Name: Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Keşfedin Caenorhabditis nematodlarının doğal ortamdan izolasyonu ve tanımlanması için yüksek ölçeklenebilir bir yöntem. Mobil veri toplama ve bulut tabanlı veritabanları kullanılarak ekolojik araştırmalar için doğru ve verimli bir yaklaşım sunulmaktadır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Northwestern Üniversitesi'nden başlangıç fonları ve her ikisi de E.C.A.'ya verilen Ulusal Bilim Vakfı KARİYER Ödülü (IOS-1751035) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemektedir.

Bu protokol, dikkatle yürütülmesi gereken kritik adımları içerir. Örneğin, saha ve izolasyon ekiplerinin, sahadan numune toplamadan veya laboratuvardaki numunelerden nematodları izole etmeden önce uygulamada doğru toplama projesini seçmeye özen göstermeleri önemlidir. Yanlış toplama projesinin seçilmesi durumunda, hatalı veri kayıtları çevrimiçi kayıt düzenleme araçları kullanılarak Dayanak noktası veritabanında en iyi şekilde düzeltilir. Bu süreç, yanlış yerleştirilmiş birçok kayıt için sıkıcı olabilir. Ancak, veritabanı kayıtlarda yapılan değişiklikleri saklar, böylece toplama ve yalıtım kayıtlarının tam olarak denetlenmesi mümkün olur. Bu protokoldeki diğer kritik adımlar, sahadan alınan örneklerin ve bu örneklerden izole edilen nematodların işlenmesini içerir. Caenorhabditis nematodlarının numune alma ve sevkiyat adımlarında hayatta kalmasını sağlamak için, numunelerin sıcaklığı 4 °C ile 25 °C arasında tutulmalıdır. 25 °C'nin üzerindeki sıcaklıklar C. elegans14'te steriliteye neden olabilir. Nematodların kaybını en aza indirmek için numunelerin toplama torbalarından toplama plakalarına mümkün olduğunca beş gün içinde aktarıldığından emin olun. Nematodlar izole edildikten sonra, yok olmadan önce genotiplendirilmeleri ve kriyokorunmuş olmaları çok önemlidir. İki ila üç haftalıktan daha eski olan S plakalarında canlı nematodlar bulmak zordur, çünkü mantar ve bakteriyel kontaminasyon S plakalarını kabul edilemez hale getirebilir.
Bu protokol, araştırmacıların sahadayken toplamak isteyebilecekleri farklı veri türlerini barındıracak şekilde kolayca değiştirilebilir. Örneğin, uygulama düzenleme için Fulcrum'un çevrimiçi GUI'sini kullanarak 'Nematod alan örnekleme' uygulamasını yeni veri giriş alanlarıyla özelleştirmek kolaydır. Ayrıca, easyFulcrum adlı veri analiz paketi, yeni verileri işlerken bu düzenlemelere uyum sağlayabilir15. Kullanıcıların çekici bulabileceği bir diğer değişiklik, alanda farklı bir örnekleme yöntemi kullanmaktır. Ayrık substratları örneklemek yerine, araştırmacılar birden fazla substrat tipi içeren daha geniş alanları örneklemek isteyebilirler. Bu daha büyük numuneler laboratuvarda en iyi şekilde Baermann hunisi veya tepsi ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak işlenir13. Daha da önemlisi, C-etiketlerinin ve S-etiketlerinin kullanımı bu teknikler için hala geçerlidir ve bu nedenle mobil uygulamalarla uyumludur.
Bu protokolün birincil sınırlamaları, laboratuvarda izolasyondan önce nematodların kullanım süresi ile ilgilidir. İlk olarak, numune toplama ve nematod izolasyonu arasındaki gecikme süresi, toplama sırasında nematodların gelişim aşamalarını belirli bir numuneye kaydetmeyi imkansız kılar. İkincisi, erkeklerin sıklığı ve doğadaki geçiş, Caenorhabditis nematodlarının kendini geliştirmesi için anahtar evrimsel sorulardır10. Bu yöntem bu soruları ele almak için uygun değildir, çünkü nematodların izolasyondan önce birden fazla nesilden geçmiş olması muhtemeldir. Gecikmiş izolasyon, doğadaki erkek sıklığının doğrudan kanıtının imkansız olduğu anlamına gelir. Ayrıca, genotipleme adımları sırasındaki çok kuşaklı gecikme, bir nematod suşu dizilenmeden önce genomik geçiş kanıtının (heterozigotluk) aşınacağı anlamına gelir. Doğadaki heterozigotluğu tanımlamak için, doğrudan doğadan izole edilmiş bir nematod tarafından üretilen yavrular dizileme için kullanılır2. Bu protokolün bir diğer potansiyel sınırlaması, kendi kendine Caenorhabditis'in tanımlanmasına yönelik önyargılı olmasıdır. Bunun nedeni, kendi kendine çalışan türlerin izole nematodlarının, zorunlu geçitlerden daha fazla çoğalma şansına sahip olmasıdır; bu, yalnızca döllenmiş bir dişi izole edildiğinde çoğalacaktır.
Bu toplama yöntemi, varolan toplama protokollerini temel alır13,14. Bu tekniğin en büyük ilerlemesi, büyük ölçekli toplama projeleriyle ilişkili çok miktarda ekolojik ve moleküler verinin organizasyonunu kolaylaştırmak için mobil teknolojinin ve özelleştirilmiş yazılımın kullanılmasıdır. Bu toplama protokolü kullanılarak üretilen ekolojik veriler, Caenorhabditis türlerinin doğal popülasyonları için olağanüstü soruları ele almak için kullanılabilir. Örneğin, bu yöntemle üretilen veriler, Hawaii Adaları'ndaki türlerin niş tercihlerini keşfetmek için kullanılmıştır. Dahası, kriyokorunmuş nematodların genomlarını sıralayarak, araştırmacılar genetik varyasyon kalıplarının ekolojik verilerle nasıl ilişkili olduğunu araştırabilirler. Bu tür araştırmalar, Caenorhabditis popülasyonlarındaki yerel adaptasyonun imzalarını ortaya çıkarabilir ve doğal bağlamlardaki genetik çeşitliliğin önemi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir8. Caenorhabditis nematodlarındaki birçok genin işlevsel bir şekilde anlaşılması için, ekolojik çalışmalara ihtiyaç vardır11. C. elegans için bile, genlerin büyük bir kısmı, dizilenen ilk çok hücreli hayvan ve Dünya'daki en iyi çalışılmış hayvanlardan biri olmasına rağmen, işlevsel ek açıklamalardan yoksundur. Bu toplama protokolü, vahşi Caenorhabditis nematodlarının toplanmasını ve ekolojilerinin ve doğal genetik çeşitliliğinin incelenmesini kolaylaştırarak bu bilgi boşluğunun giderilmesine yardımcı olmak için geliştirilmiştir.

Son yirmi yıl, Caenorhabditis nematodlarının ekolojisine artan bir ilgi getirmiştir. Bu çalışmalardan, serbest yaşayan Caenorhabditis türlerinin hem ılıman hem de tropikal bölgelerdeki geçici mikro habitatlardan izole edilebildiğini, burada bazen de sempatry'de ayrışan bitki materyali ile ilişkili mikrobiyal çiçeklerle beslendiklerini biliyoruz1,2,3,4,5,6,7,8 . Ayrıca, cinste kendi kendine döllenmenin yakınsak evriminin üç kez gerçekleştiğini ve kendiliğinden, C. briggsae, C. elegans ve C. tropicalis9,10 için baskın üreme şekli olduğunu öğrendik. Bu benciller arasında C. elegans, Dünya'da en çok çalışılan hayvanlardan biridir ve araştırmacılar tarafından biyolojide kritik ilerlemeler yapmak için kullanılmıştır. Daha da önemlisi, diğer kendikendine özgü Caenorhabditis türleri, C. elegans'ın deneysel avantajlarının çoğunu paylaşır ve cinste karşılaştırmalı çalışmaları hızla ilerletmektedir. Bununla birlikte, bu nematodların vahşi doğadaki gizemli doğası, ekolojilerini ve doğal çeşitliliğini incelemeyi zorlaştırır, bu da genlerinin biyolojik işlevlerini ve evrimin türler arasındaki genetik çeşitliliği nasıl şekillendirdiğini anlamak için kritik öneme sahiptir10,11.
Vahşi doğada Caenorhabditis nematodlarının ekolojisini incelemenin en büyük zorluğu küçük boyutlarıdır; yetişkin nematodlar genellikle 1 mm uzunluğunda veya daha azdır. Bu zorluk, araştırmacıların vahşi doğadaki substratları örneklemelerini ve vahşi doğada hayvanları gözlemleme yeteneği olmadan ilgilenilen nematodları laboratuvardaki substratlardan ayırmaya çalışmalarını gerektirir. Eğitimli uzmanlar bile, kendi kendine hareket eden Caenorhabditis nematodlarını mikroskop altında diğer serbest yaşayan nematodlardan ayırt etmeyi zor bulduklarından, nematodlar tipik olarak substrattan çıkarılır, izole edilir ve yerleşik moleküler barkodlar kullanılarak dizi kimliği ile tanımlanmadan önce çoğalmaya bırakılır3,12,13,14 . Her bir nematodu bu şekilde işlemek için gereken zaman ve çaba örgütsel bir zorluk teşkil etmektedir, çünkü araştırmacılar laboratuvarda izole edilen her nematodun kimliğini tam substrata ve sahada örneklenen ilgili ekolojik verilere kadar izleyebilmelidir. Burada, sahadan kendi kendine gelen Caenorhabditis nematodlarını verimli bir şekilde toplamak ve tanımlamak ve bu izolatları ilişkili mekansal ve ekolojik verileriyle yüksek ölçekte sadık bir şekilde bağlamak için adım adım bir süreç açıklıyoruz.
Bu toplama yöntemi, mobil veri toplama platformlarını, bulut tabanlı veritabanlarını ve R yazılım ortamını kullanarak ekolojik araştırmaların ölçeğini ve doğruluğunu artırır. Fulcrum, çoğu mobil cihazla çalışan ve kullanıcıların konum tabanlı verileri toplamak ve düzenlemek için özel uygulamalar oluşturmasına olanak tanıyan özelleştirilebilir bir veri toplama platformudur (https://www.fulcrumapp.com). Bu protokol, sahadan mekansal olarak açık ekolojik verileri düzenlemek ve bu verileri laboratuvarda izole edilen nematodların kimliğiyle doğru bir şekilde ilişkilendirmek için özelleştirilmiş veri toplama uygulamalarının nasıl kullanılacağına dair ayrıntılı talimatlar sağlar. Protokol ayrıca, yerleşik moleküler barkodları kullanarak kendi kendine Caenorhabditis nematodlarının nasıl verimli bir şekilde tanımlanacağını da açıklar. Bu yöntemlerden elde edilen veriler, doğal Caenorhabditis popülasyonlarının ekolojisini ve genetik çeşitliliğini keşfetmek için beraberindeki R yazılım paketi easyFulcrum15 ile basit ve tekrarlanabilir bir şekilde işlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Yapışkanlı etiketler</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>C-etiketlerinin ve S-etiketlerinin yazdırılması</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thomas Scientific</td><td>C748D75</td><td>agaroz jel hazırlama</td></tr><tr><td>Sırt çantası</td><td></td><td></td><td>Her ekip üyesinin günlük ekipman, numune, yiyecek ve su tutması için bir sırt çantası.</td></tr><tr><td>Karton kutular</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>S-plakaların saklanması</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>NA</td><td></td><td>NA Neamtod lizisi, SSU ve ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Toplama torbaları</td><td>Fermuarlı</td><td>kilit NA</td><td>Yüzeylerin toplanması</td></tr><tr><td>Dijital sıcaklık/nem ölçer</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>Ortam sıcaklığı ve neminin ölçülmesi</td></tr><tr><td>Dağıtım kapsamı</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Nematod izolasyonu, lizis</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık rezervuarlar</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>PCR ana karışımlarının alıntılanması ve boya</td></tr><tr><td>DNA merdiveninin yüklenmesi, 1 KB artı</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>SSU ve ITS2 PCR ürünlerinin görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>PCR ana karışım bileşeni</td></tr><tr><td>easyFulcrum R paketi</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Toplama verilerinin işlenmesi için bir R paketi http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>EDTA çözeltisi (0,5 M pH 8,0)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Tarif için ek tablo 3'e bakın</td></tr><tr><td>Etanol (%95)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Numunelerin platasyonu, kaşık sterilizasyonu</td></tr><tr><td>Etidyum bromür çözeltisi (10 mg/mL)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>SSU ve ITS2 PCR ürünlerinin</td></tr> <tr><td>görselleştirilmesiMobil cihaz NA NA için harici pil şarj cihazı</td><td></td><td></td><td>iPhone veya Android için harici pil şarj cihazı ve şarj kablosu</td></tr><tr><td>Şişe (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501500</td><td>agaroz jel hazırlama</td></tr><tr><td>Gıda</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Buna göre paketleyin</td></tr><tr><td>Jel elektroforez aparatı</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>SSU ve ITS2 PCR ürünlerinin görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>Jel elektroforez güç kaynağı</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>SSU ve ITS2 PCR ürünlerinin görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>Jel yükleme boyası, 6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>SSU ve ITS2 PCR ürünlerinin görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>ITS2 astar seti</td><td>NA</td><td>NA</td>, <td>oECA1687 = ileri astar CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = ters astar GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>ITS2 sıralama astarı</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA306 = ileri astar CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>Lizis tamponu</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Nematod lizisi, tarif protokolüne bakın</td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>NA</td><td>NA</td><td>agaroz jel hazırlama</td></tr><tr><td>Mobil cihaz</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Uçak modunda şarj edilmiş telefon. Fulcrum uygulaması GPS konumları, resimlerden çıkarılan GPS konumlarına kıyasla yanlıştır. Bu ayar, daha az güç kullanmanızı ve daha hassas GPS ölçümleri almanızı sağlar.</td></tr><tr><td>NGMA plakaları, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>C-plakaları, NGMA plaka protokolü için Andersen et al. 2014'e bakınız.</td></tr><tr><td>NGMA plakaları, 3,5 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td><td>S-plakaları, NGMA plaka protokolü için Andersen ve ark. 2014'e bakın.</td></tr><tr><td>Temassız kızılötesi termometre</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>Yüzey sıcaklığının ölçülmesi</td></tr><tr><td>Kağıt havlular</td><td>NA</td><td>NA Torbalı</td><td>bir numunedeki fazla nemi emmek için kağıt havlular.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Plaka sızdırmazlığı</td></tr><tr><td>PCR yapışkan folyo</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>PCR yapışkan folyo</td></tr><tr><td>PCR tamponu (10x)</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7</td><td>PCR ana karışım bileşeni</td></tr><tr><td>PCR plakaları (96 kuyulu)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>SSU ve ITS2 PCR'ler</td></tr><tr><td>Kalem</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaşıklar</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Numunelerin kaplanması</td></tr><tr><td>Platin toplama</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Nematod izolasyonu, lizis</td></tr><tr><td>Önceden etiketlenmiş kilitli toplama torbaları</td><td>NA</td><td>NA</td><td>C-etiketli barkodlarla önceden etiketlenmiş kilitli plastik torba demetleri. Her paket, bir lastik bantla sarılmış 25 barkodlu çanta içermelidir.</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>Nematod lizisi, R yazılımı kullanılmadan hemen önce lizis tamponuna eklenir</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>R yazılımı: İstatistiksel hesaplama için bir dil ve ortam https://www.R-project.org/</td></tr> <tr><td>Yumuşak soğutucu çanta ve buz torbası</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Collection soğutucuları ve soğutucu paketleri, ortam sıcaklığı 25 ° C'nin üzerinde olduğunda numuneleri serin tutmak için.</td></tr><tr><td>Yedek piller</td><td>NA</td><td></td><td>NA Numune alma ekipmanı için ekstra piller</td></tr><tr><td>SSU astar seti</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1271 = ileri astar TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = ters astar CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>Şerit tüp kapakları (12 kuyulu)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>Nematod lizis</td></tr><tr><td>Şerit tüpleri (12 kuyulu)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>Nematod lizisi</td></tr><tr><td>TAE tamponu (1x)</td><td>NA</td><td></td><td>NA SSU ve ITS2 PCR ürünlerinin görselleştirilmesi. Tarif için ek tablo 3'e bakın</td></tr><tr><td>Taq polimeraz</td><td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>PCR ana karışım bileşeni</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Neamtode lizisi, SSU ve ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Su</td><td>NA</td><td>NA Paketi</td><td>buna göre</td></tr></tbody></table>

kendinden Çıkan caenorhabditis nematodlarının ekolojik araştırmalarını gerçekleştirmek için yüksek oranda Ölçeklenebilir bir yaklaşım

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans , biyolojideki en önemli model organizmalardan biridir, ancak son zamanlarda araştırmacılar doğal ekolojisine odaklanmışlardır. C. elegans hakkındaki bilgilerin doğal bağlamındaki göreceli seyrekliği, doğadaki küçük nematodun tanımlanmasında yer alan zorluklardan kaynaklanmaktadır. Bu zorluklara rağmen, C. elegans'ın ekolojisine giderek daha fazla odaklanmak, laboratuvar dışındaki yaşamı hakkında çok sayıda yeni bilgiye neden olmuştur. Doğada C. elegans için yoğunlaşan araştırmalar, birçok yeni Caenorhabditis türünün keşfine katkıda bulundu ve konjenerik nematodların, çürüyen bitki materyali ile ilişkili mikrobiyal çiçeklerle beslendikleri vahşi doğada sıklıkla birlikte yaşadıklarını ortaya koydu. Yeni türlerin tanımlanması, erkeklerin androdioecious çiftleşme sisteminin ve kendi kendini dölleyen hermafroditlerin Caenorhabditis'te bağımsız olarak üç kez geliştiğini de ortaya koymuştur. Diğer iki kendini-bilen tür, C. briggsae ve C. tropicalis, C. elegans'ın deneysel avantajlarını paylaşır ve kendi kendine döllenme de dahil olmak üzere önemli özelliklerin mekanik temeline ilişkin karşılaştırmalı çalışmalar yapılmasını sağlamıştır. Bu ilerlemelere rağmen, bu önemli türlerin ekolojisi ve doğal çeşitliliği hakkında öğrenilecek çok şey var. Örneğin, genlerinin çoğu için hala işlevsel bilgiden yoksunuz, bu da yalnızca doğal ekolojilerinin anlaşılmasıyla elde edilebilir. Caenorhabditis nematodlarının ekolojik araştırmalarını kolaylaştırmak için, nematodları vahşi doğadan toplamak için oldukça ölçeklenebilir bir yöntem geliştirdik. Yöntemimiz, araştırmacıların vahşi doğadan nematodları toplama, ilişkili ekolojik verileri kaydetme ve moleküler barkodları kullanarak vahşi nematodları tanımlama yeteneklerini geliştirmek için mobil veri toplama platformlarından, bulut tabanlı veritabanlarından ve R yazılım ortamından yararlanır.

Bu protokol, Hawaii ve Kaliforniya da dahil olmak üzere birçok yerden Caenorhabditis nematodlarını toplamak için kullanılmıştır. Caenorhabditis nematodları için izolasyon başarı oranı, toplama yerine, iklime, örnekleme deneyimine ve örneklenen substrat tiplerine göre değişir. Protokol, dokuz toplama projesinin birkaç yıl ve mevsim boyunca yürütüldüğü Hawaii Adaları'nı kapsamlı bir şekilde örneklemek için kullanılmıştır. Caenorhabditis türlerinin kendi kendine izolasyon başarı oranları C. briggsae (4.506 numunenin 162'si, % 3.6) ve C. elegans (4.506 numunenin 163'ü,% 3.6) için neredeyse aynıdır ve C. tropicalis (4.506 numunenin 26'sı,% 0.58)8 için çok daha düşüktür. Kendi kendine çalışan türlerin her biri, diğer substrat kategorilerine göre çürüyen meyve ve çiçek substratları üzerinde zenginleştirilmiştir. Araştırmacı substrat tercihlerini karakterize etmek yerine başarı oranını en üst düzeye çıkarmaya çalışıyorsa, çürüyen meyve ve çiçek substratlarını örnekleyin. Bununla birlikte, başarı oranı, seçilen substratın kalitesine göre değişir. Örneğin, meyve ve çiçek substratları arasında, çok kuru, ıslak veya taze olan substratlar muhtemelen Caenorhabditis nematodları vermeyecektir.
Bu toplama protokolünün ölçeklenebilirliği, tek bir araştırmacı çiftinin vahşi doğadan toplayabileceği koleksiyon sayısından açıkça anlaşılmaktadır. Örneğin, Ekim 2018'de, bu toplama protokolünü kullanan bir çift araştırmacı, iki Hawaii Adası'ndaki birden fazla yerden 7 gün içinde toplam 1.000'den fazla örnek toplayabildi. Bu saha ekibi, örnekleri bir gecede laboratuvara gönderdi ve sekiz araştırmacıdan oluşan bir ekip, geldiklerinde örneklerden 2.000'den fazla nematodu izole etti. Bu protokolün önemli bir avantajı, sahada ihtiyaç duyulan ekipman ve personeli azaltarak uzak yerlerde örnekleme ile ilişkili maliyeti en aza indirmesidir. Bu protokolü kullanarak, küçük bir saha ekibi örneklemeye odaklanabilirken, izolasyon ekibi numuneleri kendi kurumlarında nematodları izole etmek için mikroskopları ve agar plakalarını parçalamak gibi kırılgan ve ağır ekipmanlar kullanarak işleyebilir. Ayrıca, mobil veri toplama uygulamasının uygulanması, numunelerle ilişkili tüm saha verilerinin doğrudan C-etiketine bağlanmasına izin verir, bu da yalıtım ekibinin numuneleri işlerken saha ekibinden bağımsız olarak çalışmasını sağlar.
Bu toplama protokolünü kullanan araştırmacılar, bir toplama projesinden önce nematodları izole etmek için gereken çabayı göz önünde bulundurmalıdır. İzolasyon ve tanımlama adımları hız sınırlayıcıdır ve küçük bir toplama ekibi izolatörleri numunelerle hızlı bir şekilde boğabilir. Ayrıca, birçok koleksiyonu işlemek için gereken laboratuvar alanı, devam eden araştırmalara müdahale edebilir (Şekil 3). Ek olarak, bazı izole nematodlar genotip için ek çaba gerektirir. Örneğin, izolatların yaklaşık% 2'si ilk lizis girişiminden sonra SSU PCR astar seti ile amplifikasyonda başarısız olur ve lizis malzemesinin ITS2 astar seti ile amplifikasyon için uygun olduğundan emin olmak için yeniden lize edilmelidir (Şekil 8). Ayrıca, izolatların yaklaşık% 3'ü, Sanger dizilemesinin ilk turundan sonra kaliteli diziler üretememektedir. Bu izolatlar için, başka bir lizis turu, ITS2 PCR ve Sanger dizilimi sıklıkla gereklidir, bu da izolasyon ekibi için teslim süresini artırabilir. Daha da önemlisi, dizi kimliği tek başına yeni bir Caenorhabditis türünü haklı çıkarmak için yeterli kanıt değildir (Şekil 7). Bir izolatın yeni bir Caenorhabditis türü olarak yetiştirilmesini uygun şekilde haklı çıkarmak için, çiftleşme deneyleri yapmak ve daktilo edilmiş bir örnek oluşturmak için ek çaba gösterilmelidir13. Yazılan numunenin resmi bir morfolojik açıklaması da tercih edilir, ancak gerekli değildir3. Birlikte, bu hususlar, bu toplama protokolünü benimseyen araştırmacıların, bir toplama projesi başlamadan önce kaynakların uygun şekilde tahsis edilmesini sağlamak için izolasyon ve tanımlama adımlarının deneme testlerinden yararlanacağını göstermektedir. Daha da önemlisi, küçük toplama projeleri bile bu protokolden yararlanabilir, çünkü süreç yüksek oranda tekrarlanabilir ve veriler laboratuvar grupları arasında kalite kontrol amacıyla kolayca denetlenebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg"> Şekil 1: Substrat örnekleri. (A) İdeal çürüyen meyve görüntünün ortasında gösterilmiştir (1), meyve neredeyse tanınamaz. Yakınlarda daha az çürümüş meyve gösterilmiştir; taze düşmüş meyveleri örneklemekten kaçının (2). (B) İdeal olarak ayrışmış bir çiçek en üstte gösterilir (3). Taze düşmüş çiçekleri örneklemekten kaçının (4). (C) Kuru yaprakların üst tabakasının altındaki koyu yaprak çöpü, Caenorhabditis nematodlarının kendi kendine örneklenmesi için örnekleme yaparken idealdir (5). Kuru yaprak çöpü örneklemekten kaçının (6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg"> Şekil 2: Nematod Field Sampling mobil uygulaması . (A) Fulcrum'daki bir Apple cihazında Nematod Field Sampling uygulamasını açtıktan sonraki ilk ekran. Sağ alttaki kırmızı ok, yeni bir koleksiyon kaydı oluşturmak için kullanılan + düğmesine işaret eder. (B) Bir Apple aygıtında gösterilen yeni bir koleksiyon kaydı örneği. Kırmızı ok, koleksiyon kaydı ekranının üst kısmındaki 'Proje' alanını işaret eder. Sahada örnekleme yaparken doğru projeyi seçtiğinizden emin olun. Proje alanı, varsayılan olarak sonraki koleksiyon kayıtları oluşturulurken kullanılan son projeye ayarlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg"> Şekil 3: Numunelerin kaplanmasından önce düzenlenen toplama torbaları ve toplama plakaları. Bu şekilde, soldaki C etiketli toplama torbalarındaki örnekler gösterilmektedir. Her toplama çantasının üstünde eşleşen C etiketli 10 cm'lik bir plaka bulunur. Sağ tarafta, toplama torbalarından transfer edildikten sonra örnek materyal içeren 10 cm'lik toplama plakaları bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg"> Şekil 4: Düzgün bir şekilde aktarılmış bir numuneye sahip bir toplama plakası (C-plakası). Bakteri çimlerinin kenarına yerleştirilmiş ayrışan meyveli 10 cm'lik bir C plakası. C-etiketi plaka kapağına tutturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg"> Şekil 5: Nematod izolasyon mobil uygulaması . (A) Fulcrum mobil uygulamasındaki uygulama seçim ekranı. Kırmızı ok, Nematod İzolasyonu uygulamasına işaret eder. (B) Fulcrum'daki bir Apple aygıtında Nematod İzolasyonu uygulamasını açtıktan sonraki ilk ekran. Sağ alttaki kırmızı ok, yeni bir yalıtım kaydı oluşturmak için kullanılan + düğmesine işaret eder. (C) Bir Apple aygıtında gösterilen yeni bir yalıtım kaydı örneği. Kırmızı ok, yalıtım kaydı ekranının üst kısmındaki 'Proje' alanını işaret eder. İzolasyon sırasında doğru projeyi seçtiğinizden emin olun. Proje alanı, varsayılan olarak sonraki yalıtım kayıtları oluşturulurken kullanılan son projeye ayarlanır. (D) C-etiketi altındaki Seç alanına dokunduktan sonra, kullanıcılar nematodları izole ettikleri C etiketini bulmak için arama düğmesine (kırmızı ok) dokunacaklardır. (E) C-etiketi seçildikten sonra, kullanıcılar cihaz kamerasını kullanarak C-plakasını fotoğraflayacaklardır. (F) Kullanıcılar daha sonra C plakasında nematod olup olmadığını girerler. İzole edilecek nematodlar varsa izolasyon kaydına s-etiketleri eklenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg"> Şekil 6: NCBI BLAST sonuçları sayfası . (1) Tüm dizilerin BLAST sonuçlarını görüntülemek için kullanılan açılır menü. (2) Açılır menüden seçilen geçerli dizinin açıklaması. Bu durumda S-label S-05554 için sonuçlar gösterilir. (3) S-05554 için en iyi BLAST vuruşu gösterilir. Mor metin, bu hizalamanın tıklandığını görselleştirmek için bağlantıyı gösterir. Lütfen olası yeni Caenorhabditis türlerini tanımlamak için hizalamaları gözle incelediğinizden emin olun, yukarıdaki adım 9.8'e bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg"> Şekil 7: NCBI BLAST hizalama görselleştirme örnekleri . (A) C. kamaaina konu dizisine hizalanmış bir yalıtımın ITS2 sorgu dizisine bir örnek. (1) Hizalamanın yüzde kimliği (% 89), en iyi BLAST isabeti için düşüktür. (2) Sorgu ve konu dizisi (G'den A'ya) arasındaki uyumsuzluk. (3) Hizalama algoritması tarafından yapılan konu dizisindeki dört baz çifti boşluğu; sorgudaki veya konudaki boşluklar zayıf hizalamayı gösterir. (4) Hizalamanın merkezinde, birçok uyumsuzluk ve boşluk bulunan genelleştirilmiş bir bölge. Bunun gibi bir bölge, sorgu dizisinin yeni bir Caenorhabditis türünden gelebileceğini düşündürmektedir. Gösterilen, 2017 yılında keşfedilen yeni bir tür olan C. oiwi'nin gerçek bir hizalama örneğidir. (B) Bir yalıtımın ITS2 sorgu dizisi ile bir konu dizisi arasındaki iyi hizalamanın bir örneği. (5) Hizalamanın yüzde kimliği (% 99), bu genellikle sorgu dizisinin özneyle aynı türün bir izolatından geldiği anlamına gelir. (6) Mükemmel kimlikle uyumun merkezi bir bölgesi. Bunun gibi bir bölge, sorgu yalıtımının muhtemelen özneyle aynı tür olduğunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg"> Şekil 8: SSU ve ITS2 PCR ürünleri. Üst jel, 12 temsili numune için SSU astar seti ile üretilen PCR ürünlerini gösterir. Sol tarafta referans olarak bir DNA merdiveni bulunur. Caenorhabditis nematodları için SSU PCR ürünleri yaklaşık 500 bp uzunluğundadır. Örnekler 2-12, SSU astar seti ile güçlendirildi, ancak örnek bir tane yapmadı. Birinci numune için 500 bp SSU amplikonunun olmaması, lizis malzemesinin kalitesiz olduğunu ve numunenin yeniden lize edilmesi gerektiğini düşündürmektedir. Alt jel, üst jelde gösterilen aynı 12 Numune için ITS2 astar seti ile üretilen PCR ürünlerini gösterir. Merdiven ve numuneler her iki jel için de aynı yöndedir. 12 numuneden altısı ITS2 astar seti ile yükselmedi. SSU ve ITS2 bantlarına sahip örnekler Sanger'da sıralanır ve NCBI BLAST algoritması kullanılarak dizi benzerliği ile tanımlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: C-etiketleri. 2500 benzersiz C etiketi içeren bir PDF dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 2: S-etiketleri. 5000 benzersiz S-etiketi içeren bir PDF dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 1: Saha Materyalleri. Nematodları örneklemek için sahada kullanılan malzemelerin bir ambalaj listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 2: PCR tarifleri ve termosikler koşulları. ITS2 ve SSU PCR'ler için PCR tarifleri ve termosikler koşulları <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">tablosu. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 3: Elektroforez tampon tarifleri. 0,5 M pH 8,0 Etilendiamintetraasetik asit çözeltisi (EDTA) ve TRIS-asetat-EDTA (TAE) tampon çözeltisi için bir reçete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu protokol, kendi kendine Caenorhabditis nematodlarının büyük ölçekli ekolojik araştırmalarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin birincil avantajı, doğadan toplanan nematodlarla ilişkili ekolojik ve moleküler verilerin verimli bir şekilde düzenlenmesi ve analiz edilmesidir.

Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Bu protokol, Caenorhabditis nematodlarının doğadan izolasyonunu ve tanımlanmasını kolaylaştırmak ve nematodların doğal ortamıyla ilişkili önemli ekolojik ve çevresel verileri kaydetmek için kullanılabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, mobil veri toplama platformlarından, bulut tabanlı veritabanlarından ve standartlaştırılmış veri işleme işlevlerinden yararlanarak mümkün olan ölçeklenebilirliği ve doğruluğudur. Başlamak için, Caenorhabditis nematodlarını araştırmak için bir yer belirleyin.Bir Fulcrum projesi oluşturmak için, ücretsiz bir eğitim sözleşmesi kullanarak çevrimiçi olarak Fulcrum ile bir hesap oluşturun ve nematod alan örnekleme uygulamasını ekleyin. Ardından nematod izolasyon uygulamasını ekleyin. Koleksiyonları izlemek için bir dizi QR kodu etiketini C-Etiketleri ve nematod yalıtımlarını izlemek için S-Etiketleri olarak yazdırın.C-Etiketlerini paketleme için Ziploc plastik torbalara takın. S-Label setini laboratuvarda kullanılmak üzere saklayın. Fulcrum mobil uygulamasının açılır menüsünden nematod alan örneklemesini seçin ve projede yeni bir kayıt başlatmak için artı tuşuna basın.Alt tabakanın fotoğrafını çekin. C-Label alanına dokunun ve taramayı seçin. Mobil cihaz kamerasını kullanarak toplama çantasındaki barkodu tarayın ve ardından bitti'ye dokunun.Alt tabaka alanına dokunun ve bir alt tabaka türü seçin. Temassız termometreyi kullanarak substratın yüzey sıcaklığını ölçün ve substrat sıcaklık alanındaki değeri kaydedin. Ayrıca ortam sıcaklığını ve nemi ölçün ve kaydedin.Ekranın sol üst köşesindeki kaydet'e dokunarak Dayanak Noktası'nda kaydedin ve kaydedin. Substratı almak için toplama torbasını eldiven olarak ters çevirerek çubuklar veya diğer sert parçalar olmadan substrattan bir çorba kaşığı toplayın, ardından torbayı kapatın. Her Ziploc torba için, torbanın üzerindeki C-Etiketini not edin ve OP50 bakterileriyle lekelenmiş 10 santimetrelik bir plakanın kapağına eşleşen bir C-Etiketi takın.Her toplama torbasından bir çorba kaşığı numuneyi temiz bir plastik kaşık kullanarak C plakalarına aktarın. Dayanak noktası uygulamasında, uygulama menüsünden nematod yalıtımını seçin. Ardından sağ alttaki artı simgesine dokunarak yeni bir yalıtım kaydı yapın.Bir numuneyle ilişkilendirilmiş C-Etiketini bulmak için seç düğmesine dokunun. Arama simgesine dokunun. Ardından C-Label QR kodunu taramak için tarama simgesine dokunun.Diseksiyon mikroskobu ile C plakasında nematodları arayın. Numune üzerindeki nematodların varlığını kaydetmek için numune alanındaki solucanlara dokunun. Nematodlar yoksa, C plakasını parafilm haline getirin ve biyolojik tehlike kutusuna atın.Nematodlar varsa, C plakasından beş adede kadar nematodu izole edin ve her birini kendi S plakasına aktarın. Ardından, bu yalıtım için kullanılan S plakasını girmek için S etiketli plakalar alanına dokunun. Sağ alttaki artıya dokunun.S-Label'a dokunun ve ardından cihaz kamerasını açmak için taramaya tıklayın, ardından S-plakasındaki S-Label QR kodunu tarayın. İzolasyon kaydında tüm bilgiler doğru bir şekilde eklendikten sonra sağ üstteki kaydet düğmesine dokunun, ardından izole nematodlarla S plakalarını parafilme alın ve bunları nematodlarla S plakalarını tutmak için belirlenmiş bir alana koyun. Fulcrum web sitesinde oturum açın ve nematod izolasyon uygulamasını seçin.Nematod izolasyon s_labeled_plates içeren bir zip dosyasını indirmek için dışa aktarıcıya tıklayın. csv dosyası. Vahşi soylu genotipleme şablonu Google E-Tablosu'na gidin ve Google E-Tablosu'nu kopyalayın.Nematod izolasyonundan kopyalanan S-Label'ları s_labeled_plates yerleştirin. csv sütunu genotipleme sayfasına yerleştirin. İzolasyondan 48 saat sonra S plakalarında çoğalan hayvanları kontrol edin.Bir S-plakasında çoğalan hayvanlar varsa, genotipleme sayfasındaki proliferasyon 48 sütununa bir tane girin, ardından S-plakasını 48 saat proliferasyon kutusu one etiketli bir kutuya taşıyın. İzolasyondan 48 saat sonra çoğalmayan S plakalarını, izolasyondan sonraki 168 saatte tekrar kontrol edin. Bir S-plakası şimdi çoğalıyorsa, genotipleme sayfasındaki proliferasyon 168 sütununa bir tane girin ve ardından S-plakasını 168 saat proliferasyon kutusu one etiketli bir kutuya taşıyın.Google E-Tablo'daki genotipi, lize edilecek bir çoğalma kutusuna yalnızca S-Etiketlerini içerecek şekilde filtreleyin, ardından lizis düğümleri aracılığıyla S-Label sütunlarını seçin. Lize edilecek her çoğalma kutusu için bir lizis çalışma sayfası yazdırın. Lize edilecek numuneler için 12 kuyucuklu şerit tüp hazırlayın.Bir şerit tüpün kapağını açın ve tekrarlanan bir pipetleyici ile her kapağa sekiz mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Kaynak plakalardan üç ila beş hayvanı lizis çalışma sayfasında belirtilen kapak konumlarına seçin. Sekiz adede kadar şerit tüp için tekrarlayın ve şerit tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin.Şerit tüp setlerini çıkarın ve termosiklustaki lizis programını çalıştırın. Daha sonra lizatları eksi 80 santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın. Şerit tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve lizis malzemesini buz üzerinde çözün.Lizis malzemesi çözülürken, ITS2 ve SSU master karışımlarını buz üzerinde ayrı tüplerde hazırlayın. Düşük hacimli çok kanallı pipetle PCR plakasındaki uygun kuyucuğa iki mikrolitre lizat ekleyin. PCR'leri uygun termosikler programı ile çalıştırın ve genotipleme sayfasına hangi S-Label'ların ITS2 veya SSU PCR ürünleri verdiğini kaydedin.ITS2 pozitif olan her örnek için, Sanger dizilimi için kalan ITS2 PCR ürününü kullanın ve sıralama platformundan her S-Label için seq çıktı dosyalarını alın. BLAST aramasını başlatmak için bir web tarayıcısında NBCI BLAST web sitesine gidin. Bir Caenorhabditis türüne TAŞAN S plakası dizileri için, tür kimliği sütununa en üstteki BLAST isabetinin tam cinsini ve tür adını girin.Caenorhabditis terminolojisi kurallarını izleyerek suşları benzersiz adlarla adlandırın ve suş adı sütununa gerinim adlarını girin. Verileri işlemek için Fulcrum web sitesine gidin ve ham proje verilerini Fulcrum veritabanından dışa aktarın. Yeni bir R komut dosyası açın ve toplama verilerini işlemek için easyfulcrum vinyetindeki yönergeleri izleyin.NBCI BLAST'ta, S-Label S-05554 için elde edilen sonuçlar, en çok isabet alan kişinin Caenorhabditis briggsae olduğunu gösteriyor. Ek olarak, bazı izole nematodlar genotip için ek çaba gerektirir. Örneğin, izolatların yaklaşık% 2'si ilk lizis girişiminden sonra SSU PCR astar seti ile amplifikasyonda başarısız olur ve lizis malzemesinin ITS2 astar seti ile amplifikasyon için uygun olduğundan emin olmak için güvenilmelidir.Bu prosedürü takiben, araştırmacılar, belirli nematod türlerini barındırma olasılığı en yüksek olan yerleri ve substrat özelliklerini belirlemek için vahşi nematod izolatlarıyla ilişkili ekolojik ve çevresel verileri keşfedebilirler.

a-highly-scalable-approach-to-perform-ecological-surveys-selfing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, gelişimsel olarak senkronize bir steril yetişkin C. elegans popülasyonu üretme yöntemini gösteriyoruz. Örnek protokol, canlı hayvanlarda oksijen tüketim oranlarını incelemek için solucanları senkronize eder.

Nematod Senkronizasyonu: Aynı Gelişim Aşamalarında Solucan Popülasyonları Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Nematodun, Caenorhabditis elegans'ın , nüfusa dayalı bir deneyde çözünür bileşikler için tercihinin otomatik analizini sağlayan bir davranış kayıt kurulumu ve protokolü sunuyoruz. Bu makale bir davranış odasının inşasını, davranışsal analiz protokolünü ve video analiz yazılımının kullanımını anlatıyor.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

Geçerli protokol sıralama ve nüfus yaş eşlemeli temizlik için bir metodoloji içerir Caenorhabditis elegans. Nematodlar araştırma için büyük bir deneysel nüfusa elde etmek için basit, ucuz ve verimli özel yapım aracı kullanır.

Caenorhabditis Elek: Bir düşük teknoloji enstrüman ve küçük çok hücreli organizmalar sıralama yöntemi

Biz yüksek üretilen iş Caenorhabditis elegansbüyük popülasyonlarda fenotipik karakterizasyonu sağlayan geniş görüş alanı nematodunun izleme platformu (WF-NTP) kullanarak iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller mutant suşları veya yüksek ölçeklenebilir bir moda farmakolojik tedaviye yanıt ince davranış değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir.

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Omiks araştırmalarında Caenorhabditis elegans (C. elegans)kullanmak için, karşılaştırmalı analizler için platformlar arasında tek bir numunenin ölçülebileceği büyük solucan popülasyonları oluşturmak için bir yönteme ihtiyaç vardır. Burada, C. elegans popülasyonlarını büyük ölçekli kültür plakalarında (LSCP' ler) kültüre ve nüfus artışını belgelemek için bir yöntem sunulmuştur.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Yabani Caenorhabditis nematodları, genellikle bağırsak lümeninde veya bağırsağı enfekte eden birçok mikropla ilişkilidir. Bu protokol, dauer lütikülün direncinden yararlanarak bağırsağı kolonlaştıran kültürsüz mikropları zenginleştirmek için bir yöntemi detaylandırıyor.

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Bu protokol, alandaki doğal substratlardan canlı nematodları verimli bir şekilde çıkarmak için bir yöntem özetler.

Baermann Huni tarafından Vahşi Nematodların Hızlı İzolasyonu

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Keşfedin Caenorhabditis nematodlarının doğal ortamdan izolasyonu ve tanımlanması için yüksek ölçeklenebilir bir yöntem. Mobil veri toplama ve bulut tabanlı veritabanları kullanılarak ekolojik araştırmalar için doğru ve verimli bir yaklaşım sunulmaktadır.

Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım (Video) | JoVE Journal

Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım

Daha fazla video keşfet