Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

FEB, hızlı ve doğru ölçümler sunan, etiketsiz ve uygun maliyetli bir __ ___ Bu yöntem, bilinen veya bilinmeyen etkileşimlerin doğrulanmasını ve biyomoleküler etkileşimlerin potansiyel inhibitörlerini test etmenin kolay bir yolunu sunar. FEB'in temel avantajı, açık, elle pipetleme platformu ile deney boyunca kullanıcıyı aradan geçiren ve kullanıcıların çok az veya hiç eğitim almadan çalışmasını sağlayan otomatik, kullanıcı dostu yazılımıdır.

FEB teknolojisi ayrıca farmasötiklerin çeşitli alanlarında, küçük moleküllerin, peptitlerin ve proteinlerin biyomoleküler analizinde, in vitro biyolojik aktiviteyi kolayca in vivo etkinliğe çevirerek ilaç doğrulamasında uygulamalar sunmaktadır. Yeni başlayan biri olarak, güvenilir bir KD değeri elde etmek için deneyi optimize etmek için doğru analit konsantrasyonlarını seçmede zorluklarla karşılaşabilirsiniz. Talaş işlevselleştirme sürecine ve uygun tampon değişimine dikkat etmenizi öneririz.

Eşit hacimlerde EDC ve sülfo-NHS çözeltisini yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırarak başlayın. Şirket tarafından sağlanan biyosensör çipini, takılı bir kapağı olan cam bir Petri kabına yerleştirin. Talaş aktivasyonunda yer alan tüm işlevselleştirme adımlarının Petri kabı içinde yapılması önerilmektedir.

Biyosensör çipine 50 mikrolitre tek molar MES tamponu uygulayın. Oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, tamponu aspire edin ve hemen sensör çipine 50 mikrolitre EDC sülfo-NHS çözeltisi uygulayın.

Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. EDC sülfo-NHS çözeltisini çipten aspire edin ve 50 mikrolitre tek molar MES tamponu uygulayın. MES tamponunu aspire edin ve çipi 50 mikrolitre 1X PBS ile iki kez durulayın.

PBS'yi çipten aspire edin ve hedef molekül Hsp90'ı ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, hedef molekülü içeren çözeltiyi aspire edin ve 50 mikrolitre 1X PBS ile üç kez durulayın.

1X PBS çözeltisini çipten aspire edin ve bir söndürme çözeltisinin 50 mikrolitresini ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bir çözeltiyi çipten söndürün ve iki çözeltiyi söndürmek için 50 mikrolitre ekleyin.

Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, çipten iki çözeltiyi söndürün ve çipi 50 mikrolitre 1X PBS kullanarak beş kez durulayın, sensör üzerindeki son PBS damlacığını bırakın. Cdc37 için analit seyreltme serisini istenen konsantrasyon aralığında hazırlayın.

Deneyi, güvenilir bir ayrışma sabiti veya KD değeri elde etmek için en az sekiz farklı analit konsantrasyonu içerecek şekilde tasarlayın ve bu farklı seyreltmeleri kalibrasyon ve hedef protein için kullanılan aynı tamponda hazırlayın. Çipi dikkatlice cihaza yerleştirin. Yazılımın açık olduğundan ve LED ışığının yeşile döndüğünden emin olun.

Ardından, otomatik yazılımdaki Denemeyi Çalıştır modülüne basın ve rejenerasyon veya istenen başka bir protokolle 10 nokta seçin. Operatör adı, deney adı, tarih, rejenerasyon tamponu, hareketsiz hedef ve çözeltideki analit gibi ayrıntıları doldurun. Yazılımda görüntülenen Denemeyi Başlat düğmesine basın ve otomatik yazılım tarafından gösterilen talimatları izleyin.

Cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirmek için, kalan PBS çözeltisini çipten aspire edin ve kalibrasyon tamponunun 50 mikrolitresini uygulayın. Devam düğmesine basın ve kalibrasyon adımı bitene kadar beş dakika bekleyin. Yazılım, kalibrasyon adımı için belirlenen uç noktayı takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.

Daha sonra, kalibrasyon tamponunu çipten aspire ederek ve en düşük analit konsantrasyonunun 50 mikrolitresini uygulayarak bir analit ilişkilendirmesi gerçekleştirin. Devam düğmesine basın ve ilişkilendirme adımı bitene kadar beş dakika bekleyin. Yazılım, devam etmek için bir uyarı alarmı ile ilişkilendirme adımının bitiş noktasını görüntüler.

Bir analit ayrışması gerçekleştirmek için, analit çözeltisini çipten aspire edin ve ayrışma tamponunun 50 mikrolitresini uygulayın. Devam düğmesine basın. Ayrıştırma adımı süresinden sonra, yazılım bir uyarı alarmı ile ayrıştırma adımının uç noktasını görüntüler.

Daha sonra, ayrışma çözeltisini çipten aspire ederek ve rejenerasyon tamponunun 50 mikrolitresini uygulayarak talaş rejenerasyonu gerçekleştirin. Ardından, Devam düğmesine basın. Rejenerasyon adımının tamamlanması genellikle yaklaşık 30 saniye sürer.

Bundan sonra, yazılım rejenerasyon adımının bitiş noktasını takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler. Son olarak, çipi yıkamak için, rejenerasyon çözeltisini çipten aspire edin ve yıkama tamponunun 50 mikrolitresini uygulayın. Çözeltiyi çipten aspire edin ve bunu beş kez tekrarlayın.

Yıkama tamponunun son damlasını çip üzerinde bırakın. Ardından, Devam düğmesine basın ve yazılım ekranında yıkama adımı süresi bitene kadar 30 saniye bekleyin. Kullanılan her analit konsantrasyonu için adımları tekrarlayın.

Kalibrasyonun beş adımı, analit ilişkisi, ayrışma, rejenerasyon ve beş kez yıkama bir döngü oluşturur. Deneyin sonundaki otomatik analiz yazılımındaki Analiz düğmesine basın. Tüm deneme noktalarını içeren bir görüntüleme penceresi görünecektir.

Öngörülen protokol için kullanılan analit konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olun. KD değerini otomatik olarak oluşturmak için Analizi Çalıştır düğmesine basın. Yazılım, analit konsantrasyonlarını, dengedeki ayrışma sabitinin hesaplandığı karşılık gelen I-tepkilerine karşı çizerek bir tepe fit grafiği oluşturur.

Hedef protein Hsp90 çipe hareketsiz hale getirildi ve ilk deney için, 25 nanomolar ila 5.000 nanomolar arasında değişen 10 analit proteini Cdc37 konsantrasyonu hazırlandı. Birinci denemeden oluşturulan veri dosyaları burada gösterilmiştir. Gerçek zamanlı olarak izlenen deneysel veriler burada gösterilmiştir.

Y ekseni, biyosensör birimlerindeki I-tepkisine karşılık gelir ve X ekseni, deneydeki analitin farklı zaman noktalarına ve konsantrasyonlarına karşılık gelir. Burada gösterilen grafiksel görüntü, otomatik analiz yazılımından oluşturulan tepe fit grafiğini temsil eder. Y ekseni, biyosensör birimlerindeki I-tepkisine karşılık gelir ve X-ekseni, deneydeki farklı analit konsantrasyonlarına karşılık gelir.

Burada gösterilen grafik görüntü, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak oluşturulan ilişkilendirme grafiğini temsil eder. Y ekseni, ilişkilendirme fazının sonundaki I-tepkisine karşılık gelir ve X ekseni, analit Cdc37'nin farklı konsantrasyonlarına karşılık gelir. İkinci deneyde, 0.4 nanomolar ila 200 nanomolar arasında değişen farklı bir konsantrasyon seti kullanıldı ve oluşturulan veri dosyaları burada gösterildi.

Grafik görüntüler, Hsp90 ve Cdc37 etkileşiminin ITC termogramını temsil eder. Burada, Cdc37'nin 298.15 Kelvin'de Hsp90'a ardışık enjeksiyonları nedeniyle elde edilen karşılık gelen ısı evrimleşen eğriler gösterilmektedir. Burada kullanılan diferansiyel güç, zamanın bir fonksiyonudur.

Bu grafikteki entegre veri noktaları, Hsp90'ın Cdc37'ye Mueller oranına karşı karşılık gelen normalleştirilmiş ısıyı belirtir. Burada kullanılan açık pipetleme yaklaşımı, kullanıcının el pipetlemesinde temel bir ustalığa sahip olmasını ve biyosensöre uçla dokunmadığından emin olmasını gerektirir. Adım zamanlamasının tekrarlanabilirliği tamamen kullanıcıya bağlıdır.

Araştırmacı iki biyomolekül arasındaki etkileşimi karakterize ettikten sonra, FEB sistemini kullanarak spesifik biyomoleküler etkileşimi hedefleyen potansiyel inhibitörler veya modülatörler tasarlayarak bir tarama deneyi yapabiliriz. Bu prosedür, proteinlerin yanı sıra ilaçlar ve peptitler de dahil olmak üzere küçük moleküller arasındaki bilinen ve yeni etkileşimi tanımlamak, doğrulamak ve ölçmek için kullanılabilir.