Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Bu teknik, ko-kültürlü stromal hücrelerden salgılanan faktörlerin etkisi altında farklı invaziv kapasitelere sahip hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Teknik, ko-kültürlü stromal veya immün hücrelerden salgılanan faktörlerin hücre invazyonu üzerindeki etkisini değerlendirir. Ayrıca, heterojen hücre karışımlarında bulunan invaziv hücre alt popülasyonlarının geri kazanılmasına ve analizine izin verir.

Bu teknik, hangi tümörlerin metastaza yol açan invaziv hücre alt popülasyonlarını barındırdığını belirleyebilir. İnvaziv kanser hücrelerinin yakalanması ve analizi tedavi kararlarını bilgilendirebilir. Hücre kültürüne başlamak için, yaklaşık% 70 oranında akıcılığa sahip yapışkan hücre kültürlerini 1X fosfat tamponlu salin ile yıkayın.

Daha sonra hücreleri kaldırmak için% 0.05 tripsin ve EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin çözeltisini serum içeren hücre kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunun bir aliquot'unu kullanarak hücreleri sayın. Üç steril odacığı da doku kültürü başlığına yerleştirin.

Düğmeyi alt odanın kısa tarafına yerleştirin ve alt odayı topuz deneyciye bakacak şekilde yönlendirin. Herhangi bir kabarcık oluşturmadan alt odadan her bir kuyucuğa 90 mikrolitre ortamda 30.000 ila 50.000 hücre ekleyin. Fetal sığır serumu takviyeli ortamın %5'ini hücre hareketliliği için pozitif kontrol olarak iki alt odacıkta kullanın ve negatif kontrol olarak %0 serum takviyeli ortam kullanın.

Kaputta 10 ila 15 dakika beklettikten sonra alt odayı 90 derecede döndürün. Ardından orta odayı üste yerleştirin, böylece alt odadaki düğme orta odadaki çentiğin içine kayar. Montajın uzun kenarlarının her birinden bir tıklama duyulana kadar odacığı dikey olarak aşağı doğru itin.

Orta odanın tüm kuyularına 160 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin. Kuyular doldurulduktan sonra kubbe şeklinde bir menisküsün görülebildiğinden emin olun ve orta ve üst bölmelerdeki mavi noktaları hizalamak için üst odayı elektrotlarla orta odaya yerleştirin. Montajın uzun taraflarının her birinden bir tıklama sesi duyulana kadar odayı dikey olarak aşağı doğru itin.

Üst odaya 20 ila 50 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin. Düzeneği doku kültürü inkübatöründeki çift amaçlı hücre analizörüne monte edin ve arka planı ölçmeden önce 30 dakika bekleyin. Hücre analizörü yazılımını açın, ardından kullanılacak beşiği seçin, ardından mesaj sekmesine tıklayın ve dizinin beşiğe iyi yerleştirildiğinden ve elektrotların sensörlerle iyi hizalandığından emin olmak için Bağlantılar tamam" yazdığından emin olun.

Deneme notları sekmesini tıklayın ve denemeyle ilgili olası tüm bilgileri doldurun. Ardından düzen sekmesine tıklayın ve dizi düzeninin açıklamasını doldurun. Ardından zamanlama sekmesine tıklayın ve adımlar menüsünden iki adım, bir süpürme ile bir arka plan adımı ve 100 süpürme ile bir test adımı ekleyin.

Dizi, 30 dakika boyunca çift amaçlı hücre analizörü inkübatöründe kaldıktan sonra, arka plan ölçümünü başlatmak için oynat düğmesine tıklayın. Arka plan ölçümü yapıldıktan sonra, diziyi beşikten çıkarın ve hücre kültürü başlığına geri yerleştirin. Ardından, üst odanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre serumsuz ortamda 30.000 ila 50.000 hücre ekleyin.

Bunlar, elektrotun membrandan başarıyla göç ettikten sonra tespit edeceği hücrelerdir. Empedans ölçümü için çift amaçlı hücre analizörüne monte etmeden önce tertibatı 30 dakika boyunca kaputta bekletin. Diziyi tekrar çift amaçlı hücre analizörüne yerleştirin ve Bağlantılar tamam" mesajı için mesaj sekmesini kontrol edin.

Empedans ölçümünü başlatmak için oynat düğmesine tıklayın ve ardından sinyalin ilerlemesini izlemek için grafik sekmesine tıklayın. Uç noktaya 25 saatten önce ulaşılırsa, yürüt açılır menüsünden iptal adımına tıklayın. Verileri dışa aktarmak için grafiğe sağ tıklayın, liste biçiminde kopyala'yı seçin ve ardından verileri bir elektronik tabloya yapıştırın.

İlgilenilen durma noktasını belirlemek için çift amaçlı hücre analizöründe geçiş oranını gerçek zamanlı olarak izleyin. Başarıldığında, tertibatı çift amaçlı hücre analizöründen çıkarın ve doku kültürü başlığına yerleştirin. Hücreleri ilgilenilen kuyucuklardan toplamak için uygun sayıda 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.

Odalar ayrıldığında sıvı içermesi için tertibatı 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin. Bir tıklama sesi duyulana kadar orta odanın uzun tarafındaki esnek yapışma uçlarını içeri doğru itin, ardından üst odayı sökün ve 10 santimetrelik yeni bir kaba çevirin. Aynı deneysel durumu barındıran tüm kuyulardan hücreleri toplamak için 13 milimetrelik bir bıçağa sahip bir hücre kaldırıcı kullanın.

Hücreleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplamak için bıçağı 1X fosfat tamponlu salin içinde durulayın veya daldırın. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün ve toplanan bu hücreleri çoğaltın veya tek hücreli RNA dizilimi gibi son nokta analizi yapın. Stromal hücrelerin varlığında veya yokluğunda hücrelerin invazyonunun değerlendirilmesi, MDA-MB-231 hücre invazyonunun, iki hücre hattı arasındaki faktörlerin değişimi için alt odaya ışınlanmış İsviçre-3T3 fibroblastları J2 suşu yerleştirildiğinde arttığını göstermiştir.

İlginç bir şekilde, MDA-MB-231 istilası, 3T3 J2 hücrelerinin sayısı iki katına çıktığında artmıştır. Öte yandan, MCFDCIS hücrelerinin invaziv bir klonu olan DCIS-Delta Four'un istila hızı, 3T3 J2 hücreleri ile çapraz konuşma tarafından inhibe edilmiş gibi görünmektedir, bu da stromanın değişen etkilerini ölçmek için üç odacıklı dizinin değerli bir şekilde uygulanmasını düşündürmektedir. Bu durumda, hücre invazyonu üzerinde fibroblastlar.

İnsan göbek damarı endotel hücreleri, MDA-MB-231 hücreleri tarafından salgılanan faktörlere yanıt olarak, DCIS hücreleri tarafından salgılananların aksine, invaziv tümörlerin kan damarı oluşumu için endotel hücrelerini işe alma ve daha sonra dolaşıma yayılma kabiliyeti ile tutarlı olarak daha invazivdi. Üst odacıktan hasta kaynaklı ksenogreft hücre invazyonu, ko-kültürlü insan kemik iliği bağışıklık hücrelerine yanıt olarak artmıştır. İlginçtir ki, insan kemik iliği immün hücreleri ile alt odacıkta% 2 serum varlığı, hasta kaynaklı ksenogreft invazyonu için gerekliydi.

Kuyular, bazal membran bariyerini taklit etmek için hücre dışı bir matrisle kaplanabilir. İnvazyon üzerindeki etkilerini izlemek için kuyucuklardaki ortama terapötik ajanlar eklenebilir.