katmanlı deneylere kıyasla üstün fizyolojik model sağlayan 3D sferoidleri kullanarak mitokondriyal enerji metabolizmasını keşfetmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Biyolojik gözlemler, vitreus sferoidlerinden in vivo tümörlere ekstrapolasyon yapabilir ve sferoid tümör metabolizmasını hedef alabilecek yolları tanımlayabilir.Örneğin, sferoidlerin büyümesi sırasında karbonhidrat faydası. Tüm veriler denizatı hücre dışı akı 96 cihazı çok hassastır. In vitro sferoidlerin tahlil plakası içinde konumlandırılması, tek sferoid seviyesinde doğru veriler elde etmek için çok önemlidir.Bozulmamış küresel yapı, morfoloji ve numuneler arasında genel homojenlik sağlamak için 4x büyütmede faz kontrastına sahip ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak küresel canlılığı kontrol edin. Sensör kartuşunu nemlendirmek için, yaklaşık 20 mililitre kalibrantı konik bir tüpe alın. Kalibranı içeren konik tüpü gece boyunca karbondioksit olmayan 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.Tahlil kitinin içeriğini çıkarın. Sensör kartuşunu yardımcı plakanın yanına baş aşağı yerleştirin. Pipet Çok kanallı P300 pipet kullanarak yardımcı plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su.Sensör kartuşunu yardımcı plakanın üzerine yerleştirin. Her bir kuyucuktaki su seviyesinin sensör problarını suya batırmak için yeterince yüksek olup olmadığını kontrol edin. Monte edilmiş sensör kartuşunu karbondioksitsiz 37 santigrat derece inkübatöre aktarın ve gece boyunca bırakın.Küresel tahlil mikroplakasını kaplamak için, septik bir teknik kullanarak küresel mikroplakanın kuyusu başına mililitre başına 30 mikrolitre steril 0.1 miligram Poli-D-Lizin çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi küresel mikroplakanın her bir oluğundan aspire edin, plakayı ters çevirin ve herhangi bir artık çözeltiyi çıkarmak için doku kağıdına sıkıca dokunun. Plakanın her bir oluğunu 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su ile yıkayın.Son yıkamadan sonra, mikro plakayı ters çevirin ve kalan suyu çıkarmak için kağıt mendile sıkıca dokunun. Gelecekte kullanmadan önce plakanın 30 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin. XF RPMI ortamını makalede açıklandığı şekilde hazırlayın.Takviyeli XF RPMI tahlilini testten bir saat önce 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ve kaplanmış sferoid tahlil mikroplakasını karbondioksit olmayan 37 santigrat derece inkübatörde önceden ısıtın. Kalibrant ve sensör kartuşunu içeren konik tüpü hava inkübatöründen çıkarın.Sensör kartuşunu yardımcı plakadan çıkarın ve çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. P300 çok kanallı pipet kullanarak, suyu yardımcı plakadan aspire edin ve atın. Yardımcı plakanın her bir kuyucuğuna önceden ısıtılmış kalibrantın 200 mikrolitresini ekleyin.Sensör kartuşunu yardımcı plakaya yerleştirerek sensörlerin kalibrant içine iyice batırılmasını sağlayın. Monte edilmiş sensör kartuşunu, port enjeksiyon çözeltilerini yüklemeye hazır olana kadar karbondioksit olmayan, 37 santigrat derece inkübatöre aktarın. Küresel kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve sferoid transfer adımlarından önce bütünlüklerini sağlamak için sferoidleri mikroskop altında gözlemleyin.Herhangi bir arka plan düzeltme kuyusu da dahil olmak üzere küresel plakanın her bir kuyucuğuna 180 mikrolitre ön sıcak tahlil ortamı yükleyin. Yedi santimetrelik bir Petri kabını kısmen üç mililitre tahlil ortamı ile doldurun. Geniş delikli pipet uçlarıyla yüklü çok kanallı bir pipet kullanarak ve hacmi 10 ila 50 mikrolitreye ayarlanmış bir pipet kullanarak sferoidleri 96 kuyucuklu kültür plakasından Petri kabına aktarın.Geniş delikli pipet ucuyla donatılmış tek kanallı pipetleyicinin hacmini 20 mikrolitreye ayarlayın ve tek bir sferoidi dikkatlice aspire edin. Ucu doğrudan bu sferoid tahlil mikroplakasının her bir kuyucuğunun ortasına yerleştirin ve kılcal hareketin sferoidi pipet ucundan çekmesine izin verin. Pipetleyicinin içeriğini Petri kabına geri pipetleyerek mikroskop altında evrimi onaylayın.Tüm bu sferoidler sferoid tahlil mikroplakasına aktarıldıktan sonra, plakayı en az bir saat boyunca karbondioksitsiz 37 santigrat derece inkübatöre aktarın. Her bir bileşiğin çalışma stok konsantrasyonlarını, makalede açıklandığı gibi, tamamen desteklenmiş önceden ısıtılmış bir XF RPMI tahlil ortamı kullanarak hazırlayın. Her bileşiğin 20 mikrolitrelik çalışma çözeltisi, kalibre edilmiş bir P100 çok kanallı pipet kullanılarak ilgili tüm portlara dağıtıldı.Analizörü sensör kartuşunu yüklemek üzere hazırlayın. İyi biçimlendirilmiş kompakt sferoidler elde etmek için, her hücre hattı tohumlama yoğunluğu ve ekim süresi için ayrı ayrı optimize edilmiştir. Optimize edilmiş tohumlama stratejilerinde, SK-OV-3 için küresel hacim, küp küp yedi mikrometreye 5.46 x 10 civarında ve A549 için 1.45 x 10 ila sekiz mikrometre küp idi.Tüm sferoid tipleri, ilk tohumlama yoğunluğu ile küresel hacim arasında doğrusal bir korelasyona sahipti. Mükemmel küresel simetri 1.0'lık bir daireselliğe sahipti ve 1.0'dan sapma dairesellik kaybına işaret ediyordu. Tüm sferoid tipleri için, oksijen tüketim hızı sferoid boyutla artmıştır ve MCF-7 sferoidlerinde en yüksek ve SK-OV-3 sferoidlerinde en düşük olan sferoid hacimle doğrusal olarak korelasyon göstermiştir.MCF-7 sferoidleri, deney boyunca araç kontrolüne cevap vermedi. MCF-7 sferoidlerindeki oksijen tüketim hızı, mililitre başına 0.5 mikrogramlık ilk enjeksiyonu takiben beş ölçüm döngüsünden sonra oligomisin ile düşürüldü. BAM15'e yanıt olarak, ikinci enjeksiyondan önce oksijen tüketim oranı arttırıldı.Oysa Rotenon artı Antimisin A kombinasyonu onu düşürdü. Bazal mitokondriyal solunumu doğru bir şekilde araştırmak için bir protokol. ADP fosforilasyon solunum, Kaçak solunum, kuplaj verimliliği, maksimum solunum kapasitesi ve yedek solunum kapasitesi kanser kaynaklı 3D sferoidler kullanılarak geliştirilmiştir.Tüm solunum bileşikleri, seçilen bileşikler için beklenen kinetik oksijen tüketim hızı profillerini verdi ve kuyu başına dakikada ortalama 20 ila 30 pikomol oksijen oksijen sabit bazal solunum hızı ortaya çıkardı. Sferoidlerin mikroplaka içindeki yeri ve bileşik enjeksiyonu takiben ölçüm döngüsü numarası, solunum hızlarının bileşik ilaveler arasında sabit olmasını sağlar. Birleştiriciler ile mitokondriyal solunum kapasitesini araştırırken, sadece konsantrasyon anahtarı değil, aynı zamanda mitokondriyal enerji metabolizmasını araştıran deneylerde tipik olarak unkuplörden önce eklenen oligomisin varlığında solunumu ayırma kabiliyetidir.

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Bu protokol, pankreas kanseri hücrelerinin (Patu8902) ve aktive edilmiş pankreas fibroblastlarının (PS1) ko-kültüründen üretilen 3D sferoidler üzerinde iki ana enerji üreten yolağı, glikoliz ve mitokondriyal solunumu ölçmek için hücre dışı akı testi gerçekleştirme tekniğini açıklar.

3D sferoidlerde hücre dışı akı testi: pankreas tümör sferoidlerinin metabolik aktivitesini ölçmek için bir yöntem

Burada, pankreas kanseri hücreleri ve metabolik fonksiyonların bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm tarafından takip fibroblastlar, 3 boyutlu (3D) küresel ortak kültür hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır.

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

Keşfedin, 3D kanser hücre kürelerinde mitokondriyal enerji metabolizmasını Seahorse hücre dışı akı analizi ile inceleyin. Bu yöntem, tek küre düzeyinde hassas veri toplama sağlar ve ilaç keşfi için üstün fizyolojik bir model sunar.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Daha fazla video keşfet