Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

AAV'yi nötralize eden önceden var olan antikorlar, AAV gen tedavilerinin ilerlemesi için bir engel oluşturur. Bu tahlil, AAV'ye karşı nötralize edici antikorları tespit etmek için bir tarama aracıdır. En büyük avantajı, uygun maliyetli, zaman verimli, kurulumu kolay ve minimum teknik beceri, laboratuvar ekipmanı ve reaktifler gerektirebilir olmasıdır.

Önceden ısıtılmış komple DMEM ortamlarında hücreleri mililitre başına 1 x 10 ila beşinci hücre konsantrasyonuna seyrelterek HT1080 hücrelerini ilk gün kaplamaya başlayın. Daha sonra kuyu başına 100 mikrolitre hücreyi, kuyu başına 1 x 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonuna kadar net 96 kuyu düz tabanlı plakalara tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derecede 16 ila 22 saat boyunca gece boyunca% 5 karbondioksit ile kuluçkaya bırakın.

İkinci günde, önceden ısıtılmış komple DMEM kullanarak 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerinde ilgi çekici serum örneklerinin seri seyreltmelerini oluşturun. Seyreltilmiş serum örneklerine sahip her tüpe, mikrolitre virüs çalışma çözeltisi başına altı viral genoma 7,5x10'un 66 mikrolitresini ekleyin. Pipetleme ile virüs serum seyreltme karıştırın ve daha sonra potansiyel nötralizasyonun gerçekleşmesini sağlamak için virüs serumu karışımlarını içeren tüpleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile bir inkübatöre yerleştirin.

30 dakika sonra, pipet 100 mikrolitre virüs serum karışımının her bir kuyuya 1x10 içeren 96 kuyu plakasındaki her kuyuya, kuyu başına 1x10 içeren, daha sonra plakayı 16 ila 24 saat boyunca gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmek için bir folyoya sarın. Üçüncü gün, yapışan hücreleri bozmadan bir duman davlumbaz vakumu kullanarak 96 kuyu plakasının kuyularından medyayı aspire edin ve her kuyuya% 4 paraformaldehitten 50 mikrolitre ekleyin. Plakayı folyoya sardıktan sonra oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın ve aspire edin. İkinci yıkamadan sonra, pipet 200 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS her kuyuya ve folyo plakayı 65 santigrat derecede inkübasyon ve ardından endojen alkalin fosfataz aktivitesini denature etmek için 90 dakika boyunca kuluçka, her kuyuya taze hazırlanmış çözünmüş BCIP / NBT'nin 50 mikrolitresinde inkübasyon ve sarılmış plakaları oda sıcaklığında iki ila 24 saat boyunca kuluçkaya bırakın. Daha sonra, bir ışık mikroskop kamerasında 4X objektif lens kullanarak her kuyunun fotoğraflarını çekerek tüm tahliller için aynı pozlama, beyaz dengeleme ve ışık ayarlarının tutarlı bir şekilde kullanılmasını sağlayın.

ImageJ'deki görüntüyü çözümlemek için dosyayı seçin ve Aç'ı tıklatın. Renkli görüntüler için Görüntü, Tür ve 8 bit sekmelerini sırayla seçerek gri skalaya dönüştürün. Ardından Görüntü sekmesine gidin ve tüm renkli alanlar renkli ve kırmızı olana ancak arka plan renklendirilmeyene kadar eşiği değiştirmek için Ayarla ve Eşik'i seçin.

Ölçümleri Çözümle ve Ayarla'yı tıklatın ve belirli bir kuyunun sinyal okumasını belirlemek OK.To basmadan önce Alan, Alan kesir, Eşikle Sınırla ve Görüntü etiketi için onay kutularını işaretleyin, Açılır pencerenin yüzde alan sütununun sinyal okumasını görüntülemesi için Analiz Et ve Ölç'ü tıklatın. Çalışma, aav6-hPLAP muhabir genini viral genomun çeşitli konsantrasyonlarında hücrelere ekleyerek en uygun viral dozayı oluşturdu. 15.000 enfeksiyon çokluğu % 36 plaka renklendirmesi verdi ve en uygun viral dozaj olarak seçildi.

Temsili analiz, renklenme ve enfeksiyonun çarpmaları arasındaki korelasyonu görüntüler. Renklenme ve viral konsantrasyon arasındaki doğrusal korelasyonu etkilemeyen en yüksek test edilmiş konsantrasyon elde edildi. Kütük 10 seyreltmede adeno-associate virüs veya AAV6'ya karşı bir anti-AAV6 monoklonal antikor üzerinde nötralize edici aktivite çalışması, mililitre başına 10 nanogram konsantrasyonda AAV6 transdüksiyonunun veya TI50'nin% 50 inhibisyonunu gösterdi.

Nötralize edici antikor veya NAb testinde, AAV nötralizasyon derecesi 1/2 ila 1/80 arasında değişen TI50 titre değerlerine sahip naif örnek popülasyonu içinde değişmektedir. Tahlil sonuçları, AAV idaresi öncesi AAV inhibisyon TI50 titre değerlerinin 1/4 ile 1/80 arasında değiştiğini gösterdi. AAV yönetiminden sonra TI50 titre 1/2000 ile 1/32.000'in üzerine çıkararak AAV öncesi ve sonrası yönetim arasındaki titre değerlerinde net bir zıtlık ortaya koymuştur.

Kuyuların fotoğraflarını çekerken, test boyunca aynı mikroskop ayarlarını sürekli olarak kullanmak ve fotoğrafların doğrudan kuyuların merkezinde çekildiğinden emin olmak önemlidir.