Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği
17 Kasım 2023
Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.
Yeni protokolümüz, hayvan dokularında stabil mikrotübüller, kararsız mikrotübüller ve serbest tübüller gibi üç tüp halkası durumunu ayırt etmeye ve ölçmeye yardımcı olur. Bu teknik basit adımlardan oluşur ve translasyonel modifikasyon sonrası borunun nicelleştirilmesiyle tespit edilemeyen borunun yapısal stabilitesini değerlendirebilir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı ve kanserler gibi mikrotübül stabilitesinin kritik olduğu hastalıklar için terapötik yolların araştırılması ve geliştirilmesi için gereklidir.
Doku diseksiyonu için laboratuvar kıyafetini hazırlayarak prosedüre başlayın. Bir kutuyu kırılmış buzla doldurun ve üzerine iki Petri kabı yerleştirin. Diseke edilmiş dokuların geçici olarak yıkanması ve saklanması için bir kabı buz gibi soğuk fosfat tampon çözeltisi veya PBS ile doldurun.
İkinci tabağın üzerine PBS ile nemlendirilmiş filtre kağıdı koyun. Daha sonra, disseke doku depolaması için PBS ile doldurulmuş 1.5 mililitrelik mikrotüpleri tartın. Dokuları ötenazi yapılmış bir fareden çıkardıktan sonra, bunları tüplere aktarın ve her bir mikrotüpü yeniden tartın.
Dokuları buz gibi soğuk mikrotübül stabilize edici tampon veya MSB+ortam içeren bir cam homojenizatöre taşıyın ve soğutulmuş bir homojenizatör kullanarak dokuyu hemen homojenize edin. Şimdi doku homojenatını bir Pasteur pipeti kullanarak iki mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve iki santigrat derecede üç dakika boyunca 2.400 G'de santrifüjleyin. Kalıntıları temizlemek için süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrotüpe aktarın.
Süpernatanı veya S1 fraksiyonunu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrotüpte vorteksleyin. Hemen 200 mikrolitre S1 fraksiyonunu bir santrifüj mikrotüpüne pipetleyin ve iki santigrat derecede 20 dakika boyunca bir TLA-55 rotoru kullanarak 100.000 G'de santrifüjleyin. İkinci santrifüjlemeden sonra, S2 süpernatantını P2 çökeltisinden ayırın.
S2 fraksiyonunun tamamını hemen bir santrifüj mikrotüpüne aktarın ve iki santigrat derecede 60 dakika boyunca 500.000 G'de döndürmek için bir TLA-120.2 rotoru kullanın. Üçüncü santrifüjlemeden sonra, S3 süpernatantını P3 çökeltisinden ayırın. Tüm S3 fraksiyonunu 200 mikrolitre 2X sodyum dodesil sülfat veya SDS numune tamponunda çözün.
Kalan S1 fraksiyonlarını, batı lekeleme için standart bir eğri olarak kullanmak üzere eşit hacimde 2X SDS numune tamponu ile karıştırın. Ardından, P2 ve P3 fraksiyon tüplerine 400 mikrolitre SDS numune tamponu ekleyin. Ardından, numuneleri yeni 1.5 mililitrelik mikrotüplere aktarmadan ve bunları buz kutusuna yerleştirmeden önce çökeltiyi çözmek için çözeltiyi kısaca sonikleştirin.
Tüm numuneleri 100 santigrat derecede üç dakika kaynatın. P2 fraksiyonundaki mikrotübüller, bir fare beynindeki toplam alfa-tübülünün% 34.86'sını oluştururken, P3 ve S3 fraksiyonlarındakiler sırasıyla% 56.13 ve% 9.01'ini oluşturuyordu. P2, P3 ve S3 fraksiyonlarındaki beta-3 tübülin yüzdesi, alfa-tübülininkinden önemli ölçüde farklı değildi.
S2 fraksiyonu, 300 kilodaltonluk bir ultrafiltrasyon spin kolonundan tübülinin sınırlı geçişini gösterirken, S3 fraksiyonu, tübülin komplekslerinin tam geçişine izin verdi. Kromatografik ayırma, 100 kilodaltonluk bir S3 tubulin elüsyonu ile sonuçlandı. Her fraksiyonda eşit oranlarda alfa ve beta-tubulin geri kazanıldı.
P2 fraksiyonları asetillenmiş alfa-tübülin ile önemli ölçüde zenginleştirilirken, P3 fraksiyonunda tirozinli alfa-tübülin baskındı. Homojenizasyondan önce beynin dondurulması, P2 fraksiyonlarında alfa-tubulin konsantrasyonunun azalmasına neden oldu. Bununla birlikte, P3 fraksiyonunda alfa-tubulin artmıştır.
Dondurma ayrıca asetilasyon seviyelerini düşürdü ve P2 fraksiyonunda alfa-tubulinin tirozinasyon seviyelerini arttırdı. Nokodazol tedavisi, P2 fraksiyonunda alfa-tubulini azalttı. Donmanın aksine, nokodazol P2 tubulin translasyon sonrası modifikasyonları etkilemedi.
Beyin dokusu önemli ölçüde daha yüksek bir P2 tubulin konsantrasyonu sergilerken, P3 tübülinler proliferatif dokuda yoğunlaştı. Western blotlama, özellikle sinir sisteminde bulunan P2 tübülinin kararlı mikrotübüllerden kaynaklandığını ve P3 tübülinin kararsız mikrotübüllerden kaynaklandığını gösterdi. Mikrotübüllerin stabilitesi oldukça dinamiktir.
Bu protokolün hızlı bir şekilde, kesintisiz olarak, soğuk ortamda tamamlanması önemlidir. Ayrıca dokuların ve fraksiyonların SDS numune tamponunda çözülene kadar dondurulmadığından emin olun. Her bir fraksiyonu kullanarak immün sunumu proteomik ile birleştirmenin, mikrotübül dinamiğinde yer alan faktörleri tanımlaması beklenir.
Bu yöntemi kullanarak, mikrotübüllerde normal tau'nun nasıl var olduğunu ortaya çıkardık. Demansın yeni ilaç hedeflerini belirlemek için yaşlı beyinlerde nasıl anormal hale geldiğini incelemek için de kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, hayvan dokularındaki stabil mikrotübüllerin, labil mikrotübüllerin ve serbest tübulinin ayırt edilmesi ve miktarının belirlenmesi için yeni bir protokol sunmaktadır. Yöntem, Alzheimer ve kanser gibi hastalıkların anlaşılması için kritik öneme sahip olan mikrotübüllerin yapısal stabilitesini değerlendirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikrotübül Dinamiği
Arka Plan
- Mikrotübüller, ökaryotik hücrelerdeki hücre iskeletinin temel bileşenleridir.
- Hücresel fonksiyonları etkileyen dinamik bir instabilite sergilerler.
- Mikrotübül stabilitesinin anlaşılması, terapötik geliştirmeler için kritik öneme sahiptir.
- Alzheimer hastalığı ve belirli kanser türleri gibi hastalıklar, mikrotübül disfonksiyonu ile ilişkilidir.
Çalışmanın Amacı
- Fare dokularındaki mikrotübülleri fraksiyonlara ayırmak için bir yöntem geliştirmek.
- Farklı mikrotübül durumlarının stabilitesini değerlendirmek.
- Mikrotübülle ilişkili hastalıklara dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Doku diseksiyonu için laboratuvar kıyafetlerinin hazırlanması.
- Doku işlemleri için buz gibi soğuk fosfat tampon çözeltisinin kullanımı.
- Mikrotübüllerin stabil, labil ve serbest tübulin olarak fraksiyonlanması.
- Yeni protokol aracılığıyla mikrotübül stabilitesinin kantifikasyonu.
Temel Sonuçlar
- Protokol, stabil ve labil mikrotübülleri etkili bir şekilde ayırt eder.
- Nicelleştirme, çeşitli dokulardaki mikrotübül stabilitesine dair içgörüler sunar.
- Yöntem, laboratuvar kullanımı için basit ve tekrarlanabilirdir.
- Bulgular, hastalık bağlamlarında mikrotübül dinamiklerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sonuçlar
- Bu yeni protokol, mikrotübül stabilitesini inceleyen araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Mikrotübül disfonksiyonu ile ilişkili hastalıkların anlaşılması ve tedavi edilmesinde potansiyel uygulama alanlarına sahiptir.
- İleride yapılacak araştırmalar, terapötik yolları keşfetmek için bu bulguların üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Mikrotübül stabilitesinin doğru değerlendirilmesi, hücre iskeleti dinamiklerinin ilaç yanıtını etkilediği nörodejeneratif hastalıklar ve kanserlerde terapötik mekanizmaların analiz edilmesi açısından temel öneme sahiptir. Bu fraksiyonlama tekniği; doğal dokulardaki stabil, labil ve serbest tübülin havuzlarının doğrudan kantifikasyonuna olanak tanıyarak, görüntüleme ve modifikasyona özgü analizleri tamamlayan biyokimyasal bir veri sağlar. Fonksiyonel mikrotübül durumlarını ayrıştıran bu yöntem, mikrotübül modüle eden ajanlara odaklanan erken keşif programlarında hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bileşik tedavisine yanıt olarak stabil ve labil mikrotübül popülasyonlarındaki değişimleri nicelendirerek terapötik hipotezin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Mikrotübül stabilize eden veya destabilize eden ajanların hedef etkileşimini doğrulamak için doku tabanlı biyokimyasal bir analiz sağlar.
- Öngörücü Değer: Biyokimyasal mikrotübül stabilizasyonunu hastalıkla ilgili sistemlerdeki fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Mikrotübül dinamiklerini hedefleyen bileşik kütüphanelerinin yüksek içerikli taraması için uygun, kantitatif tübülin fraksiyonlama verileri üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arasında mikrotübül fraksiyonlarının tutarlı bir şekilde ayrılmasını sağlamak için standartlaştırılmış ultrasantrifüj adımları kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Fraksiyonlanmış tübülin havuzlarından mikrotübül stabilite düzenleyicilerini belirlemek amacıyla western blotting ve proteomik takip çalışmalarıyla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Proliferasyon kapasitesi ile korelasyon gösteren dokuya özgü mikrotübül stabilite varyasyonlarını tespit ederek preklinik modellerin stratifikasyonuna olanak tanır.
- Translasyonel Süreklilik: Biyokimyasal mikrotübül durumlarını, biyobelirteç uyumu için post-translasyonel modifikasyon imzalarıyla (örneğin, stabil havuzlarda asetilasyon, labil havuzlarda tirozinasyon) ilişkilendirir.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Mikrotübül hedefli programlarda terapötik indeksi öngören kantitatif stabilite metrikleri sağlayarak go/no-go kararlarını destekler.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar; burada mikrotübül stabilitesi, etki mekanizmasının doğrulanması için farmakodinamik bir biyobelirteç görevi görür.
- Keşif Biyolojisi: Doğal doku lizatlarında bileşiklerin tetiklediği mikrotübül polimerizasyon durumu değişimlerini ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir fraksiyonlamayı sağlamak için tanımlanmış sedimentasyon eşikleri (stabil mikrotübüller için 100,000 × g, labil mikrotübüller için 500,000 × g) aracılığıyla analiz standardizasyonuna olanak tanır.
- Analitikler: Bileşik etkilerini karşılaştırmak için P2 (stabil), P3 (labil) ve S3 (serbest tübülin) fraksiyonlarının western blot analizi ile kantitatif tübülin okumaları oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Preklinik doğrulama için mikrotübül fraksiyonlama verilerini dokuya özgü ekspresyon paternleri ve modifikasyon profilleri ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hastalık alanı ve doku tipi genelinde mikrotübül hedefli bileşiklerin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir biyokimyasal bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sadece translasyon sonrası modifikasyonlara güvenmek yerine, mikrotübül polimerizasyon durumlarını doğrudan ölçerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Mikrotübül bütünlüğünü korumak için standartlaştırılmış santrifüj parametreleri ve sıcaklık kontrollü işlemleme yoluyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hücresel analizlerin ötesinde, mikrotübül hedefleme mekanizmasının ortogonal doğrulamasını sağlayarak devam/dur kararı güvenini artırır.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilişkili dokulardaki kantitatif stabilizasyon etkinliğine dayanarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- İşlem sırasında mikrotübül stabilitesini korumak için doku homojenizasyonu ve ultrasantrifüj tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Fraksiyon ayırımı için 100,000 × g ve 500,000 × g hızlarına ulaşabilen yüksek hızlı rotorlara (TLA-55 ve TLA-120.2) erişime bağlıdır.
- Laboratuvarlar arasında tutarlı sonuçlar elde etmek için fraksiyonlama zamanlamasının ve sıcaklığın ekipler arası standart hale getirilmesini gerektirir.
- Yöntemin, farklı mikrotübül yoğunluklarına sahip nöral olmayan dokulara uygulanması durumunda tampon bileşiminin ve santrifüj parametrelerinin adaptasyonunu gerektirir.
- Numune hazırlama sırasında artefaktal mikrotübül depolimerizasyonunu önlemek için gereken anlık işleme ihtiyacı ile sınırlıdır.
