Name: Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Keşfedin FRET haritalama yöntemiyle proteinlerdeki ligand bağlanma bölgelerini ve konformasyonel değişiklikleri çözüm ortamında nasıl tanımlayacağınızı. Bu teknik biyomoleküler dinamikleri yapısal biyoloji çalışmalarında etkili şekilde izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R15GM135904 (IM'ye verildi) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe GM110552 (DBO'ya verildi) tarafından desteklenmiştir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

FRET haritalama metodolojisini kullanarak, SecA proteini üzerindeki sinyal dizisi bağlanma bölgesini belirledik. Daha da önemlisi, kompleksin 3 boyutlu kristal yapısının varlığı, çalışmamızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Bu haritalama metodolojisinin gücü, etiketleme için konumları tanımlamak için mevcut bir yapıyı kullanma yeteneğinde yatmaktadır. Bu metodoloji 3B bir yapıyı belirlemek için kullanılamaz; Bununla birlikte, yapısal elemanların belirlenmesi56, mevcut bir yapının iyileştirilmesi<sup cl...

Proteinler için, 3 boyutlu (3-B) yapısal bilgi ile birlikte dinamiklerin aydınlatılması, biyomoleküler sistemlerin yapı-işlev ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açar. X-ışını kristalografisi ve kriyojenik elektron mikroskobu gibi yapısal yöntemler, statik bir yapı yakalar ve genellikle biyomolekül bağlanmasının ve dinamiğinin yönlerini aydınlatmak için çoklu yapıların belirlenmesini gerektirir1. Bu makalede, bağlama siteleri veya bağlama etkileşimleri gibi genel yapısal öğeleri eşlemek için potansiyel olarak daha geçici ve statik yöntemlerle daha az kolay yakalanan çözüm tabanlı bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji için güçlü aday sistemler, 3 boyutlu bir yapının daha önce X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopisi veya diğer yapısal yöntemlerle belirlendiği sistemlerdir. Bu durumda, protein genel sekretuar yolunda merkezi bir oyuncu olan SecA-SecYEG kompleksinin X-ışını kristal yapısından yararlanarak, preproteinin membran2 boyunca taşınmasından önce Förster rezonans enerji transferini (FRET) kullanarak bir sinyal peptid bağlanma bölgesinin yerini haritalandırıyoruz. Biyolojik sistemin genetik modifikasyonlar yoluyla manipülasyonu, 3-D yapısı hakkındaki bilgimizle birleştiğinde, kanal 3'e yerleştirilmeden hemen önce sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunun belirlenmesini sağladı.
FRET, enerjinin bir molekülden (donör) diğerine (alıcı) radyasyonsuz transferini, mesafeye bağlı bir şekilde,uzay 4,5 boyunca içerir. Bu transferin etkinliği, donördeki bir azalma veya alıcı floresan yoğunluğundaki bir artış ile izlenir. Enerji transferinin verimliliği şu şekilde tanımlanabilir:
E = R 0 6/(R0 6 + R 6)
R0 değerinin, aktarımın% 50 verimli olduğu mesafe6. Bu teknik daha önce moleküler bir cetvel olarak tanımlanmıştır ve donör-alıcıboyaların 4,7,8,9 kimliğine bağlı olarak 2.5-12 nm aralığındaki mesafelerin belirlenmesinde etkilidir. Donör floresan yoğunlukları ve alıcılı veya alıcısız ömürleri, transfer verimliliklerinin ve dolayısıylamesafelerin 5,8 olarak belirlenmesine izin verir. Teknolojinin mevcudiyeti, yöntemin hassasiyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle, FRET ayrıca tek moleküllü floresan spektroskopisi ve konfokal mikroskopi6 gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Yeşil floresan proteini gibi floresan proteinlerin ortaya çıkışı, hücre içi dinamiklerin ve canlı hücre görüntülemenin gözlemlenmesini nispeten kolay hale getirmiştir10,11. Bunlar gibi birçok FRET uygulaması bu sanal sayıda ayrıntılı olarak ele alınmıştır.
Bu çalışmada, yapısal detayları belirlemek için mesafe değerlerini elde etmek için FRET ölçümlerinin kullanımına özellikle odaklanıyoruz. Daha önce, FRET ölçümleri, protein 12,13,14'e, proteinlerin iç dinamiklerine ve protein bağlanma etkileşimlerine15,16,17 bağlandığında DNA moleküllerinin konformasyonunu belirlemek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu yöntemin avantajları, nispeten düşük miktarda malzemeye sahip bir çözeltide esnek ve dinamik yapısal elemanları belirleme yeteneğinde yatmaktadır. Önemli bir şekilde, bu yöntem mevcut yapısal bilgilerle birlikte kullanıldığında özellikle etkilidir ve 3 boyutlu yapı belirleme aracı olarak kullanılamaz. Yöntem, çalışmanın genellikle hesaplamalı simülasyon18,19 ile birleştirilen mevcut yapısal bilgilere dayanması durumunda yapının en iyi içgörüsünü ve iyileştirilmesini sağlar. Burada, kararlı durum ve zaman çözümlü FRET ölçümlerinden elde edilen mesafelerin kullanımı, genel sekretuar yolu3'teki ana proteinler olan SecA-SecYEG kompleksinin mevcut bir kristalografik yapısı üzerinde, yeri bilinmeyen bir bağlanma bölgesini haritalamak için tanımlanmıştır.
Prokaryotlardan ökaryotlara ve arkelere kadar oldukça korunmuş bir sistem olan genel salgı yolu, proteinlerin hücre içindeki fonksiyonel konumlarına membran boyunca veya içine taşınmasına aracılık eder. Çalışmamızda kullanılan organizma olan E. coli gibi Gram-negatif bakteriler için, proteinler iç zar boyunca periplazmaya yerleştirilir veya yer değiştirir. Bakteriyel SecY kanal kompleksi (translokon olarak adlandırılır), tipik olarak N-terminus20,21'de bulunan bir sinyal dizisi aracılığıyla hücredeki doğru konumuna yönlendirilen yeni sentezlenmiş proteini translokasyona yerleştirmek için diğer proteinlerle koordine olur. Periplazmaya bağlı proteinler için, ATPaz SecA proteini, ribozomun çıkış tüneli ile ve yaklaşık 100 kalıntı çevrildikten sonra preprotein ile ilişkilidir22. SecB şaperon proteini ile birlikte, preproteini açılmamış bir durumda tutar. SecA, SecYEG translokonuna bağlanır ve birçok ATP hidrolizi döngüsü boyunca, membran23,24 boyunca protein taşınmasını kolaylaştırır.
SecA, sitozolik ve membrana bağlı formlarda bulunan çok alanlı bir proteindir. Sitosoldeki homodimerik bir protein olan SecA, bir preprotein bağlanma veya çapraz bağlanma alanı25, iki nükleotid bağlayıcı alan, bir sarmal kanat alanı, bir sarmal iskele alanı ve iki sarmal parmak (THF) 26,27,28,29'dan oluşur (Şekil 1). SecA-SecYEG kompleksinin önceki kristalografik çalışmalarında, THF'nin yeri, protein translokasyonunda aktif olarak yer aldığını ve daha sonra sinyal peptidi ile çapraz bağlanma deneylerinin bu bölgenin protein translokasyonundaki önemini daha da ortaya koyduğunu ileri sürdü30,31. FRET haritalama metodolojisini kullanan önceki çalışmalar, eksojen sinyal peptitlerinin SecA 2,32'nin bu bölgesine bağlandığını göstermiştir. SecYEG kanalına yerleştirilmeden önce sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin konformasyonunu ve yerini tam olarak anlamak için, erken olgun bölgenin sinyal dizisinin ve kalıntılarının bir Ser-Gly bağlayıcı aracılığıyla SecA'ya bağlandığı bir protein kimera oluşturuldu (Şekil 1). Bu biyolojik olarak uygulanabilir yapı kullanılarak, preproteinin sinyal dizisinin ve erken olgun bölgesinin THF'ye paralel bir şekilde bağlandığıgösterilmiştir 2. Daha sonra, FRET haritalama metodolojisi, aşağıda açıklandığı gibi SecYEG'nin varlığında sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunu ve yerini aydınlatmak için kullanılmıştır.
SecA-SecYEG kompleksi33,34,35'in 3-D yapısı ve bağlanma yerinin olası konumu hakkında bilgi, bireysel FRET mesafelerinin kesişiminin bağlanma yeri yerini tanımladığı yerlere bağışçı-alıcı etiketlerini makul bir şekilde yerleştirmemize izin verdi. Bu FRET haritalama ölçümleri, sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin, ucu SecYEG kanalının ağzında bulunan bir saç tokası oluşturduğunu ve saç tokası yapısının kanal yerleştirmeden önce şablonlandığını gösterdiğini ortaya koymuştur.

<table><tbody><tr><td>490 nm LED lazer</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimid // DIBO Alkin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimid / DIBO Alkin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra &shy; 4 Santrifüj filtre (50kDa MWCO)</td> <td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodesilmaltosit (DDM)</td> <td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td> E. coli alkalin fosfataz sinyal peptidi SP22</td><td>Biyomoleküller Midwest</td><td>N/A</td><td>Sentezlenmiş özel öğe</td></tr><tr><td>genişletilmiş sinyal peptit SP41</td><td>Biyomoleküller Midwest</td><td>N/A</td><td>Sentezlenmiş özel ürün</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Fluoromax4 spektroflorometre için</td> <td>Horiba</td><td>sürüm 2.4</td> spektral edinim programı</tr><tr><td>Fluoromax 4 spektroflorometre</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Floresan Dinamiği Laboratuvarı, California Üniversitesi, Irvine</td><td></td><td>Zamanla çözülen bozunmalar için spektral analiz programı</td></tr><tr><td>H&shy; 4&utangaç; Azido&utangaç; Phe&shy; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Değirmenci) Et Suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 kolloidal silika (H2O'da ağırlıkça %40 süspansiyon)</td>Uygun <td>bir saçılma çözeltisi yapmak için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td> seyreltme gereklidir</tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>sürüm 4.1.0.4096</td><td>PTI Time Master Instrument için spektral edinim programı</td></tr><tr><td> Enstrüman</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Moleküler Grafik Programı</td><td>Schrödinger</td><td>sürüm 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

förster rezonans enerji transfer haritalaması: küresel yapısal Özellikleri aydınlatmak İçin yeni bir metodoloji

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Förster rezonans enerji transferi (FRET), in vitro ve hücrelerdeki biyomoleküller arasındaki mesafeleri başarılı bir şekilde ölçmek için kullanılan floresan tabanlı bir yöntemdir. FRET'te, floresan yoğunluğundaki veya ömründeki değişikliklerle ölçülen enerji transferinin verimliliği, iki floresan molekülü veya etiketi arasındaki mesafe ile ilgilidir. Dinamiklerin belirlenmesi ve mesafelerden gelen konformasyonel değişiklikler, bu yöntemin biyolojik sistemlere uygulanmasına sadece birkaç örnektir. Belirli koşullar altında, bu metodoloji dinamikler, esneklik ve bağlanma yüzeylerine adaptasyon hakkında bilgi sağlayarak mevcut X-ışını kristal yapılarına katkıda bulunabilir ve geliştirebilir. Bir bağlanma yerinin tanımlanması veya dimer alt birimlerinin oryantasyonları yoluyla yapısal özellikleri aydınlatmak için FRET ve ilişkili mesafe belirlemelerinin kullanımını açıklıyoruz. Etiketleme alanlarının akıllıca seçilmesi ve sıklıkla çoklu etiketleme stratejilerinin kullanılmasıyla, bir protein-DNA kompleksindeki ve SecA-SecYEG protein translokasyon sistemindeki küresel yapısal özellikleri belirlemek için bu haritalama yöntemlerini başarıyla uyguladık. SecA-SecYEG sisteminde, preprotein bağlanma bölgesini tanımlamak ve bağlı sinyal dizisi bölgesinin yerel konformasyonunu belirlemek için FRET haritalama yöntemlerini kullandık. Bu çalışma, uygun etiketleme alanlarının belirlenmesi, doğal olmayan amino asit kalıntıları dahil olmak üzere olası etiketlerin tartışılması, etiketleme prosedürleri, ölçümlerin nasıl yapılacağı ve verilerin yorumlanması dahil olmak üzere FRET haritalama çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gereken adımları özetlemektedir.

Bu çalışma, preproteinin SecYEG kanalına yerleştirilmesinden önce preprotein bağlanma bölgesinin SecA üzerindeki yerini belirlemeye odaklanmıştır. Bağlanma bölgesini haritalamak için, preproteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasında FRET deneyleri yapıldı (Şekil 1A-D). Elde edilen mesafelerden ve SecA, SecYEG ve preproteinin üç boyutlu yapılarından, preprotein bağlanma bölgesinin yeri tahmin edildi. Bu ölçümler...

Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Ligand bağlanma bölgelerinin, alt birim oryantasyonunun, ligand bağlanması ile ilişkili konformasyonel değişikliklerin ve proteinlerin dinamik hareketlerinin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin veren bir FRET haritalama metodolojisi geliştirdik. Bu tekniğin bir avantajı, çözelti içinde gerçekleştirilebilmesi ve moleküllerin serbestçe hareket edebilmesidir. Bu teknikle ölçülen mesafeler biyolojik sistemler için uygundur.FRET birçok sistem için geniş çapta uygulanabilir. Haritalama, herhangi bir biyomoleküler sistemdeki yapısal ve dinamik değişikliklerin izlenmesini geliştirir ve özellikle üç boyutlu yapısal bilgi varsa etkilidir. Proteini saflaştırdıktan sonra, en zor kısım yüksek verimlilikle etiketlemek ve serbest boyayı çıkarmaktır.Deneyler için, mümkün olduğunca az serbest boya elde edilmesine yardımcı olur. Başlamak için, cezalandırıcı bağlanma bölgesinin 25 ila 75 angstromu içinde ve proteinin nispeten statik bölgelerinde etiketleme bölgelerini seçin. Mesafe, kullanılacak belirli FRET boya çiftini belirleyecektir.Etiketleme bölgelerini, birbirinden nispeten farklı olan protein bölgelerinde bulun. Böylece siteler bir üçgenin köşelerini tanımlar ve cezai bağlama bölgesi merkezde bulunur. R0 değerlerini ölçmek için, istenen küvet boyutuna ve hacmine bağlı olarak, aynı toplam protein konsantrasyonunda iki protein örneği hazırlayın.Biri sadece donör boya ile etiketlenmiş protein ile, diğeri ise sadece alıcı boya ile etiketlenmiş protein ile. Florometreyi açın ve spektroflorometre kullanıyorsanız, FluorEssence yazılımında spektral toplama ve analiz programını açın. Bilgisayarı cihaza bağlamak için kırmızı M'ye tıklayın ve Emisyon spektrumları'nı seçin.Toplama deneyi menü öğesini kullanarak uyarma dalga boyu, emisyon tarama aralığı, sıcaklık ve numune konumunuzu değiştirme gibi tarama parametrelerini girin. RTC'ye tıklayın ve makalede açıklandığı gibi optimize edilmiş cihaz ayarları, boyanın emme maksimumunda ayarlanmış bir uyarma dalga boyu kullanarak zirvedeki floresan emisyonunu izleyerek. Donör etiketli protein örneğini numune tutucuya yerleştirin ve numuneyi boya absorpsiyon maksimumunda heyecanlandırarak ve emisyon zirvesini tarayarak yalnızca donör boyasıyla etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını oluşturmak için çalıştır'ı tıklayın.Taramayı zirvenin sonundan 25 ila 50 nanometre sonra uzatarak tarama için bir taban çizgisi oluşturun. Metin makalesinde açıklandığı gibi, farklı konsantrasyonlardaki numuneler üzerinde absorptsiyonlar ve floresan ölçümleri yaparak sadece donör proteininin kuantum verimini ölçün. Donör sadece protein, alıcı sadece protein ve donör-alıcı protein örneklerini aynı konsantrasyonda hazırlayın.Floresan emisyon spektrumları oluşturmak için sadece donör taramasını edinin. Çözeltiyi donör boya emiliminde maksimumda uyarın ve donör ve alıcı emisyon zirvelerini tarayın. Numuneyi sadece alıcı proteinle değiştirin veya numuneyi değiştirin, konumunuzu sadece alıcı proteini içeren küvete değiştirin.Yalnızca alıcı boya ile etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını alın. Numuneyi donör uyarma dalga boyunda uyarın. Numuneyi donör-alıcı protein numunesine değiştirin veya numuneyi donör-alıcı etiketli proteini içeren küvete değiştirin.Aynı ayarları kullanarak donör-alıcı protein numunesinin emisyon taramasını alın. Tüm spektrumlar için, taramanın sonunda ölçülen arka plan sayılarını çıkararak arka plan floresansını düzeltin. Komutları doğrudan komut dosyasından komut penceresine uygun mesafe bilgileriyle girerek mesafeleri yapıya eşlemek için PyMOL gibi bir 3B grafik görüntüleme programı kullanın.Ölçülen her mesafe ve ilişkili hata için bir kabuk oluşturun. Konumu farklı mermilerin kesişimi boyunca haritalayın. Sinyal peptidi bağlanma bölgesi, SecA ve SecYEG üzerindeki üç farklı konum ve sinyal peptidi üzerindeki dört farklı konum kullanılarak haritalandı.Ön proteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasındaki FRET deneyleri, protein öncesi bağlanma bölgesini ve yönünü haritalandırır. Sinyal peptidinin cezalandırıcı bağlanma bölgesi daha önce iki sarmal parmak olarak tanımlanmıştı ve SecA C-terminal kuyruğu iki sarmal parmağa paralel bir oryantasyon önerdi. SecA37 ile PhoA2 ve PhoA22 arasındaki kararlı durum FRET spektrumları elde edildi.Donör yoğunluğundaki azalma, PhoA22'den daha fazla enerjinin aktarıldığını göstermiştir. SecA2'den daha uzakta bulunan PhoA37 sitesine göre. Zaman çözülmüş floresan bozunma spektrumları, donör-alıcı kompleksinin, bir mesafe ile ilişkili enerji transferi ile tutarlı olarak daha kısa bir homojen bozunmaya sahip olduğunu göstermiştir.SecA PhoA2 kalıntısı ile üçgen bölgeler arasında inşa edilen FRET mesafe kabukları, her bir kabuğun yeşil renkle gösterilen varsayılan bağlanma bölgesi olan iki sarmal parmağıyla kesiştiğini göstermiştir. Kesişen alan her FRET kabuğundan daha küçüktür ve helisel iskeleden büyük bir katkı içerir. PhoA2 kalıntısı ile etiketlenmiş bölgeler arasında belirlenen FRET mesafe kabukları, iki sarmal parmağın ucuna ve SecYEG kanalının ağzına daha yakın bulunan daha küçük bir alanı tanımlar.Bu kesişen alan, PhoA2'den iki sarmal parmağın karşı ucunda yer almaktadır. Göz önünde bulundurulması gereken önemli şeyler, ilgi alanını üçgenleştirmek, her bir bölge için kuantum verimini ölçmek ve tüm serbest boyayı çıkarmak için etiketleme alanlarının doğru seçimini içerir. Bu yöntem, NMR veya X-ışını kristalografisi gibi yöntemlerle elde edilen yapısal bilgilerle uyumludur.FRET sonuçları yapısal bir bağlama yerleştirildiğinde, mevcut bilgileri geliştirebilir.

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Üç tek dalga boyu kısa darbeli lazerler bir arada tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) oluşturmak için kullanılır. Bu sinyaller arasındaki fark, aksi takdirde tutarlı Raman sinyalleri algılamak için zor zayıf Raman sikliklerin görüntüleme sağlayan gelişmiş hassasiyet sağlar.

Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Bu kağıt filtre enerji görüntüleme ve elektron tomografi birleştiren 3D kimyasal haritalar elde etmek için bir protokolünü açıklar. Diğer görüntüleme teknikleri tarafından ayırt etmek zor öğeleri oluşturduğu iki katalizör destekler kimyasal dağılımı incelenmiştir. Her uygulama örtüşen kimyasal elementler - sırasıyla aralıklı iyonlaşma kenarları eşleme oluşur.

3D kimyasal haritalar tarafından enerji elde etme transmisyon elektron mikroskobu tomografi filtre

Burada sunulan HJ çözünürlüğü çalışma için tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi gerçekleştirmek için bir protokoldür. Dissosilasyon sabitlerini belirlemek için iki renkli alternatif uyarma kullanılır. Tek renkli zaman atlamalı smFRET daha sonra HJ çözünürlüğünden önce çalışma süresi dağılımını elde etmek için gerçek zamanlı dekolte tahlillerinde uygulanır.

HOLLIday Kavşak Çözünürlüğünün GEN1 Tarafından Gerçek Zamanlı İncelenmesi için Tek Moleküllü Förster Rezonans Enerji Transfer Yöntemleri

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

Geniş bant uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskobu ile kimyasal görüntüler elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Diferansiyel çok kanallı kilitleme tespiti ile çalışan bir SRS mikroskobuna dayanan protokol, numune hazırlamayı, SRS cihazının ayarlanmasını ve kimyasal olarak heterojen numunelerin farklı bileşenlerini çözmek için kemometriyi açıklar.

Geniş Bant Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobuna Dayalı Multipleks Kimyasal Görüntüleme

Protokol, mutasyonel profilleme deneyleri için RNA'nın dimetil sülfat ile modifiye edilmesi için talimat sağlar. İki alternatif kütüphane hazırlama yöntemi ile in vitro ve in vivo problama içerir.

RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

Keşfedin FRET haritalama yöntemiyle proteinlerdeki ligand bağlanma bölgelerini ve konformasyonel değişiklikleri çözüm ortamında nasıl tanımlayacağınızı. Bu teknik biyomoleküler dinamikleri yapısal biyoloji çalışmalarında etkili şekilde izlemenizi sağlar.

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

Daha fazla video keşfet