Name: Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAVye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Öğrenin, AAV nötralize edici antikorlarını HT1080 hücreleri kullanarak kolorimetrik yöntemle nasıl tespit edeceğinizi. Bu basit ve uygun maliyetli analiz, gen terapisi araştırmalarında antikor varlığını hızla belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, JRM ve CJT'ye Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Proje Hibesi (ID 1163732) ve kısmen Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edildi. SB, Baker Kalp ve Diyabet Enstitüsü-La Trobe Üniversitesi Doktora Bursu ile desteklenmektedir. KLW, Avustralya Ulusal Kalp Vakfı'ndan (ID 102539) Shine On Foundation ve Geleceğin Lider Bursu tarafından desteklenmektedir. JRM, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kıdemli Araştırma Bursu (ID 1078985) tarafından desteklenmektedir.

Hayvan bakımı ve deneyinin tüm yönleri Florey Nörobilim ve Ruh Sağlığı Enstitüsü yönergeleri ve Avustralya Hayvanların Bakımı ve Kullanımı için Referans25'i takiben Bilimsel Amaçlar için Kodu'nu izleyerek gerçekleştirildi. Çalışmada 1,5-3 yaşındaki Merinos koyunları kullanılmıştır. Şekil 1'de test protokolüne şematik bir genel bakış sağlanmaktadır.
<img alt="Seri dilüsyonlar, hücre inkübasyonu ve mikroskopi sonuçları ile transdüksiyon inhibisyonu test diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/63419fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: NAb tahlil protokolünün şematik diyagramı. (A) Üç günlük protokolde yer alan birincil adımları gösteren NAb tahlilinin görsel gösterimi. Kısaca, hücreler bir gecede yetiştirilir ve kaplanr. Ertesi gün serumun seri seyreltmeleri hazırlanır, AAV ile inkübe edilir ve daha sonra bir gecede hücrelerle inkübe edilir. Ertesi gün, hücreler sabitlenir, yıkanır, inkübe edilir, substratla birleştirilir ve tekrar inkübe edilir, ardından görüntüleme ve nicelik. (B) Minimum sinyal kontrolü (komple AAV inhibisyonu), maksimum sinyal kontrolü (inhibisyon yok) ve ~P sinyal inhibisyonu olan bir yumurta serumu örneğinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63419/63419fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. İlk hazırlık
<ol><li>Koyunlarda değerlendirme için: 8 mL serum ayırıcı pıhtı aktivatör tüplerinde kan toplayın (bkz. Malzeme Tablosu), kan örneğini 20-30 dakika oda sıcaklığında (RT) bırakın ve daha sonra 15 dakika boyunca 2.100 x g'da aşağı çevirin. Tüplerin üst kısmında oluşan açık süpernatant serumdur. Berrak sulu fazı mikrosantrifüj tüplerine aliquot ve -80 °C'de saklayın. NOT: -80 °C'deki serum ~5 yıl boyunca sabit kalır. Şah damarından 16 G iğne (ucu kesilmiş) ve bilinçli hayvanlardan şırınga kullanılarak kan toplandı.</li>
	<li>Isı fetal sığır serumu (FBS) 30 dakika boyunca 56 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek inaktive ve aralıklı olarak döner. Hassasiyet için, eşdeğer miktarda su içeren ikinci bir şişeye bir termometre yerleştirin ve FBS şişesiyle aynı anda ısı banyosuna ekleyin. Termometre 56 °C'ye ulaştığında zamanlamaya başlayın.</li>
	<li>Hücre kültürü kaputunda gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar için uygun aseptik teknik ve hücre kültürü uygulaması 26,27.'yi uygulayın. Kullanmadan önce tüm nesnelere ve davlumbaz üzerine% 70 etanol püskürtün ve tamamlandığında% 1 sodyum hipoklorit ile temizleyin.</li>
	<li></li><li></li></ol><ol><li><li> </li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li></li><li> </li><li></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"></td><td colspan="3"></td><td colspan="3"></td><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol><li></li><li><ol><li> </li></ol></li><li> </li><li></li><li><li><li> </li><li><ol><li> </li></ol></li></ol><ol><li></li><li>&gt;</li><li>&gt;&gt;</li><li>&gt;&gt; </li><li>&gt;</li><li>&gt;</li><li> </li></ol><img alt="Görüntü analiz süreci; eşik ayar şeması; Kapsam ölçümü için yazılım arayüzü." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/63419fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63419/63419fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li> </li><li><li></li></ol><ol><li> </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu rapor, in vitro viral transdüksiyon derecesine karşılık gelen kromojenik reaksiyonu değerlendirerek belirli bir serum örneğinde AAV nötralizasyonunun kapsamını değerlendiren kolorimetrik bir tahlil açıklanmaktadır. Protokolün geliştirilmesi, immünhistokimi gibi uygulamalarda protein hedeflerinin tespiti için bir boyama aracı ve viral transdüksiyonu değerlendirmek için bir muhabir aracı olarak yaygın olarak kullanılan alkali fosfataz enzimi ile NBT/BCIP arasındaki bilinen kromojenik reaksiyona dayanıyordu24,33...

Adeno ilişkili virüsler (AAV), gen tedavilerinin kardiyovasküler, pulmoner, dolaşım, oküler ve merkezi sinir sistemlerini etkileyen çeşitli sağlık durumları için deneme tedavilerine ulaştırılmasında vektör olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1,2,3,4,5. AAV vektörlerinin önde gelen gen tedavisi platformu olarak popülaritesi, pozitif güvenlik profili, uzun süreli transgene ekspresyasyonu ve dokuya özgü geniş kapsamlı tropizmlerinden kaynaklanmaktadır1,6. Hayvan çalışmalarındaki başarılı sonuçlar, etkinlik uç noktalarına başarıyla ulaşan elliden fazla AAV gen tedavisi klinik denemesinin ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi8 tarafından onaylanan ilk ticari olarak mevcut AAV gen tedavisi ilacının piyasaya sürülmesinin önünü açmıştır8. İlk başarıların ardından, AAV tercih edilen bir vektör olarak temel ve klinik araştırma sektörlerinde ilgi görmeye devam etti ve şu anda ABD ve Avrupa'da klinik kullanım için onaylanan tek in vivo gen tedavisi9. Bununla birlikte, AAV vektör kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorların (NAbs) varlığı hem klinik öncesi araştırmalara hem de klinik çalışmaların etkinliğine engel olmaya devam etmektedir. NAb'ler hem naif insan hem de hayvan popülasyonlarında bulunur ve bir AAV vektörün in vivo yönetimini takiben gen transdüksiyonu inhibe eder1. AAV seropozitliği çoğu gen tedavisi denemesi için bir dışlama kriteridir ve bu nedenle konak bağışıklığı için ön tarama hem laboratuvarda hem de klinikte çok önemlidir. AAV'ye karşı NAB'lerin varlığını tespit edebilecek bir test oluşturmak, herhangi bir AAV gen terapisi tabanlı araştırma projesinin boru hattında önemli bir adımdır. Bu rapor, çizgili kas (kalp ve iskelet kası)1,10,11,12'de etkili ve seçici transdüksiyon nedeniyle araştırmacıların ilgisini çeken AAV6'ya odaklanmıştır. Gen tedavisi kalbi hedeflemek için umut verici bir strateji olarak kabul edilir, çünkü invaziv açık kalp prosedürleri olmadan kalbi özellikle hedeflemek zordur.
Nötralize edici aktivite genellikle hücre bazlı in vitro veya in vivo transdüksiyon inhibisyon tahlili kullanılarak belirlenir. In vivo NAb tahlilleri genellikle serumun bir denekten (örneğin, insan veya büyük hayvan) farelere verilmesini, ardından muhabir geni olan bir AAV'nin ve ardından muhabir geninin veya ilgili antijenin ekspresyozunun testini içerir. İn vitro tahliller, bir muhabir genini ifade eden rekombinant AAV (rAAV) ile seri seyreltmelerde insan veya büyük bir hayvandan serum veya plazma inkübasyon yaparak NAb titrlerini belirler. Hücreler serum/virüs karışımı ile enfekte edilir ve muhabir gen ekspresyonlarının ne ölçüde inhibe edildiği kontrollerle karşılaştırıldığında değerlendirilir. In vitro tahliller, in vivo testlere kıyasla nispeten daha düşük maliyeti, testlerdeki hızlılığı ve standardizasyon ve doğrulama için daha fazla kapasite13,14 nedeniyle NAb taraması için yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo tahlillerin genellikle daha fazla hassasiyete sahip olduğu bildirilmektedir15,16, ancak aynı iddia in vitro tahlillerle ilgili olarak da ortaya atıldı14,17.
Bugüne kadar, in vitro NAb tahlilleri nötralizasyonunu tespit etmek için muhabir geni olarak esas olarak lüminesans (luciferaz) kullanmıştır. Işık tabanlı bir yöntemin birçok bağlamda değeri olsa da, kolorimetrik/kromojenik bir NAb tahlili bazı durumlarda avantajlı olabilir. Nötralizasyonunu değerlendirmek için yapılan kolorimetrik tahliller influenza ve adenovirüs gibi diğer virüsler için başarıyla sunulmuştir18,19. Çekicilikleri basitliklerinden, daha düşük maliyetlerinden ve sadece günlük laboratuvar cihazları ve araçları için gereksinimden kaynaklanmaktadır20. Lüminesans tabanlı bir muhabir geni kullanan NAb tahlilleri, yüksek maliyetli substrat kitleri, bir luminometre ve analiz için ilgili yazılım gerektirir21. Bu kolorimetrik test, sadece hafif bir mikroskop ve çok ucuz bir substrat gerektirme avantajına sahiptir. Kolorimetrik ve parlak testlere karşı duyarlılığının raporlanması çelişkili sonuçlar verdi. Bir çalışma, lüminesans tabanlı ELISA testlerinin daha fazla hassasiyet ve kolorimetrik testlerle karşılaştırılabilir tekrarlanabilirlik gösterdiği öne sürsürürd22, bir diğeri ise daha fazla hassasiyet sağlamak için kolorimetrik tabanlı ELISA tahlilleri buldu23. Burada, alkali fosfataz (AP) muhabir geni ile nitro mavisi tetrazolium /5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (NBT/BCIP) substratı arasındaki kromojenik reaksiyonu kullanan AAV'ye karşı bir in vitro NAb tahlili için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu adım adım protokol, AAV24'e karşı nötralize edici aktiviteyi tespit etmek için hPLAP (insan plasntal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP) kullanan önceki bir rapora dayanarak geliştirilmiştir. Bu test uygun maliyetli, zaman verimli, kurulumu kolaydır ve minimum teknik beceri, laboratuvar ekipmanı ve reaktif gerektirir. Ayrıca, bu tahlilin basitliği, farklı hücre, doku veya viral serotip türlerinde geniş uygulamalar için optimize edilebilir potansiyel verir.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 Tripsin / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>75 cm2 kare şişeler</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td>Veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>96 kuyulu düz tabanlı plaka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>AAV6-CMV-hPLAP Vektörü</td><td></td><td></td><td>Kas Araştırmaları & Terapötik Laboratuvarı (Melbourne Üniversitesi, Avustralya) AAV6-CMV-hPLAP talep üzerine sağlanabilir.</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-AAV6 (sağlam parçacık) fare monoklonal antikoru, (ADK6)</td><td>PROGEN</td><td>610159</td><td>Pozitif kontrol monoklonal antikoru</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>SIGMAFAST</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ve doku kültürü güvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Pipet</td><td></td><td></td><td>5 ve 10 mL şerit ekler</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek glikoz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 hücreleri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Yazılımı</td><td></td><td></td><td>Ücretsiz olarak kullanılabilir:</td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html İnkübatör</td><td></td><td></td><td>37 & derece; C, %5 CO2</td></tr> <tr>kameralı <td></td><td></td><td>ışık mikroskobu</td><td>4x objektif lens ile fotoğraf çekebilme</td></tr><tr><td>65</td> derece için fırın<td></td><td></td><td>; C inkübasyon</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>MERCK</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetler ve uçlar</td><td></td><td></td><td>20 &mu; L, 200 &mu; L & 1 mL tekli pipetler ve uçlar & 200 &mu; L çok kanallı pipet</td></tr><tr><td>Stericup hızlı serbest bırakma filtresi</td><td>Millipore</td><td>S2GPU10RE</td><td>Medya reaktiflerini birleştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Ayırıcı Pıhtı Aktivatörü</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>455071</td><td>Koyunlardan serum toplama ve işleme için kullanılır</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kolorimetrik hücre tabanlı bir test kullanarak aav'ye karşı nötralize edici antikorları tespit etmek İçin adım adım bir yöntem

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV), hem laboratuvarda hem de klinikte çeşitli sağlık koşullarını tedavi etmek için genetik materyal transferi için güvenli ve başarılı bir vektör olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, AAV kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorlar (NAbs), hem büyük hayvan deney modellerinde hem de insan popülasyonlarında gen tedavilerinin başarılı bir şekilde verilmesi için devam eden bir zorluk oluşturmaktadır. AAV'ye karşı konak bağışıklığı için ön tarama, AAV tabanlı gen tedavilerinin hem bir araştırma aracı hem de klinik olarak uygulanabilir bir terapötik ajan olarak etkinliğini sağlamak için gereklidir. Bu protokol, AAV serotip 6'ya (AAV6) karşı nötralize edici faktörleri tespit etmek için kolorimetrik bir in vitro testini açıklar. Test, alkali fosfataz (AP) muhabir geni kodlayan bir AAV ile kombinasyon halinde çözünmeyen ölçülebilir mor bir leke oluşturan NBT/BCIP alt tabakası arasındaki reaksiyonu kullanır. 
Bu protokolde serum örnekleri AP'yi ifade eden bir AAV ile birleştirilir ve potansiyel nötralizasyon aktivitesinin gerçekleşmesine izin vermek için inkübe edilir. Virüs serum karışımı daha sonra nötralize edilmemiş AAV'lerin viral transdüksiyonu için hücrelere eklenir. NBT/BCIP substratı eklenir ve viral transdüksiyon ve nötralize edici aktiviteye karşılık gelen kromojenik bir reaksiyona uğrar. Renkli alan oranı, nötralize edici titreler oluşturmak için özgür bir yazılım aracı kullanılarak nicelleştirilir. Bu test, renklenme ve viral konsantrasyon arasında güçlü bir pozitif korelasyon görüntüler. Rekombinant AAV6'nın uygulamadan önce ve sonra koyunlardan alınan serum örneklerinin değerlendirilmesi nötralize edici aktivitede çarpıcı bir artışa yol açtı (125 ila >10.000 kat artış). Test, 1:32.000 > serum seyreltmesinde nötralizasyon aktivitesini tespit etmek için yeterli hassasiyet gösterdi. Bu tahlil, NAB'leri AAV'lere karşı tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Plaka kapsamı için en uygun viral dozluğu belirlemek için transdüksiyon tahlilleri Bu test için köklü bir fibrosarkom hücre hattı olan HT1080 hücreleri seçildi. 1 x 104 HT1080 hücre/kuyu konsantrasyonu, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusunda ~% 50 hücre konflüensi sağladı. Test için en uygun viral konsantrasyonu belirlemek için, bir hPLAP (insan plasetal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP)31'i kodlayan bir rAAV, hücre başına parçacık içeren bir dizi vg konsantra...

AAV6'ya karşı nötralize edici unsurları tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli ve basit kolorimetrik hücre tabanlı bir test için kapsamlı bir laboratuvar protokolü ve analiz iş akışı açıklanmaktadır.

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

AAV'yi nötralize eden önceden var olan antikorlar, AAV gen tedavilerinin ilerlemesi için bir engel oluşturur. Bu tahlil, AAV'ye karşı nötralize edici antikorları tespit etmek için bir tarama aracıdır. En büyük avantajı, uygun maliyetli, zaman verimli, kurulumu kolay ve minimum teknik beceri, laboratuvar ekipmanı ve reaktifler gerektirebilir olmasıdır.Önceden ısıtılmış komple DMEM ortamlarında hücreleri mililitre başına 1 x 10 ila beşinci hücre konsantrasyonuna seyrelterek HT1080 hücrelerini ilk gün kaplamaya başlayın. Daha sonra kuyu başına 100 mikrolitre hücreyi, kuyu başına 1 x 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonuna kadar net 96 kuyu düz tabanlı plakalara tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derecede 16 ila 22 saat boyunca gece boyunca% 5 karbondioksit ile kuluçkaya bırakın.İkinci günde, önceden ısıtılmış komple DMEM kullanarak 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerinde ilgi çekici serum örneklerinin seri seyreltmelerini oluşturun. Seyreltilmiş serum örneklerine sahip her tüpe, mikrolitre virüs çalışma çözeltisi başına altı viral genoma 7,5x10'un 66 mikrolitresini ekleyin. Pipetleme ile virüs serum seyreltme karıştırın ve daha sonra potansiyel nötralizasyonun gerçekleşmesini sağlamak için virüs serumu karışımlarını içeren tüpleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile bir inkübatöre yerleştirin.30 dakika sonra, pipet 100 mikrolitre virüs serum karışımının her bir kuyuya 1x10 içeren 96 kuyu plakasındaki her kuyuya, kuyu başına 1x10 içeren, daha sonra plakayı 16 ila 24 saat boyunca gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmek için bir folyoya sarın. Üçüncü gün, yapışan hücreleri bozmadan bir duman davlumbaz vakumu kullanarak 96 kuyu plakasının kuyularından medyayı aspire edin ve her kuyuya% 4 paraformaldehitten 50 mikrolitre ekleyin. Plakayı folyoya sardıktan sonra oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın ve aspire edin. İkinci yıkamadan sonra, pipet 200 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS her kuyuya ve folyo plakayı 65 santigrat derecede inkübasyon ve ardından endojen alkalin fosfataz aktivitesini denature etmek için 90 dakika boyunca kuluçka, her kuyuya taze hazırlanmış çözünmüş BCIP / NBT'nin 50 mikrolitresinde inkübasyon ve sarılmış plakaları oda sıcaklığında iki ila 24 saat boyunca kuluçkaya bırakın. Daha sonra, bir ışık mikroskop kamerasında 4X objektif lens kullanarak her kuyunun fotoğraflarını çekerek tüm tahliller için aynı pozlama, beyaz dengeleme ve ışık ayarlarının tutarlı bir şekilde kullanılmasını sağlayın.ImageJ'deki görüntüyü çözümlemek için dosyayı seçin ve Aç'ı tıklatın. Renkli görüntüler için Görüntü, Tür ve 8 bit sekmelerini sırayla seçerek gri skalaya dönüştürün. Ardından Görüntü sekmesine gidin ve tüm renkli alanlar renkli ve kırmızı olana ancak arka plan renklendirilmeyene kadar eşiği değiştirmek için Ayarla ve Eşik'i seçin.Ölçümleri Çözümle ve Ayarla'yı tıklatın ve belirli bir kuyunun sinyal okumasını belirlemek OK.To basmadan önce Alan, Alan kesir, Eşikle Sınırla ve Görüntü etiketi için onay kutularını işaretleyin, Açılır pencerenin yüzde alan sütununun sinyal okumasını görüntülemesi için Analiz Et ve Ölç'ü tıklatın. Çalışma, aav6-hPLAP muhabir genini viral genomun çeşitli konsantrasyonlarında hücrelere ekleyerek en uygun viral dozayı oluşturdu. 15.000 enfeksiyon çokluğu % 36 plaka renklendirmesi verdi ve en uygun viral dozaj olarak seçildi.Temsili analiz, renklenme ve enfeksiyonun çarpmaları arasındaki korelasyonu görüntüler. Renklenme ve viral konsantrasyon arasındaki doğrusal korelasyonu etkilemeyen en yüksek test edilmiş konsantrasyon elde edildi. Kütük 10 seyreltmede adeno-associate virüs veya AAV6'ya karşı bir anti-AAV6 monoklonal antikor üzerinde nötralize edici aktivite çalışması, mililitre başına 10 nanogram konsantrasyonda AAV6 transdüksiyonunun veya TI50'nin% 50 inhibisyonunu gösterdi.Nötralize edici antikor veya NAb testinde, AAV nötralizasyon derecesi 1/2 ila 1/80 arasında değişen TI50 titre değerlerine sahip naif örnek popülasyonu içinde değişmektedir. Tahlil sonuçları, AAV idaresi öncesi AAV inhibisyon TI50 titre değerlerinin 1/4 ile 1/80 arasında değiştiğini gösterdi. AAV yönetiminden sonra TI50 titre 1/2000 ile 1/32.000'in üzerine çıkararak AAV öncesi ve sonrası yönetim arasındaki titre değerlerinde net bir zıtlık ortaya koymuştur.Kuyuların fotoğraflarını çekerken, test boyunca aynı mikroskop ayarlarını sürekli olarak kullanmak ve fotoğrafların doğrudan kuyuların merkezinde çekildiğinden emin olmak önemlidir.

a-step-step-method-to-detect-neutralizing-antibodies-against-aav

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, koyun serum örneklerinde alkalin fosfataz eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 6 (rAAV6) vektörlerine karşı nötralize edici antikorların varlığını tespit etmek için in vitro kolorimetrik bir test gösteriyoruz. Test, çözünmeyen mor bir ürün oluşturmak için bir insan plasental alkalin fosfataz genini kodlayan AAV ile substratı arasındaki reaksiyonu kullanır.

Hücre Bazlı AAV Nötralize Edici Antikor Testi: Serumda Spesifik Adeno İlişkili Virüslere Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Kolorimetrik Bir Teknik

Bu video, insan serumunda α2,6'ya bağlı sialik asidi aşırı eksprese eden Madin-Darby Köpek Böbrek hücrelerini kullanarak nötralize edici antikorları ölçmek için Mikronötralizasyon testlerini göstermektedir. Bu test genellikle influenza insan serolojisi için...

İnsan Serumunda Nötralize Edici Antikor Titrelerini Ölçmek için Bir Mikronötralizasyon Testi

Bu video, influenza A ve B virüsleri arasındaki antijenik ilişkileri analiz etmek için görüntüleme tabanlı mikro nötralizasyon testini göstermektedir. Viral enfeksiyonu önlemede antikorların veya diğer tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için nicel ve görsel bir yol sağlar.

Virüsler Arasındaki Antijenik İlişkinin Görüntü Tabanlı Mikronötralizasyon Testi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Bu video, respiratuar sinsityal virüse (RSV) karşı nötralize edici antikorları ölçmek için bir testi göstermektedir. RSV nötralize edici antikorlar içeren serum ile ön inkübasyon, virüs partiküllerini nötralize ederek hücresel enfeksiyonu ve plak oluşumunu azaltır. Virüsle enfekte olmuş hücreler daha sonra plak görselleştirme için fiksasyon, bloke etme ve florofor konjuge antikor etiketlemesine tabi tutulur. Bu işlem, nötralizasyon titresini temsil eden RSV'nin yüzde ellisini nötralize eden en...

Respiratuar Sinsityal Virüse Özgü Nötralize Edici Antikor Titresini Ölçmek İçin Bir Test

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil Nefelometri adeno ilişkili virüs (AAV) titreleri ve derleme aktif rol çalışmaya uygulanması için detayları proteinleri (AAPs), yapısal olmayan viral proteinlerin tüm AAV buldu romanı bir sınıf serotipleri, soydaş ve kapaklı AAV serotipleri türetilmiş capsids Meclisi teşvik.

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Öğrenin, AAV nötralize edici antikorlarını HT1080 hücreleri kullanarak kolorimetrik yöntemle nasıl tespit edeceğinizi. Bu basit ve uygun maliyetli analiz, gen terapisi araştırmalarında antikor varlığını hızla belirlemenizi sağlar.

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet