CD1d glikolipid Antijen Tanıtım ve NKT hücre Etkinleştirme Terapötik Potansiyeli: Röportaj

Merhaba, benim adım Mitchell Cronenberg ve La Jolla Alerji ve İmmünoloji Enstitüsü'ndeyim. Aslında kurumun başkanı ve bilimsel direktörüyüm ancak oldukça aktif bir araştırma laboratuvarım var; bugün üzerinde konuşacağımız konu da elbette sahip olduğumuz teknolojilerden biri olan CD 1D tetramerleridir. Laboratuvarımdaki çalışmaların çoğu CD 1D reaktif T hücreleri ile ilgilidir.

Ve bu hücreler, peptidlerden ziyade glikolipitleri tanıdıkları için benzersizdir. Laboratuvarımın bir başka kolu ise tamamen farklı bir konu olan mukozal bağışıklık sistemi ve bunun düzenlenmesi ile ilgilenmektedir. CD1 molekülleri antijen sunan moleküllerdir; bu da antijenlere veya protein fragmanlarına ya da diğer moleküllere bağlandıkları ve bunları T-hücresi tanınması için sundukları anlamına gelir.

Şu anda aslında iki farklı türde antijen sunan molekül bulunmaktadır. Peptitleri tutan veya sunanlar ve lipidler ile glikolipidleri tutanlar vardır. CD1 molekülleri ise lipidleri ve glikolipidleri tutar.

İşlevleri budur ve bu lipidleri ve glikolipidleri T hücrelerine sunarlar. Aslında dört farklı CD1 molekülü türü vardır: CD1A, B, C ve D. Biz özellikle CD1D'ye odaklanıyoruz ve CD1D, kısmen fare modellerinin bulunması nedeniyle muhtemelen üzerinde en çok çalışılmış olanıdır. CD1D, glikolipidleri, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtının özelliklerini taşıyan sıra dışı bir beyaz kan hücresi olan doğal öldürücü T hücresi adı verilen özel bir T hücresine sunar.

Sunulan glikolipitler, şu an için çok iyi karakterize edilmemiş olsalar da, self glikolipitler veya mikrobiyal glikolipitler olabilirler. Sunulduklarını bildiğimiz glikolipitler iki kaynaktan gelmektedir. Bunlardan biri, muhtemelen biyosferdeki en bol bakteri türü olan FMS bakterileri olarak adlandırılanlardır.

Okyanuslarda, bitkilerde ve toprakta yaşarlar. Ancak pek çok insanı hasta etmezler. Sanırım bu bakterilerle birlikte yaşamaya çok alıştık.

Bildiğimiz ikinci kategori ise, diaçil gliserol içeren glikolipitler olarak adlandırılan farklı bir glikolipit türüdür. Bunlar, Lyme hastalığına neden olan Borrelia burgdorferi'de ve muhtemelen diğer pek çok patojende bulunur. Hangi farklı bakteri türlerinin bu glikolipitlere sahip olduğunu henüz yeni keşfediyoruz.

Böylece, SMS'den gelen glikosinyal lipidleri ve Borrelia ile muhtemelen gerçekten patojenik olan diğer birçok kaynaktan gelen diilgliserol lipidleri dediğimiz yapılara sahibiz. Bu lipidler, ağırlıklı olarak dendritik hücrelerdeki CD 1D moleküllerine yüklenir; ancak bunlar B lenfositleri, karaciğerdeki ER hücreleri ve belki diğer hücre tipleri de olabilir. Bu CD 1D molekülleri, muhtemelen bu lipidlere bağlandıkları lizozomlar ve endozomlar üzerinden geçerler ve ardından lipidi, daha önce bahsettiğim doğal öldürücü T hücreleri de dahil olmak üzere T hücreleri tarafından tanınması için hücre yüzeyine taşırlar.

Glikolipid içeren bir bakteriye maruz kaldığınızda gerçekleşen durumlardan biri, NK T hücrelerinin çok hızlı bir şekilde aktive olmasıdır. Konvansiyonel T hücreleri, yani peptid reaktif T hücreleri, özellikle antijenle önceden karşılaşmamışlarsa, güçlü bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için tipik olarak üç veya dört güne ihtiyaç duyarlar.

Diğer bir ifadeyle, eğer öyleyseler, naif durumdadırlar. Buna karşılık, NK T hücreleri birkaç saat içinde aktive edilebilir ve çok kısa bir süre içinde, bakteriyel temizleme için önemli olan gama interferon gibi sitokinler üretmeye başlarlar. Ve bu yönleriyle, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modelinin belirli yönlerine benzerler.

Model antijenler üzerine yapılan çalışmalardan, CD 1D'nin, glikolipid antijenlerin CD 1'e yüklendiği oldukça asidik hücre içi bölmeler olan geç endozomlara ve lizozomlara girdiğini biliyoruz; aslında dendritik hücreler gibi antijen sunan hücrelerin içinde, lipidlerin CD 1D molekülüne yüklenmesine yardımcı olan özel transfer proteinleri bulunmaktadır. Söz konusu fona bakterileri, borre bakterileri ve diğerleri ile çalışırken hücre dışı bakterilerle uğraşıyorduk. Bu nedenle, lipid antijenlerin bir şekilde hücre içine, muhtemelen bir lizozoma taşınması ve ardından CD 1 molekülüne yüklenmesi gerekmektedir.

Ardından NKT hücresinin hemen aktivasyonu gerçekleşir ve tüm bunlar karaciğerdeki sinüzoidlerde, dalakta, belki kemik iliğinde ve NKT hücrelerinin bulunduğu diğer bölgelerde birkaç saat içinde meydana gelmelidir. Tetramerik yapı, onları diğer T hücrelerinden ayıran bu doğal özelliklere sahip olan doğal katil T hücrelerini kesin olarak tanımlamak için gerçekten kilit öneme sahiptir. Mevcut diğer belirteçler gerçekten çok belirsizdir, ancak tetramerler, hücreleri onları bir bakıma tanımlayan temel gerçek olan antijen reseptör özgüllüklerine göre tanımlamanıza olanak tanır; tetramerlerin yapımı oldukça eskiye dayanmaktadır.

Mark Davis ve John Alman tarafından icat edilen bu yöntemin temel fikri, T-hücre reseptörünün düşük afiniteye sahip olmasıydı; hücreleri özgünlüklerine göre tanımlamak veya belirlemek istediğinizde, tanıdıkları peptidlerin veya peptidlerin antijen sunan moleküllerle oluşturduğu komplekslerin, hücreyi tanımlamanıza izin verecek kadar yüksek bir afiniteye veya bağlanma gücüne sahip olmadıkları görülmüştü. Bu nedenle Mark Davis ve John Alman, antijen sunan molekül ile sundukları molekülün tetramerlerini (bazı durumlarda OCR'larını) oluşturan tetramer teknolojisini icat ederek temel olarak etkileşimin afinitesini artırdılar. Böylece grip peptidlerine ve belirli bir antijen sunan moleküle veya ilgilendiğiniz herhangi bir antikene özgü olan hücreyi görebilirsiniz.

Örneğin, bir aşı rejiminin ne kadar etkili olabileceğini görmenizi sağladığı için oldukça önemli bir teknolojidir. Doksanların sonlarından itibaren yaptığımız şey, başlangıçta şu an yaklaşık 500 kez atıf almış olan ve 2000 yılında yayınladığım bir makaleydi. Yaptığımız şey, bu teknolojiyi lipidlere uyarlamaktı.

Böylece çözünür CD1 molekülleri hazırladık ve birazdan açıklayacağım yöntemlerle bunları, başka bir ifadeyle, ilgilendiğimiz spesifik glikolipidlerle birleştirerek markaladık; bu sayede onları, spesifik T hücresi reseptörlerini analiz etmek için reaktif olarak kullanabildik. Diğer bir ifadeyle, CD1D ile birlikte ilgilendiğimiz glikolipidi tanıyan reseptörleri belirledik. Tetramerler, NKT hücrelerinin sayısını, aktivasyon durumlarını ve fonksiyonlarını analiz etmek istediğiniz her durumda kullanılabilir.

Ve laboratuvarımızda bu, birçok farklı projeden herhangi biriyle ilgili olabilir. Örneğin, belirli bir mutantın ve bir sinyal yolağının NK T hücresi gelişimini etkileyip etkilemediğini sormak isterseniz, tetramerlerimizi kullanarak bunu yapabilir ve NKT hücrelerinin sayısı hakkında bilgi edinebiliriz. Ayrıca, NKT hücrelerinin olgunlaşıp olgunlaşmadığını veya aktif hale gelip gelmediklerini değerlendirmemize yardımcı olacak diğer markörlere, diğer hücre yüzeyi proteinlerine bakabiliriz; antenik bir stimülasyon sonrası tetramerlerimizi kullanarak yalnızca aktive olup olmadıklarını değil, aynı zamanda hangi sitokinleri ürettiklerini de belirleyebiliriz.

Böylece tetramer boyamasını, örneğin hücre içi sitokin boyaması ile birleştirerek NKT hücrelerinin yüzde kaçının gama interferon, yüzde kaçının IL 4 ve yüzde kaçının her ikisini de ürettiğini çok parametreli akış sitometrisi ile sorabiliriz; bu hücrelerin ex vivo sitokin üretimi hakkında çeşitli sorular yöneltebiliriz. Ayrıca, daha ileri deneyler de gerçekleştirebiliriz. Örneğin, tetramerleri, NKT hücrelerinin diğer hücre tipleriyle nasıl etkileşime girdiğini incelemek amacıyla in vitro kültür için saflaştırmada veya genetik nedenlerle NKT hücrelerinden yoksun olabilecek bir alıcı hayvana transfer etmek için kullanabiliriz.

Bu fonksiyonu geri kazandırmak istiyoruz. Bunu yapabilir ve hücrelerin nereye yerleştiği ve nasıl çalıştığı hakkında sorular sorabiliriz. Son olarak, insan NKT hücreleri durumunda, insanların aslında hücre hatlarını in vitro ortamda genişletmek, analitik amaçlar için ve potansiyel olarak terapötik amaçlar için hücreler yetiştirmek amacıyla tetramerleri kullandıklarını biliyorum.

CD 1D tetramerleri oluşturmak için bir Baculovirus ekspresyon sistemi kullanıyoruz. Süreç; promotör ile $\beta_2$-mikroglobulin ve CD 1D ağır zincirinin ekspresyonunu içeren yaygın bir DNA konstrüktü ile başlar. Bu CD 1 molekülü, iki polipeptidden oluşan bir heterodimerdir.

Böylece iki promotörlü bir ekspresyon sistemine sahibiz ve böcek doku kültürü hücrelerini, kanalımızda açıklandığı üzere dikkatlice titre edilmiş vao virüsleri ile enfekte ediyoruz. Ardından hücreleri enfekte ediyor ve doku kültürü ortamından, hücreler tarafından eksprese edilen proteini topluyoruz. CD 1D ağır zinciri, özellikle tetramer üretimi için geliştirilmiştir.

Yaptığımız iki, daha doğrusu üç şey var. Birincisi, transmembran parçasını çıkarıyoruz. Böylece çözünür bir protein eksprese ediyoruz.

İkinci olarak, proteinin metal iyon kromatografisi ile saflaştırılabilmesi için bir heksa-histidin etiketi ekledik. Üçüncüsü ise, enzimatik biyotinleme için biyotinleşme alanı olarak adlandırılan bölgeye sahibiz. Yenilikçi kısım da budur.

Davis ve Alman tetramer üretim teknolojisini ilk kez geliştirdiklerinde bu çok önemliydi. Proteini topladıktan sonra, orada nikel kolon kromatografisi ile nikel kompleks üzerinden saflaştırılır. Bazı durumlarda, bunun ardından boyut dışlama kromatografisi uygularız.

Ardından protein enzimatik olarak biyotinillenip inkübe edilebilir ve enzimatik biyotinlenme gerçekleştikten sonra, strep ab ile inkübe edildiğinde tetramerler oluşturacaktır. Ancak, ated olan çözünür CD one proteini, temel olarak bir gece boyunca ilgilenilen bir glikolipid çözeltisinde inkübe edilebilir. Glikolipidlerin seyreltici veya çözücü olarak tipik olarak kullandığı DMSO içinde çözünmemiş olması çok önemlidir, çünkü CD one buna karşı çok hassastır.

Genellikle az miktarda tween ve PBS içeren bir tampon çözelti kullanıyoruz. Bu tampon, glikolipidlerimizin çoğunu çözmek için oldukça etkilidir. Kendiliğinden gerçekleştiği görülen CD 1D yüklemesi için ise çeşitli üreticilerin streptavidin ürünlerini kullanıyoruz.

Ve pe, fico, eryn veya bir PC fikosiyanin boyasına konjuglendiğinde, bunlardan herhangi biri çok iyi sonuç veriyor gibi görünüyor ve bize çok iyi bir boyama sağlıyor. Genel olarak, prosedür MHC Sınıf 1 tetramerlerini oluşturmak için iyi tanımlanmış prosedürlerden pek farklı değil; tek fark, bakteriyel ekspresyon yerine viral ekspresyon kullanmamız ve tabii ki peptidler yerine lipid antijenlere sahip olmamızdır. Vurgulamam gereken bir nokta, insanların NK T hücrelerine sahip olduğu ve bunların fare NK T hücreleriyle aynı özgüllüğe sahip olduğudur.

Böylece, kemirgenlerden ayrıldığımızdan beri en az 60 milyon yıldır bu özgünlük korunmuştur ve aslında, insan CD 1D tetramerlerini burada videoda gördüğünüz tekniklerle hazırlıyoruz. Ancak, insan NK T hücreleri fare tetramerleriyle ve tersi durumda fare hücreleri de insan tetramerleriyle oldukça iyi çalışmaktadır. Bu nedenle, fare tetramerlerimizi insan çalışmaları için kullanabildiğimizden, insan tetramerlerini çok sık hazırlamıyoruz.

NK T hücrelerinin, bağışıklık yanıtının sonucunda kritik belirleyiciler olduğunun gösterildiği birçok fare modeli bulunmaktadır. Bunlar, kanserlere verilen yanıttan otoimmün hastalıkların düzenlenmesine, enfeksiyöz ajanların temizlenmesine ve hatta sklerotik plakların gelişimine kadar geniş bir yelpazeye yayılmaktadır. Bu, arterlerde meydana gelen kronik bir inflamatuar süreçtir.

Bu hücrelerin, daha az bollukta bulundukları insanlardaki önemi hakkında bazı sorular vardır; otoimmün durumlarda değişim gösterdiklerine dair birçok rapor bulunmaktadır ve ayrıca astım hastalarının akciğerlerinde oldukça yoğunlaştıklarına dair raporlar mevcuttur. Bu raporlardan biri England Journal of Medicine'da yer alsa da, konuyla ilgili bazı tartışmalar vardır. Ancak insanlarda yapılan bir dizi çalışma, bu hücrelerin önemli olabileceğini göstermektedir.

Klinik araştırmalar açısından, NKT hücrelerinin stimülasyonu ileri evre kanser hastaları için dört adet faz bir çalışmada test edilmiştir. Tabii ki bazı etkinlik kanıtları mevcuttur; bu hastalar oldukça ağır durumdadır ve çalışmalar birkaç farklı kanser türünde devam etmektedir. Ayrıca, henüz uygulama aşamasına geçilmemiş olsa da, NKT hücresi mediyatör terapisini otoimmün hastalıklarda kullanmakla ilgilenen kişiler bulunmaktadır.

Tetramerler, temel olarak agonist tedaviden sonra NKT hücrelerine ne olduğu analiz edildiği noktasında bu çalışmalarda rol oynayabilir. Dolayısıyla genel yaklaşım, yanıta ve duruma bağlı olarak glikolipid agonistleri veya bazı durumlarda diğer grupların geliştirmekte olduğu glikolipid antagonistlerini kullanmaktır. Ardından, normalde tetramerler ile yapılan işlemle, NKT hücrelerine ne olduğu değerlendirilir.

Diğer potansiyel kullanım alanı ise insan NKT hücrelerinin in vitro ekspansiyonu olacaktır. Örneğin, tetramerler veya uygun glikolipidlere sahip hücreler kullanılarak yapılabilecek olan antijenik stimülasyon yoluyla, in vitro ortamda çok sayıda insan NKT hücresi üretmek oldukça uygulanabilir ve mümkündür. Ayrıca, tetramer veya hücre kullanımına ek olarak, sitokin eklemeniz gerekir.

Ancak bu koşullar altında, çok sayıda insan NK T hücresi genişletilebilir. Ayrıca, Boston'daki en az bir grup, glikolipid tabanlı tedavinin aksine, bu tür bir tedaviyle ilgilenmektedir. Laboratuvarımın bir başka bölümü ise mukozal bağışıklık üzerine çalışmalar yürütmektedir.

Çoğu immünolog, lenf düğümleri ve dalaktaki lenfositlere veya beyaz kan hücrelerine odaklanmıştır. Oysa vücudumuzda bulunanların çoğunluğu aslında, muhtemelen 10¹⁴ ila 10¹⁵ arası bakterinin de bulunduğu bağırsak mukozasında yer alır. Dolayısıyla, mikrobiyal açıdan bakıldığında çoğunlukla steriliz ancak bağırsaklarımızda durum böyle değildir.

Ayrıca bağırsakta çok geniş bir beyaz kan hücresi koleksiyonuna sahibiz. Bu hücreler benzersiz özelliklere sahiptir ve aslında üzerlerinde yeterince çalışılmamıştır. Bu nedenle, bu hücrelerle ilgili bazı temel bilim araştırmalarımız bulunmaktadır.

Ancak aynı zamanda, benim immün disregülasyon olarak adlandırdığım ve inflamatuar bağırsak hastalığına yol açan bir süreci inceliyoruz; bunlar temel olarak ince veya kalın bağırsağın immün aracılı hastalıklarıdır ve Crohn hastalığı veya ülseratif kolit isimleriyle anılırlar. Bazı insan çalışmaları yürütsek de, çalışmalarımızın çoğu fare modelleri üzerinedir. Crohn hastalığına benzer semptomlara yol açan mukozal immün sistemin disregülasyonu için oldukça iyi olduğunu düşündüğüm fare modellerine sahibiz.

Bu süreci ve aynı zamanda bu sürece müdahale etme yollarını, nihayetinde bu immün aracılı hastalıklardan muzdarip olan hastalar için daha iyi tedaviler geliştirme umuduyla çalışıyoruz. Sonuç olarak, önümüzdeki 10 yıl veya daha uzun bir süre boyunca immünolojinin nereye gideceği hakkında biraz düşünebiliriz ve şaşırtıcı gelse de, 10 yıl sonrasını görmek gerçekten zordur.

Aslında mukoza bağışıklık sisteminin, immünolojinin henüz yeterince keşfedilmemiş ana alanlarından biri olduğunu düşünüyorum. Gerçi giderek daha fazla insan ve daha fazla yüksek profilli grup mukoza immünolojisi çalışmalarına ilgi göstermeye başladı. Bence muazzam etkileri olacak bir başka alan da genetik, özellikle de insan genetiği; insan genomunun 1.000 dizilemesine doğru ilerledikçe, bireyler üzerinde çalışmalar yapmak ve DNA değişkenliğinin bağışıklık yanıtını nasıl etkilediğini değerlendirmek gerçekten mümkün olacak.

Şu anda, temel yolaklar üzerindeki en iyi araştırmaların çoğu kemirgenleri içermektedir. Kemirgenler, özellikle de fareler, çalışmalarımız için gerçekten kritiktir. Ancak gelecekte, bireylerde gerçekleşebilecek karmaşık otoimmün fenomenleri veya diğer durumları değerlendirirken, bunu insan genetik polimorfizmlerine dayanarak yapabileceğimizi düşünüyorum.

Polimorfizmleri değerlendirebileceğiz ve ardından bu bilgiyi, bunun bağım responses'ı nasıl etkileyeceğini tahmin etmeye çalışmak için kullanacağız ve nihayetinde benim ve diğerlerinin kişiselleştirilmiş immün tedaviler veya daha geniş anlamda, kişiselleştirilmiş tıp olarak adlandırdığı şeye doğru ilerleyeceğiz. Bu nedenle genetiğin muazzam bir etkisi olacak. Fare genetiğinde halihazırda harika araçlara sahibiz.

İstediğimiz her geni nakavt edebiliriz. Genlerin belirli hücre tiplerindeki ekspresyonunu nakavt edebiliriz. Harika şeyler başarabiliriz.

Ancak gelecekte, bağışıklık yanıtını ve bağışıklığı insan yanıtları açısından anlamaya odaklanacağımızı düşünüyorum.