Name: Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Keşfedin Drosophila fotoreseptörlerinde elektrofizyolojik yöntemlerle fotopigment düzeylerini ölçme tekniğini. Bu yöntem görsel mutasyonların genetik taraması için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, İsrail Bilim Vakfı (ISF) ve Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı (BSF) tarafından desteklenmiştir. Balmumu filament ısıtıcısının yapımı için Bay Anatoly Shapochnikov'a teşekkür ederiz.

1. Elektroretinogram kullanılarak yoğunluk yanıtı ilişkisinin, uzamış depolarizan artçı potansiyelin (PDA) ve erken reseptör potansiyelinin (ERP) ölçülmesi
<ol><li>D. melanogaster hazırlığı için uygun yetiştirme koşulları<ol>
<li>D. melanogaster sineklerini, 24 ° C sıcaklıkta ve 12 saatlik karanlık / ışık döngüsünde tutulan bir inkübatörde yiyecek içeren standart sarı mısır içeren şişelerde yükseltin</li>
		<li>Sinek şişelerini deneyden en az 24 saat önce karanlıkta tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Genel kurulum<ol>
<li>Kayıt pipetlerini 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) fiber dolgulu borosilikat cam kılcal damarları çekerek hazırlayın (Şekil 6L, O). Pipetlerin direnci 5-10 MΩ olmalıdır; uygun herhangi bir çektirme kullanılabilir.</li>
		<li>İki gümüş teli AgCl2 ile kaplayın ve 0,25 mm gümüş teli özel yapım 5 V güç kaynağına bağlı 3 M KCl çözeltisine yerleştirin.</li>
		<li>Kaplanmış her gümüş teli elektrot tutuculara yerleştirin (Şekil 6N).</li>
		<li>Cam kılcal damarı, uzun uçlu bir şırınga (Şekil 6M) kullanarak filtrelenmiş Ringer çözeltisi (bakınız Tablo 1) ile doldurun.</li>
		<li>Tel elektrodu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal damar içindeki çözeltinin gümüş tel ile temas halinde olduğundan emin olun.</li>
		<li>Elektrot tutucuları (Şekil 7P, N) iki elektrot mikromanipülatörüne (Şekil 7G) yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sineği elektrik kayıtları için hazırlama prosedürü NOT: Sineği karanlığa uyarlanmış koşullar altında tutmak için, aşağıdaki adımlar sırasında yalnızca loş kırmızı ışık aydınlatmasını kullanın.<ol>
<li>Sinek yataklı sistemini kullanarak şişedeki sinekleri CO2 gazı ile uyuşturun (Şekil 6A, B) ve uyuyan kaba dökün.</li>
		<li>Bir sinek seçin ve keskin bir cımbız kullanarak kanadından dikkatlice tutun. Sineklerin geri kalanını bir Petri kabı ile örtün.</li>
		<li>Sineği sinek tutucunun üzerine, sırtı ele doğru olacak şekilde, yan yatarak doğru yönde yerleştirin (Şekil 6P).</li>
		<li>Havyanın güç kaynağını AÇIN. Geçerli değeri ~2,25 A olarak ayarlayın. Bu akım 0,25 mm platin-iridyum filamentini ~55-56 ° C'ye ısıtmalıdır (Ek Dosyaya bakınız).</li>
		<li>Havya üzerine düşük erime sıcaklığına (~ 55-56 ° C) sahip bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 6F).</li>
		<li>Cımbız kullanarak, sineği kanatlarından kaldırın ve havyayı kullanarak kanatlarını sinek tutucusuna sabitleyin (Şekil 6I).</li>
		<li>Lehimleme demirini kullanarak, sineğin sırtını balmumu ile stand yüzeyine bağlayın (Şekil 6P).</li>
		<li>Havyanın ucunu bacakların birleşme noktasına indirin ve tüm bacakları birlikte örtmek için balmumunu eritin (Şekil 6P).</li>
		<li>Boyun bölgesinde baş ve sırt arasına küçük bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 6P). NOT: Sinek kafasının aşırı ısınmasını önlemek için özel dikkat gösterin. Sineğin düzgün bir şekilde sabitlendiğinden ve deney sırasında hareket edemediğinden emin olun; küçük hareketler kayıtlarda eserler oluşturabilir. Toraks ve karın bölgesindeki trakea açıklıklarının (solunum girişleri) balmumu ile kaplanmadığından emin olun.</li>
		<li>Sinek tutucuyu (Şekil 7Q) bir mıknatıs bloğu üzerindeki karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin (Şekil 7I) ve sineğin ışık kılavuzunun ucundan ~ 5 mm uzakta olduğundan emin olun (Şekil 7L).</li>
		<li>Kayıt elektrodunu (Şekil 7P) sinek gözünün üzerine ve toprak elektrodunu (Şekil 7N) mikromanipülatörleri kullanarak sineğin üst sırtına yerleştirin.</li>
		<li>Mikromanipülatörleri kullanarak toprak elektrodunu sineğin arkasına yerleştirin.</li>
		<li>Kayıt elektrodunu sinek gözünün dış çevresine, tercihen mikromanipülatörleri kullanarak yerleştirin. NOT: Elektrodu göze yerleştirdikten sonra, küçük bir çukur gözlenecektir; gamzesi kaybolana kadar elektrodu gözden çıkarmadan yukarı doğru çekin. Elektrotlar ayrıca gövdeye ve göze uygulanan küçük elektrot jölesi damlacıklarına daldırılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Yoğunluk-tepki protokolü<ol>
<li>Yüksek basınçlı Xenon lambasının önüne turuncu bir filtre (590 kenarlı filtre) yerleştirin. Büyük (altı büyüklük sırasıyla) zayıflatıcı nötr yoğunluk (ND) filtresi kullanın.</li>
		<li>Karanlıkta 60 s bekleyin ve 5 s ışık darbesi verin.</li>
		<li>ND filtresini, büyüklük artışlarının bir sırasına göre daha az zayıflatıcı bir ND filtresiyle değiştirin.</li>
		<li>Karanlıkta 60 s bekleyin ve ikinci bir 5 s ışık darbesi verin.</li>
		<li>Daha az zayıflatıcı ND filtreleri kullanarak ışık yoğunluğunu kademeli olarak artırarak Adım 1.4.1.-1.4.4'ü tekrarlayın (son darbe hiç ND filtresi olmadan oluşturulmalıdır). ND filtre serisini, büyük zayıflamadan başlayarak ve düşük zayıflamaya ulaşan doğru yönde kullandığınızdan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>PDA protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde yapılabilir)<ol>
<li>Turuncu bir filtre kullanarak maksimum yoğunlukta 5 sn ışık darbesi verin (maksimum fotopigmenti R durumuna dönüştürmek için 590 kenarlı filtre).</li>
		<li>Turuncu filtreyi geniş bantlı mavi (BP450/40 nm) bir filtreyle değiştirin ve maksimum yoğunlukta üç adet 5 s ışık darbesi verin. NOT: Kararlı durum voltaj tepkisine ulaşılana kadar uzun bir sürekli maksimum yoğunlukta mavi ışık darbesi vermek de mümkündür.</li>
		<li>Karanlıkta 60 s bekleyin, mavi filtreyi önceki turuncu filtreyle değiştirin ve 60 s aralıklarla iki adet 5 s ışık darbesi verin.</li>
	</ol></li>
	<li>M'nin foto-denge spektrumunu ölçmek için ERP / M potansiyel protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde gerçekleştirilebilir10,25)<ol>
<li>Kararlı durum voltaj tepkisine ulaşana kadar sürekli mavi (bandpass (BP) 450/40 nm) ışık darbesi verin, bu da maksimum fotopigment miktarını R durumundan R1-6 hücrelerinin M durumuna dönüştürür.</li>
		<li>Dar (~ 20 nm) bandpass filtreleri kullanarak 350-700 nm (R1-6 hücreleri fotopigmentinin bilinen absorpsiyon spektrumu) arasındaki bir dalga boyunda kısa (<3 ms) yoğun bir ışık parlaması verin ve M potansiyel yanıtının M1 fazının tepe genliğini ölçün (foto-denge 10,25'te bu spesifik dalga boyundaki metarodopsin absorpsiyonunu yansıtır). NOT: Büyük bir fotopigment molekülü havuzunun senkron aktivasyonu için, foton içeriğinin kısa sürede paketlenmesi için kısa, yoğun bir ışık parlaması gereklidir. M potansiyeli iki bileşenden oluşur: Fotoreseptördeki metarodopsinin yük yer değiştirmesini yansıtan M1 (kornea negatif faz) ve laminadaki fotoreseptörlerin yükseltilmişM1 tepkisini yansıtan M2 (kornea pozitif faz 11,33)9,10,11 . Bu bileşenlerin her biri tanımlanabilir ve ölçülebilir. Bununla birlikte, M1 potansiyelinin ölçülmesi tercih edilir, çünkü M seviyelerinin doğrudan doğrusal bir tezahürüdür. M2 kullanılıyorsa, hafif karotenoid yoksunluğu24,25 kullanarak genliğinin doğrusal aralıkta olduğundan emin olun.</li>
		<li>Tekrar sürekli mavi (BP450/40 nm) ışık darbesi verin, ardından farklı dalga boyunda kısa (<1 ms) yoğun bir ışık parlaması izleyin.</li>
		<li>Fotoğraf dengesinde M'nin tüm absorpsiyon spektrumu kaplanana kadar bu protokolü tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tüm hücre voltaj kelepçeli kayıtları kullanarak R'nin etki spektrumunu ve R1-6 hücrelerinin M durumlarını ölçmek için ERC protokolü
NOT: Tüm hücre voltaj kelepçeli kayıtları kullanmak için ayrıntılı bir protokol için, Katz ve ark.34'e bakınız. M-potansiyeli, M durumunun aktivasyonunu ölçmek için ERG'yi kullanır, çünkü R durumunun katkısı membran kapasitansı tarafından bastırılır. Buna karşılık, ERC hem R (pozitif ERC) hem de M (negatif ERC) durumlarının aktivasyonunu ölçer, çünkü voltaj kelepçeli kayıtlar membran kapasitansının etkisini ortadan kaldırır (girişe bakınız).
<ol><li>Fotopigmenti istenen duruma (R veya M) dönüştürün. R'den M'ye dönüşüm için, önce sinekleri kısa (<1 ms) uyarlanabilir mavi (BP450/40 nm) flaşla uyarlayın. M'den R'ye dönüştürme için, kısa bir uyarlanabilir turuncu (OG590 kenar filtresi) flaş verin.</li>
	<li>350-700 nm arasında bir dalga boyunda kısa bir ışık parlaması (<1 ms) verin ve bu spesifik dalga boyunda M / R absorpsiyonunu yansıtan ERC yanıtının maksimum negatif veya pozitif genliğini ölçün. NOT: Büyük bir fotopigment molekülü havuzunun senkron aktivasyonu için, foton içeriğini kısa sürede paketlemek için kısa, yoğun bir ışık parlaması gerekir. Mavi flaşla R'den M'ye maksimum fotopigment dönüşümü, R ve M'nin absorpsiyon spektrumundaki örtüşme nedeniyle toplam fotopigment moleküllerinin ~% 80'ine ulaşabilir (Şekil 3A). Bu nedenle, ~ 550 nm'nin altındaki dalga boylarında, ERC'nin iki bileşeni vardır: metarodopsinin tepkisini yansıtan negatif bir faz ve kalan rodopsinin tepkisini yansıtan pozitif bir faz. ERC doğrusal olarak ışık yoğunluğuna bağlıdır (Şekil 5D). Buna göre, R ve M durumlarının spektral duyarlılığını elde etmek için, ERC'nin her fazının eşit enerji29 için çeşitli dalga boylarında normalleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>2.1.-2.2 numaralı adımları yineleyin. farklı dalga boylarındaki flaşları kullanarak.</li>
	<li>Normalleştirilmiş pozitif ve negatif ERC'yi dalga boyunun bir fonksiyonu olarak çizin. NOT: Güçlü ışık parlaması, ışığa duyarlı kanallar boyunca fotoreseptör üzerinde metabolik strese yol açan büyük bir akım indükler ve bu da ışıktan bağımsız kanal açılmasına neden olur. ERC bu kurucu akım üzerine bindirilmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Vogt, K., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+identity+of+the+chromophores+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment.</a> Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).</li>
<li>Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+invertebrate+photoreceptors%3A+role+of+pigment+bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability.</a> Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).</li>
<li>Hamdorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHamdorf%2C+K+%22Handbook+of+Sensory+Physiology.+Comparative+Physiology+and+Evolution+of+Vision+in+Invertebrates%22">Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates</a>. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).</li>
<li>Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enigma+of+early+receptor+potential+in+fly+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Enigma of early receptor potential in fly eyes.</a> Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).</li>
<li>Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDA+%28prolonged+depolarizing+afterpotential%29-defective+mutants%3A+the+story+of+nina%27s+and+ina%27s--pinta+and+santa+maria%2C+too%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).</li>
<li>Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+enzymatic+visual+cycle+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).</li>
<li>Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+vision+research.+The+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).</li>
<li>Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPak%2C+WL+%22Neurogenetics%2C+Genetic+Approaches+to+the+Nervous+System%22">Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System</a>. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).</li>
<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+reduction+in+excitation+efficiency+in+the+trp+mutant+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila.</a> The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potentials+arising+from+activation+of+metarhodopsin+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly.</a> The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).</li>
<li>Stephenson, R. S., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogenic+components+of+a+fast+electrical+potential+in+Drosophila+compound+eye+and+their+relation+to+visual+pigment+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion.</a> The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+gene+encoding+a+calmodulin-binding+protein+with+homology+to+the+trp+phototransduction+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene.</a> Neuron. 8, 631-642 (1992).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+light-induced+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+genetics+of+photoreceptors+desensitization+in+Drosophila+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).</li>
<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+the+prolonged+depolarizing+afterpotential+%28PDA%29+and+its+role+in+genetic+dissection+of+Drosophila+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).</li>
<li>Satoh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+stoichiometric+to+rhodopsin+isomerization+and+accelerated+by+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).</li>
<li>Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+arrestin+cycle+secures+the+fidelity+and+maintenance+of+the+fly+photoreceptor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).</li>
<li>Dolph, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+function+in+inactivation+of+G+protein-coupled+receptor+rhodopsin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo.</a> Science. 260, 1910-1916 (1993).</li>
<li>Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+responses+of+fruitflies+with+normal+and+reduced+arrestin+content+studied+by+simultaneous+measurements+of+visual+pigment+fluorescence+and+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).</li>
<li>Stavenga, D. G., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhodopsin+control+by+arrestin%2C+light-filtering+screening+pigments%2C+and+visual+pigment+turnover+in+invertebrate+microvillar+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).</li>
<li>Stark, W. S., Zitzmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adaptation+mechanisms+and+photopigment+spectra+by+vitamin+A+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation.</a> Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+a+sensitizing+pigment+to+the+photosensitivity+spectra+of+fly+rhodopsin+and+metarhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin.</a> The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).</li>
<li>Cone, R. A., Cobbs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+cycle+in+the+living+eye+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin cycle in the living eye of the rat.</a> Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).</li>
<li>Murakami, M., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellularly+recorded+early+receptor+potential+of+the+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors.</a> Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+recording+of+the+early+receptor+potential+in+turtle+cones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Internal recording of the early receptor potential in turtle cones.</a> The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).</li>
<li>Yasin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+mouse+melanopsin+in+Drosophila+photoreceptors+reveals+fast+response+kinetics+and+persistent+dark+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+Ca+2%2B+facilitates+and+inactivates+but+does+not+directly+excite+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors%3A+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Containing+Papers+of+a+Biological+Character.+Royal+Society+%28Great+Britain%29%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Pak, W. L., Lidington, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potential+from+a+long-lived%2C+long-wavelength+photoproduct+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment.</a> The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).</li>
<li>Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+method+for+whole-cell+voltage+clamp+recordings+from+drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).</li>
<li>Selinger, Z., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+lipid+cascade+of+vision+studied+in+mutant+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectrophotometric+evidence+for+two+photoconvertible+states+of+visual+pigments+in+the+barnacle+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye.</a> The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+genetics+of+invertebrate+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The molecular genetics of invertebrate phototransduction.</a> Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).</li>
<li>Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+from+a+transient+inhibition+of+the+oxidative+metabolism+of+the+photoreceptors+of+the+drone+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera).</a> Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca+2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Drosophila fotoreseptör preparatını kullanmanın en büyük avantajı, erişilebilirliği, ışık stimülasyonunun kolaylığı ve doğruluğu ve en önemlisi, moleküler genetiğin gücünü uygulama yeteneğidir7. Kapsamlı genetik çalışmalar, Drosophila'yı karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece yararlı bir model sistem olarak kurmuştur7. Drosophila genomunun nispeten basit yapısı (X ve Y cinsiyet kromozomları, iki büyük otozomal element, ...

Bir G-proteinine bağlı reseptör (GPCR) olan ışıkla aktive olmuş rodopsin ( R ), bir 7 transmembran proteini (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Drosophila melanogaster'de (meyve sineği), foton absorpsiyonu, 11-cis-3-OH-retinal kromoforun all-trans-3-OH-retinal1'e izomerizasyonunu indükleyerek rodopsinin metarodopsine konformasyonel değişimini teşvik eder (M, Şekil 1A). Omurgalı rodopsinin aksine, omurgasız kromoforun baskın fraksiyonu opsin'den ayrışmaz, bu da fizyolojik olarak aktif koyu kararlı pigment durumu M ile sonuçlanır. Buna karşılık, all-trans-3-OH-retinal kromofor tarafından ilave foton emilimi, kromofor 2,3'ün izomerizasyonunu indükleyerek 11-cis-3-OH-retinal kromofor ile R pigment durumunu oluşturur. R durumu karanlık, stabil ve fizyolojik olarak aktif olmayan bir fotopigmenttir. Kromozom4'ün son derece hızlı foton rejenerasyon yoluna ek olarak, omurgalı fotopigmentleri gibi, omurgasızlarda kromofor rejenerasyonu için alternatif bir enzimatik yavaş yol vardır, burada bazı aşamalar fotoreseptör hücrelerini çevreleyen retinal hücrelerde gerçekleştirilir 5,6.
Drosophila, omurgasız fotoreseptörleri incelemek için model bir organizma olarak büyük avantajlar sağlar. Özellikle, preparatın erişilebilirliği ve moleküler genetiği uygulama yeteneği, Drosophila'yı güçlü bir model sistem haline getirmiştir7. Bu nedenle, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigment seviyelerini incelemek için çeşitli in vivo ve ex vivo deneysel yöntemler oluşturulmuştur. En basit in-vivo yöntem, Drosophila gözünün ışığına nispeten büyük hücre dışı olarak kaydedilen voltaj tepkisinden yararlanır. Buna göre, ışık stimülasyonu, tüm gözde, omurgalı gözlerinin ışığına verilen ERG tepkisinden ~ 3 kat daha büyük olan hücre dışı elektroretinogram (ERG) kaydı kullanılarak ölçülebilen bir elektriksel voltaj tepkisi uyandırır 8,9. Drosophila ERG yanıtı sağlamdır ve kolayca elde edilir, bu da mutasyonlara bağlı ışık tepkisindeki anormallikleri tanımlamak için uygun bir yöntemdir. Işığa karşı ERG yanıtı esas olarak fotoreseptörlerden, pigment (glia) hücrelerinden ve laminanın ikincil nöronlarından kaynaklanır (bkz. Şekil 1B). ERG'nin ana bileşenleri (i) fotoreseptörlerin hücre dışı voltaj tepkisi, (ii) lamina nöronlarından kaynaklanan ışık uyaranının başlangıcındaki ve sonundaki "açık" ve "kapalı" geçicilerdir (Şekil 2A, giriş, AÇIK, KAPALI), (iii) glia hücrelerinin yavaş tepkisi (Şekil 2A, giriş, oklar) ve (iv) kısa ve geçici yanıt, fotopigment aktivasyonu sırasında ON geçici10'dan önce gelen yük yer değiştirmesinden kaynaklanır (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu kısa yanıt iki fazdan oluşur (M1 ve M2, Şekil 2C [giriş]) ve sadece milyonlarca fotopigment molekülünü aynı anda aktive eden son derece güçlü ışık stimülasyonu ile indüklenebilir. Ne mavi stimülasyon altında (Şekil 2D, mavi iz) ne de fotopigment seviyeleri oldukça azalmış mutantlarda (Şekil 2E, kırmızı iz) gözlenmez, ancak PLC aktivitesini ortadan kaldıran bir mutantta genliği hafifçe artar (Şekil 2E, turuncu iz). M1 fazı, fotoreseptörlerde M'nin aktivasyonundan kaynaklanan sineğin tipik bir ERP'sidir. Pozitif bir polariteye sahip olan M1 fazı (hücre içi), işaret ters çeviren bir sinapsta normal şekilde bir nörotransmitter salgılar ve sinaptik olarak güçlendirilmiş M2 fazını üreterek fotoreseptör depolarizasyonuna yanıt veren lamina nöronlarını aktive eder. Böylece, hem M1 hem de M2 fazları M aktivasyonu10,11'i yansıtır.
Fotoreseptörün depolarizasyonu, fotoreseptör akson ile lamina10,11'in monopolar nöronları arasındaki işaret ters çeviren sinapstan kaynaklanan kornea pozitif "on" geçicisini üretir (Şekil 1B). ERG'nin yavaş yükselmesi ve çürümesi, esas olarak geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve TRP benzeri (TRPL) kanallar 13,14,15 aracılığıyla fotoreseptör hücrelerinden 12 K+ efflux nedeniyle pigment hücrelerinin depolarizasyonundan kaynaklanır (Şekil 2A, iç kısım, oklar). Bu yavaş kinetik bileşenler, fotoreseptör yanıtınınışık 9,10'a verdiği yanıtın hücre içi veya tüm hücre kayıtlarıyla karşılaştırıldığında, fotoreseptör yanıtının dalga formunu büyük ölçüde maskeler ve bozar. Ek olarak, çok güçlü aydınlatmalarda, "açık" geçiciden önce gelen ve kısmen kaynaşan ek bir geçici tepki gözlenebilir (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu sinyal doğrudan fotopigment10'un masif aktivasyonundan kaynaklanır.
Genel olarak gözü ve özellikle fototransdüksiyon kaskadını araştırmak için nötr yoğunluk (ND) ve renk filtrelerinin yanı sıra güçlü aydınlatıcı flaşlar kullanan çeşitli ışık rejimi protokolleri geliştirilmiştir. Bu protokoller fotopigmentin özelliklerini araştırmak için de kullanılmıştır.
Yoğunluk-yanıt protokolü, tüm gözün artan ışık yoğunluklarına karşı ERG voltaj tepkisinin tepe genliğini ölçer (Şekil 2A, B). Bu protokol, fotoreseptör hücrelerin ışığa duyarlılığındaki değişiklikleri tespit etmeye yardımcıolur 9.
Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) protokolü, rodopsin ve metarodopsinin absorpsiyon spektrumlarındaki farklılıklardan yararlanır ve bu da Drosophila'da, R'nin fizyolojik olarak aktif ve koyu kararlı ara M durumu2'ye büyük bir fotopigment dönüşümüne izin verir. ERG voltaj tepkisinde, nispeten kısa bir doygunluk ışığı darbesi verilir ve ortaya çıkan voltaj tepkisi kaydedilir. Bu durumda, depolarizasyon sinyali ile bir tavana (tersine çevirme potansiyeli) ulaşılır, çünkü büyük miktarda rodopsin molekülünün (~ 1 x 108) yüzde birinin aktivasyonu tavana ulaşmak için yeterlidir. Fototransdüksiyon bileşenlerinin bolca bulunması, bu tavana, konsantrasyonda önemli bir azalma veya fototransdüksiyon bileşenlerinin ince bir arızası ile mutantlarda bile ulaşılmasını sağlar. Bu durum bu mutantların izolasyonunu engellemektedir. Pak ve ark., görsel mutantları izole etmek için güvenilir ve açıklayıcı bir test arayan PDA tarama7'yi tanıttı. Drosophila'da , PDA yanıtı, fotopigment dönüşümüne izin veren kırmızı tarama pigmentinin genetik olarak çıkarılması ve tercihen rodopsin tarafından emilen mavi ışığın uygulanması (Şekil 3A) ile ortaya çıkar ve böylece R'nin M fotopigment durumuna büyük bir net dönüşümü ile sonuçlanır. Fototransdüksiyon sonlandırması, fotopigment seviyesinde, R'nin M'ye büyük bir net dönüşümü ile bozulur ve bu da ışık kapatıldıktan çok sonra sürekli uyarılma ile sonuçlanır (Şekil 2C, Şekil 4A [üst]). PDA döneminde, fotoreseptörler sonraki test ışıklarına karşı daha az hassastır ve kısmen duyarsızlaştırılır (inaktive edilir). PDA, rodopsin biyogenezindeki küçük kusurları bile tespit eder ve uzun süre uyarılmayı sürdürmek için fotoreseptör hücrenin maksimum kapasitesini test eder. Kesinlikle yüksek konsantrasyonlarda rodopsin varlığına bağlı olduğundan, fototransdüksiyon bileşenlerinin eksik yenilenmesi için kolayca puan alır. Dikkat çekici bir şekilde, PDA ekranı birçok yeni ve çok önemli görsel mutant vermiştir (Pak ve ark.7'de gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, Pak ve ark.7 tarafından izole edilen PDA mutantları, Drosophila görsel sistemini analiz etmek için hala son derece yararlıdır.
PDA, Drosophila'da mavi ışığı doyurarak indüklenir ve ışık ofsetinden çok sonra sürekli depolarizasyona neden olur (Şekil 4A [üst]). PDA ile indükleyen mavi ışığı doyurduktan sonra, periferik fotoreseptörler (R1-6) karanlıkta maksimum kapasitelerinde sürekli aktif kalır ve doygunluğa ulaşır. PDA sırasında ilave doygun mavi ışıklar, R1-6 hücrelerinde saniyeler boyunca herhangi bir ek yanıt üretmez, ancak PDA üzerine bindirilmiş R7-8 hücrelerinde bir yanıt indükler. Üst üste binen tepkiler, bu hücrelerde eksprese edilen fotopigmentlerin farklı absorpsiyon spektrumları ile açıklanmaktadır (R7-8)16. PDA, M'nin doygun turuncu ışıkla R'ye geri fotodönüşümü ile bastırılabilir (Şekil 4A [üst]). PDA'nın fotoreseptör hücrelerini maksimum aktif kapasitelerine getirme yeteneği, yoğun beyaz ışıkla elde edilemeyen bir durum, Drosophila'nın görsel mutantlarını taramak için neden önemli bir araç olduğunu açıklıyor. Bunun nedeni, normal fotopigment seviyelerinin biyogenezinde rol oynayan proteinlerdeki küçük kusurların bile tespit edilmesine izin vermesidir17,18. İki grup PDA kusurlu mutantı izole edilmiştir: ne inaktivasyon ne de postpotansiyel (nina) mutantlar ve inaktivasyon, ancak postpotansiyel (ina) mutantlar değil. İlkinin fenotipi, bir PDA eksikliği ve fotopigment seviyelerindeki büyük bir azalmadan kaynaklanan ilişkili inaktivasyondur (Şekil 4A [orta]). İkincisinin fenotipi, mutantta normal rodopsin seviyelerine sahip, ancak TRP kanallarıyla etkileşime giren proteinlerden yoksun olan hala bilinmeyen bir mekanizma nedeniyle mavi ışıktan sonra inaktivasyon gösterir, ancak karanlık depolarizasyon yoktur (Şekil 4A [alt]).
PDA, M aktivitesi 19,20,21'i bağlayan ve sonlandıran arrestine (ARR2) göre fotopigment miktarındaki farktan kaynaklanır (Şekil 1A). Drosophila fotoreseptörlerinde, fotopigment miktarı ARR219 miktarından yaklaşık beş kat daha büyüktür. Bu nedenle, ARR2 seviyeleri, R'den M'ye büyük bir net fotodönüşümü ile üretilen tüm M moleküllerini etkisiz hale getirmek için yetersizdir ve karanlıkta 17,19,20,22,23 sürekli aktif olan M fazlalığını bırakır. Bu mekanizma, PDA yanıtının mutasyonlarla veya karotenoid yoksunluğu24,25 ile ortadan kaldırılmasını açıklar, fotopigment seviyesinde bir azalmaya neden olur, ancak arrestin seviyelerini etkilemez. Dahası, bu açıklama aynı zamanda null ARR2 (arr23) mutant alel21'in fenotiplerini de açıklamaktadır, burada PDA, ~ 10 kat daha kısık mavi ışık yoğunluklarında19,20,21'de elde edilebilir (Şekil 4B, C). PDA, sinek fotoreseptörlerinin benzersiz bir özelliği değildir ve R durumundan farklı bir absorpsiyon spektrumuna sahip karanlık kararlı M'ye sahip test edilen her türde ortaya çıkar ve fotopigmentin R'den M durumuna yeterli fotodönüşümüne izin verir. PDA fenomenolojisinin keşfedildiği iyice araştırılmış bir tür, R durumunun absorpsiyon spektrumunun M durumu2'den daha uzun bir dalga boyunda olduğu barnacle (Balanus) fotoreseptörüdür (Şekil 3B). Buna göre, sinekteki durumun aksine, ahırda, turuncu-kırmızı ışık bir PDA'yı indüklerken, mavi ışık PDA2'yi bastırır.
Erken reseptör potansiyeli (ERP) protokolü, R veya M aktivasyonu sırasında meydana gelen yük yer değiştirmesinden yararlanır. Görsel pigment, hem omurgalı hem de omurgasız membranların sinyal bölmesinin yüzey zarının ayrılmaz bir parçasıdır3. Buna göre, fotopigment moleküllerinin bir ara durumdan diğerine değiştiği aktivasyon sürecine, 4,26'lık bir yük yer değiştirmesi eşlik eder. Fotopigment molekülleri, membran kapasitansı4'e paralel olarak elektriksel olarak hizalandığından, hızlı bir senkronize konformasyonel değişim, yüzey zarının hızlı bir polarizasyon değişimini üretir; bu, sineklerde, rabdomere adı verilen ~ 30.000-50.000 mikrovillusluk bir yığından oluşan sinyal bölmesinde meydana gelir. Bu polarizasyon daha sonra hücre zarı eşit derecede polarize olana kadar hücre gövdesinin membran kapasitansından pasif olarak boşalır. ERP, yük yer değiştirmesinin hücre dışı kaydıdır. Hücre içi olarak kaydedilen ERP,hücre zarının zaman sabiti 4,27,28 ile entegre edilmiş hücre dışı ERP'yi gösterir. Görsel pigment yükü deplasmanı tarafından aktive edilen akım, membran kapasitansının sinyalin kinetik üzerindeki etkisini en aza indirmenin en büyük avantajı (erken reseptör akımı (ERC) kayıtları) ile tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtlarında29,30 (Şekil 5A-D) olarak da ölçülebilir.
Protokol bölümü, Drosophila göz9'dan ERG ölçümlerinin ve Drosophila izole ommatidia 31,32'den tüm hücre kayıtlarıyla ERC ölçümlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigmentleri araştırmak için kullanılan spesifik protokolleri de açıklıyoruz.

<table><tbody><tr>Uzatılmış uçlu <td></td><td></td><td>1 mL şırınga</td><td>Şekil 6M</td></tr><tr><td>1 kaba cımbız</td><td></td><td>Dumont #5, Standart</td><td>0,1 mm x 0,06 mm, uzunluk 110 mm, Inox (Şekil 6H)</td></tr><tr><td>2 kondenser lensler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D dönüştürücü</td><td>Moleküler Cihaz</td><td>Digidata 1200</td><td>Olası değiştirme: moleküler cihazlardan gelen herhangi bir dijital veri (örn. 1440A) -Şekil 7C</td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Neredeyse mükemmel elektronikler</td><td></td><td>Olası değiştirme: Warner aletleri- IE251A veya IE-210 (headstage ile birlikte gelir)- Şekil 7D</td></tr><tr><td>Titreşim Önleyici Tablo</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td>Şekil 7H</td></tr><tr><td>Kılcal Damarlar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>1 mm x 0.58 mm (Şekil 6O)</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Moleküler Cihaz</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>CO2 </ tank altı></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğuk ışık kaynağı Schott</td><td></td><td>KL1500 LCD</td><td>Şekil 6C</td></tr><tr><td>Hassas silecekler</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes (Şekil 6K)</td></tr><tr><td>Elektrot tutucu</td><td></td><td></td><td>Kılcal damar OD 1 mm için uygundur (Şekil 6N, Şekil 7N ve Şekil 7P)</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Elektromanyetik gürültü koruması ve siyah ön perde (Şekil 7K)</td></tr><tr><td>Filtre (Renk)</td><td>Schott</td><td>OG590, Kenar filtresi</td><td>Şekil 7S</td></tr><tr><td>Filtre (Renk)</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>Şekil 7S</td></tr><tr><td>Filtre (Renkli)</td><td>Blazers</td><td>550 nm</td><td>Şekil 7S</td></tr><tr><td>Soğuk ışık kaynağı için filtre (Renk)</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>Şekil 6C</td></tr><tr><td>Filtre (Isı)</td><td>Schott</td><td>KG3</td><td>Şekil 7S</td></tr><tr><td>Filtreler (Nötr yoğunluk filtresi)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td>Şekil 7S</td></tr><tr><td>Flaş Lambası sistemi</td><td>Honeywell</td><td></td><td>Şekil 7U</td></tr><tr><td>Enjektörlü sinek travers sistemi</td><td>Enjekte + matik</td><td></td><td>Şekil 6A-B</td></tr><tr><td>Lamba güç kaynağı</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>Şekil 7W</td></tr><tr><td>Işık dedektörü</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Fototransistör (Şekil 7O)</td></tr><tr><td>Işık kılavuzu</td><td></td><td></td><td>3 mm çap, 1,3 m uzunluk (Şekil 7L,M)</td></tr><tr><td>Işık kaynağı</td><td></td><td></td><td>Yüksek basınçlı ozonsuz 75 W Xenon lamba (50 W ile çalışır), olası değiştirme: Cairn research- OptoLED (Şekil 7R)</td></tr><tr><td>Düşük sıcaklıkta eriyen balmumu</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Balmumu (Tm&asimp; 62 ve derece; C) ve ~ 55 & ndash erime sıcaklığına ulaşmak için ~ 3: 1'de parafin; 56 & derece; C (Şekil 6J)</td></tr><tr><td>Sinekler için manyetik stand</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Şekil 6I ve Şekil 7Q</td></tr><tr><td>Kafa aşamalı mikroelektrot ön yükseltici sistemi</td><td>Neredeyse mükemmel elektronik</td><td></td><td>Empedans test cihazı (Şekil 7G)</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör (mekanik kaba)</td><td>Tritech Research, Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör (mekanik ince)</td><td>Leitz Microsystems</td><td>Leitz Mekanik Mikromanipülatör</td><td>Şekil 7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Moleküler Cihaz</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Darbe üreteci</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td>Şekil 7A</td></tr><tr><td>Elektrokardiyografi için Redux krem</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux Elektrolit Cr&egrave; me</td><td></td></tr><tr><td>Deklanşör sürücüsü</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>VCM-D1 Tek Kanallı Tek Kararlı</td><td>Şekil 7V</td></tr><tr><td>Deklanşör sistemi</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm Tek Kararlı Kepenkler</td><td>Şekil 7V</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25&ndash; 1 mm çapında, klorürlenmesi gerekiyor</td></tr><tr><td>0,25 mm çapında</td> <td>platin-iridyum filamentinden</td><td></td><td></td> oluşan havya (Şekil 6F)</tr><tr><td>Stereoskopik yakınlaştırma Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td>Şekil 6D</td></tr><tr><td>Stereoskopik yakınlaştırma Mikroskobu</td><td>Wild</td><td>Wild M5</td><td>6, 12, 25 ve 50 büyütme ayarlı (Şekil 7E)</td></tr><tr><td>Şırınga filtreleri</td><td>Millex</td><td></td><td>22 & m PVDF filtresi</td></tr><tr><td>Dikey pipet çektirmesi</td><td>Sutter/ Narishige</td><td>Model P-97/PP-830</td><td>Tercih edildiği gibi dikey veya yatay çektirme kullanın (Şekil 6L)</td></tr><tr><td>Balmumu filament ısıtıcı</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Şekil S1'e bakın (Şekil 6E-G)</td></tr><tr><td>Xenon Flaş Lambası sistem</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>Şekil 7X</td></tr></tbody></table>

drosophila fotoreseptörlerinde fotopigment düzeylerini Ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

Drosophila G-proteinine bağlı fotopigment rodopsin ( R ) bir protein (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Rodopsinin aktivasyon süreci, kromoforun foton emilimine neden olan izomerizasyonu ile başlatılır, opsinin konformasyonel değişikliklerini teşvik eder ve ikinci bir koyu kararlı fotopigment durumu (metarhodopsin, M) ile sonuçlanır. Bu iki kararlı fotopigmentin rastgele mutajenez kullanılarak araştırılması, mutant sineklerin taranması için basit ve sağlam yöntemler gerektirir. Bu nedenle, fonksiyonel fotopigment seviyelerindeki azalmaları ölçmek için çeşitli yöntemler tasarlanmıştır. Böyle bir yöntem, foton emilimini takiben fotopigment içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerde eksprese edilen büyük miktarda fotopigment molekülünü kullanır. Erken reseptör potansiyeli (veya erken reseptör akımı) olarak adlandırılan bu elektrik sinyali, çeşitli elektrofizyolojik yöntemlerle (örneğin, elektroretinogram ve tüm hücre kayıtları) ölçülür ve fonksiyonel fotopigment seviyeleri ile doğrusal olarak orantılıdır. Bu yöntemin avantajları, yüksek sinyal-gürültü oranı, fotopigment seviyelerinin doğrudan doğrusal ölçümü ve rodopsin veya metarodopsin aktivasyonuna kadar aşağı akış fototransdüksiyon mekanizmalarının bağımsızlığıdır. Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) adı verilen ek bir elektrofizyolojik yöntem, Drosophila fotopigmentinin bi-stabilitesini ve sinek R ve M pigment durumlarının emilim-spektral farklılıklarını kullanır. PDA, yoğun mavi ışık tarafından indüklenir, doygun miktarda rodopsinin metarodopsine dönüştürülmesi, karanlıkta uzun bir süre boyunca ışık tepkisi sonlandırmasının başarısız olmasına neden olur, ancak yoğun turuncu ışık kullanılarak metarodopsin'den rodopsine dönüşüm ile sonlandırılabilir. PDA, büyük fotopigment dönüşümü gerektiren sağlam bir sinyal olduğundan, fotopigmentin biyogenezindeki küçük kusurlar bile kolayca tespit edilen anormal PDA'ya yol açar. Gerçekten de, kusurlu PDA mutantları, fototransdüksiyon için önemli olan yeni sinyal proteinlerinin tanımlanmasına yol açmıştır.

Şekil 2, ERG tekniğinin sağlamlığını ve kullanım kolaylığını örneklemektedir. Sağlamdır, çünkü basit bir elektrofizyolojik kurulum gerektiren basit bir hücre dışı voltaj kayıtları tekniği ile neredeyse bozulmamış sinekte kaydedilir. Sağlamlık, mutasyonlar ışık tepkisini güçlü bir şekilde azalttığında veya bozduğunda bile, nispeten büyük genliklere sahip (milivolt aralığında) ışık tepkilerinin kayıtlarının elde edilmesiyle kendini gösterir. Bu nedenle, deneyimsiz bir deneyci bile son derece b...

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Bu protokol özellikle görsel olarak kusurlu Drosophila mutantlarının genetik taraması için uygundur. Bunun nedeni, Drosophila fototransdüksiyonunda, özellikle fotopigment seviyelerinde ve katman akranla ilgili fonksiyonlarda küçük anormalliklerin bile tespit edilmesine izin vermeleridir. Bu teknik in vivo olarak derindir, uygulanması kolaydır ve oldukça sağlamdır, fototransdüksiyon proteinlerinin aktivitesindeki küçük değişikliklerin tespit edilmesini sağlar.Benim düşünceme göre, canlılığı korurken sinekleri sabitlemek muhtemelen bu yöntemin kritik kısmıdır. Bilgisayarı açın ve Clampex yazılımını açın. Amplifikatörü ve Master-8 darbe jeneratörünü açın, ardından xenon lambasını ve deklanşör denetleyicisini açın.Çektirmeyi açın ve çektirmeye bir cam kılcal damar yerleştirin ve çekin. Cam kılcal damarı çektirmede çıkarın. Cam kılcal damarı, uzun uçlu bir şırınga kullanarak filtrelenmiş zil çözeltisi ile doldurun.Tel elektrodu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal damar içindeki çözeltinin gümüş tel ile temas halinde olduğundan emin olun. Elektrot tutucuları iki elektrot mikromanipülatörüne yerleştirin.Lehimleme demirinin güç kaynağını açın. Akımı yaklaşık 2,25 ampere ayarlayın. Bu akım, 0.25 milimetrelik platin-iridyum filamentini yaklaşık 55 ila 56 santigrat dereceye ısıtmalıdır.Havya üzerine düşük erime sıcaklığına sahip bir damla balmumu yerleştirin. Şişe içindeki sinekleri anestezi altına alın. Anestezi altındaki sinekleri uyuyan kaba dökün, bir sinek seçin ve sineklerin geri kalanını bir Petri kabı ile örtün.Keskin bir cımbız kullanarak sineği kanatlarından dikkatlice tutun ve sinek tutucuya yerleştirin. Sinek tutucusuna, sineği sırtı ele doğru olacak şekilde yan yatacak şekilde yerleştirin. Cımbız kullanarak, sineği kanatlarından kaldırın ve havyayı kullanarak kanatlarını sinek tutucusuna sabitleyin.Sineğin sırtını, havyayı kullanarak balmumu ile stand yüzeyine bağlayın. Havyanın ucunu bacakların birleşme noktasına indirin, ardından tüm bacakları birlikte örtmek için balmumunu eritin. Boyun bölgesinde baş ve boyun arasına küçük bir damla balmumu yerleştirin.Sinek tutucuyu bir mıknatıs bloğu üzerindeki karanlık bir faraday kafesine yerleştirin ve sineğin ışık kılavuzunun ucundan yaklaşık beş milimetre uzakta olduğundan emin olun. Kayıt elektrodunu sineğin gözünün üzerine ve toprak elektrotunu mikromanipülatörleri kullanarak sineğin üst sırtına yerleştirin. Daha sonra mikromanipülatörleri kullanarak toprak elektrodunu sineğin arkasına yerleştirin.Kayıt elektrodunu sinek gözünün dış çevresine, tercihen mikro manipülatörleri kullanarak yerleştirin. Faraday kafesini kapatın ve beş dakika boyunca karanlığa adaptasyona izin vermek için odadaki ışıkları kapatın. Saniyede 500 metrelik bir darbe süresinden, 60 saniyelik bir darbe aralığından ve altıya ayarlanmış darbe sayısından başlayan parametreleri girin.PDA'yı ölçmek için, Master-8 darbe jeneratörünü TRAIN moduna ayarlayın, ardından turuncu bir filtre kullanarak maksimum yoğunlukta beş saniyelik bir ışık darbesi verin. Voltaj tepkisini kontrol edin. Turuncu filtreyi geniş bant mavi filtreyle değiştirin ve maksimum yoğunlukta üç adet 5 saniyelik ışık darbesi verin.Voltaj tepkisini kontrol edin. Karanlıkta en az 60 saniye bekleyin. Mavi filtreyi önceki turuncu filtreyle değiştirin.Ardından, 60 saniyelik aralıklarla iki adet 5 saniyelik ışık darbesi verin. Voltaj tepkisini kontrol edin. ERP M potansiyelini ölçmek için, kararlı durum voltaj tepkisine ulaşılana kadar sürekli bir mavi ışık darbesi verin.20 nanometre bant geçişli bir filtre kullanarak 350 ila 700 nanometre arasında bir dalga boyunda kısa bir yoğun ışık parlaması verin. Daha sonra, fotodengede bu spesifik dalga boyundaki metarodopsin absorpsiyonunu yansıtan M-potansiyel yanıtının M1 fazının tepe genliğini ölçün. PDA yanıtları farklı mutant sinekler için değerlendirildi.Vahşi tip sinekler, yoğun mavi ışık stimülasyonunu takiben, karanlıkta uzun süreli kornea negatif ERG olarak ortaya çıkan doymuş bir depolarizasyon gösterdi. Aşağıdaki mavi ışıklar, PDA üzerine bindirilmiş, açma ve kapama geçicilerinden yoksun küçük tepkiler üretti. NinaE gibi anormal fotopigment biyogenezi olan mutant sineklerde, voltaj tepkisi yoğun mavi ışık stimülasyonunu takiben taban çizgisine geri döndü ve ek bir mavi ışığa verilen yanıt bastırılmadı ve normal açılma ve kapanma geçicileri gösterdi.Sineklerin vahşi tip ERP'si aynı protokolle elde edilir, ancak PDA sırasında yoğun bir yeşil flaş uygulanır. Bu yeşil flaş ERP'yi ortaya çıkardı ve PDA'yı bastırdı. M-potansiyeli, mavi aydınlatmayı takip eden yeşil flaşla elde edildi, ancak vahşi tip sineklerde mavi aydınlatmadan sonra mavi bir flaşla elde edilmedi.Bu protokol vahşi tipte, fotopigment hipomorf mutant ninaE'de ve normal fotopigment düzeyleri norpA olan fototransdüksiyon eksikliği olan mutantta tekrarlandı. Sinek rodopsinin ve metarodopsinin nispi absorpsiyon spektrumları, farklı spektrumun ve fotodenge spektrumunun fotometrik ölçümlerinden hesaplandı. Sineklerin hayatta kalması için aşırı ısınmaktan kaçınarak balmumu viskozitesine dikkat etmek önemlidir.Bu prosedür genetik ve kusurlu görsel mutantların taranması için uygundur. Görsel mutasyonları rastgele izole eden ve tanımlayan yöntemler, Drosophila fototransdüksiyonunda yer alan yeni proteinlerin ve mekanizmaların keşfedilmesini kolaylaştırabilir. PDA protokolü, önemli ve yeni görsel mekanizmaların izolasyonunu sağladı.Katılım muhtemelen başka türlü keşfedilmemiş veya hatta beklenmeyecekti.

electrophysiological-methods-for-measuring-photopigment-levels

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, hareketsiz hale getirilmiş bir Drosophila'nın gözündeki fotoreseptör aktivitesinin elektrofizyolojik kaydı için protokolü ana hatlarıyla belirtir ve ışık uyaranlarına yanıt olarak voltaj değişikliklerinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Drosophila Retinal Fotoreseptörlerinin Işık Uyaranlarına Voltaj Yanıtlarının Elektrofizyolojik Kaydı

Video, bir tam hücre konfigürasyonu oluşturarak Drosophila'nın ommatidiumunun fotoreseptör nöronlarındaki elektriksel aktivitenin kaydedilmesini göstermektedir. Geçici reseptör potansiyel kanallarının ışık darbeleri ile aktivasyonunu vurgular ve ölçülebilir kuantum çarpmalarına neden olur.

Drosophila Fotoreseptörlerinden Tüm Hücre Voltaj Kelepçesi Kayıtları

Bu video, beyaz gözlü Drosophila'da uzun süreli depolarize edici artpotansiyel (PDA) araştırmak için deneysel bir protokolü göstermektedir. Sineğin gözü, fotopigment rodopsini metarhodopsine dönüştürmek için yoğun mavi ışık darbelerine maruz bırakılır ve pozitif iyon kanallarını açan ve membran depolarizasyonuna neden olan bir sinyal kaskadı başlatır. Mavi ışık, metarhodopsinin rodopsine yeniden dönüşümünü önlediğinden, pozitif iyonların sürekli akışı, uzun süreli depolarize edici son...

Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

Kaynak: Wagner, K.  et al., eGFP Etiketli Proteinler Kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022). Bu video, eGFP etiketli TRPL proteinleri kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein trafiğinin görselleştirilmesini göstermektedir. Görüntüleme için transgenik sineklerin hazırlanmasını, fotoreseptör hücrelerinin floresan görüntülerinin yakalanmasını ve rabdomerelerde nispi eGFP floresansının ölçülmesiyle...

Drosophila fotoreseptör hücrelerinde membran protein kaçakçılığının incelenmesi

hücre içi kayıt elektrofizyolojik teknik gösterdi ve bir kelebeğin bileşik gözünde tek fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini belirlemek için kullanılır.

bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre içi Kayıtlar

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Keşfedin Drosophila fotoreseptörlerinde elektrofizyolojik yöntemlerle fotopigment düzeylerini ölçme tekniğini. Bu yöntem görsel mutasyonların genetik taraması için güçlü bir araç sunar.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Daha fazla video keşfet