200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması
16 Mart 2022
Makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM haritaları da 200 kV TEM mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, 200 kV TEM kullanarak yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde toplanması için gerekli olan doğru optik hizalamaları, veri toplama şemalarını ve görüntüleme alanlarının seçimini ayarlamak için en iyi uygulamaları gösterir.
Cryo-EM, proteinlerin ve komplekslerinin yapı tayini için standart bir teknik haline gelmiştir. Bu protokol, orta menzilli 200 kV TEM mikroskoplardan yüksek çözünürlüklü Cryo-EM veri kümelerinin nasıl elde edileceğine ilişkin en iyi uygulamaları açıklar. Cryo-EM, aynı anda çoklu konformasyonel durumlar ve fonksiyonel durumlar için çözelti içinde yakın doğal koşullarda protein yapısını belirleyebilir, bu da diğer yapısal teknikler için zordur.
Elde edilen yapısal bilgiler, protein fonksiyonunun moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasında ve yapı bazlı ilaç tasarımında kullanılabilir. Örneğin, amiloid fibrillerinin yapısındaki yeni bir yayın, hayati bir ligandın çoklu bağlanma bölgelerini ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bu protokolde, yüksek çözünürlüklü Cryo-EM verilerinin elde edilmesindeki kritik adımları göstermek için standart apoferritin ve proteazom örneklerini kullanıyoruz.
Bir Cryo-TEM'in çalıştırılması, özellikle gelişmiş otomasyon özelliklerinin tanıtılması nedeniyle son yıllarda daha kolay hale gelmiştir. Ancak, ilk oturum için, daha deneyimli kullanıcılarla bir eğitim almanızı tavsiye ederiz. Oradan, teknikteki ilerleme nispeten hızlıdır.
Prosedürü gösteren, Thermo Fisher Scientific'te kıdemli bir uygulama bilimcisi olan Adrian Koh olacak. Otomatik ızgaraları sıvı nitrojen koşulları altında otomatik yükleyici kasetine takın. Otomatik ızgaralı kaseti sıvı azot soğutmalı transfer kapsülüne yerleştirin.
Ayrıca kapsülü mikroskopa yerleştirin ve kaseti kapsülden mikroskobun otomatik yükleyicisine yüklemek için mikroskop kullanıcı arayüzündeki Dock düğmesine tıklayın. Yüklenen kasetteki otomatik ızgaraların varlığını kontrol etmek için Envanter düğmesine tıklayın. Ardından, otomatik ızgaraları TEM görüntüleme sütununa eklemek için Yükle ve Kaldır düğmelerine tıklayın.
Atlas sekmesini seçin ve yeni bir oturum açmak için Yeni Oturum düğmesine tıklayın. Oturum adı ve veri depolama konumu gibi ayrıntıları doldurun ve Uygula düğmesine tıklayın. İlgili kılavuz numarasının yanındaki onay kutusunu işaretleyerek ilgilendiğiniz kılavuzları seçin.
Seçilen tüm ızgaraların tam otomatik atlas koleksiyonunu başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. Koleksiyon tamamlandığında, alınan atlasları incelemek için ızgara etiketlerine tıklayın. EPU sekmesini seçin ve sol panelde yeni bir oturum oluşturmak için Yeni Oturum'a gidin.
Geçerli ayarlanmış optik hazır ayarları kullanmak için Yeni Oturum seçeneğini belirleyin. Oturum adını girin. Protokolün ilerleyen bölümlerinde veri toplama için seçilen tek tek deliklerin ve ızgara karelerinin seçimi üzerinde denetime sahip olmak için oturumun el ile türünü seçin.
Veri toplama için sapmasız görüntü kaydırmayı kullanmak üzere daha hızlı alma modunu seçin. Ardından, meta verilerin kaydedileceği konumu girin. Yeni bir oturum oluşturmak için Uygula düğmesine tıklayın.
Izgaranın toplanan atlasını göstermek için sol paneldeki kare seçim görevini seçin. Izgara karelerini hasarsız destek folyosu, ince vitreus buzu ve folyo delikleri, ızgara karesinde ihmal edilebilir kristal buz kirliliği ve ızgara karesi boyunca ve bireysel folyo delikleri içinde minimum parlaklık gradyanı ile tanımlayın. Tam atlas veya yüksek kaliteli kutucuk görüntülerinde veri toplama için ızgara karelerini seçin.
İlgilendiğiniz bir ızgara karesine sağ tıklayın ve tüm seçim görevini seçin. Otomatik Ösantrik düğmesine tıklayarak otomatik olarak seçilen ilk ızgara karesine gidin. Ösentrik yüksekliği ayarlayın ve folyo deliklerini bulmak için ızgara kare görüntü elde edin.
Görüntüdeki folyo deliklerini bulmak için Delikleri Bul düğmesine tıklayın. Izgara çubuklarının yakınındaki deliklerin seçimini kaldırmak üzere ızgara çubuğu düğmesini kapatmak için Delikleri Kaldır düğmesine tıklayın. Çok kalın buzlu tüm delikleri ve tüm boş delikleri kaldırmak için buz filtresinin parlaklık histogramındaki sınırları ayarlayın.
Izgara kare görüntüsündeki bir deliğe sağ tıklayın ve burada sahneyi konuma taşı aşamasını seçin. Sol panelde şablon tanımı görevini seçin. Tüm görüntüyü elde etmek için Al düğmesine tıklayın.
Görüntü kaydırma sonrası gecikme değerlerini 0,5 saniyeye ve sahne alanı kaydırma sonrası gecikmeyi beş saniyeye ayarlayın. Görüntüdeki bir deliği ortalamak için Delik Bul ve Ortala düğmesine tıklayın. Alım Alanı Ekle düğmesini seçin ve yüksek büyütmeli görüntü alımının yapılacağı ortalanmış delikteki konumu seçmek için resme tıklayın.
Otomatik Netleme Alanı Ekle düğmesini seçin ve görüntü otomatik odaklamanın gerçekleştirileceği ortalanmış deliğin yanındaki destek folyosundaki konumu seçmek için görüntüye tıklayın. Yazılım penceresinin üst kısmındaki bulanıklaştırma listesinde bir dizi bulanıklaştırma değeri ayarlamak için yeşil Edinme Alanı'na tıklayın. Otomatik netlemeye özgü ayarları yaptıktan sonra, her AFIS kümesinin başında otomatik netlemeyi Ortaladıktan Sonra seçeneğini belirleyin.
Daha hızlı otomatik odaklama ve daha az sahne alanı sürüklenmesi için Hedef Lens seçeneğini belirleyin. Veri toplamayı ve seçilen diğer tüm ızgara karelerini bu ilk ızgara karesinde kullanılan ayarlara göre otomatik olarak ayarlamak için delik seçimi görevindeki Tüm Kareleri Hazırla düğmesine tıklayın. Şablon tanımı görevini seçin, yeni bir görüntü edinin, sağ tıklayarak sahne alanını karbon folyo üzerinde temiz bir alana taşıyın ve sahneyi buraya taşı menü seçeneğini seçin.
Otomatik İşlevler sekmesini seçin. İstediğiniz bulanıklaştırmayı ve yinelemeyi ayarladıktan sonra, otomatik odaklama ön ayarına geçin ve otomatik odaklama işlevini çalıştırmak için Başlat Düğmesine tıklayın. Otomatik Damgalama görevini seçin, Thon Ring hazır ayarına geçin ve Başlat düğmesine basın.
Otomatik Haberleşme görevini seçin ve Başlat düğmesine basın. Sahne alanını bozuk ızgara karesi olan bir alana taşıyın. Tek bir otomatik odaklama görüntüsü alarak alanın saydamlığını onaylayın.
Sherpa UI'yi açın ve Enerji Filtresi uygulamasını seçin. Sıfır kayıp enerji filtresi yarığını ortalamak için Orta düğmesine ve sıfır kayıp seçeneğine tıklayın. İzokromatisite seçeneğindeki Ayarla düğmesine tıklayın.
Geometrik ve kromatik bozulmalarda Ayar Büyütme ve Ayar Bozulmaları seçeneğine tıklayın. EPU sekmesine gidin, Otomatik Edinme görevini seçin ve tam otomatik veri toplamaya başlamak için Çalıştırmayı Başlat düğmesine tıklayın. Şekil, ızgara yüzeyi üzerinde buz kalınlığının bir gradyanını gösteren Cryo-EM ızgaralarını göstermektedir.
Daha fazla araştırmadan hariç tutulan ızgaralar, kalın buzlu kötü ızgara ve kötü buz ve kirlenme ile bükülmüş bir ızgara iken, kabul edilebilir ızgaralar iyi buz gradyanına sahip olanlar ve iyi ince buz ve küçük buz gradyanı olan tipik bir ızgaradır. Şekil, yeniden yapılandırılmış apoferritin Cryo-EM haritasının son 3D görüntüsünü göstermektedir. Yüksek stabilite ve simetri, onu yüksek çözünürlüklü Cryo-EM görüntüleme ve görüntü işleme için en uygun referans örneği haline getirir.
Bayes parlatma, CTF iyileştirme ve Ewald küre düzeltmesi 1.63 angstrom çözünürlüklü bir harita ile sonuçlandı. Şekil, bireysel amino asit yan zincir seviyesinde yeniden yapılandırılmış apoferritin Cryo-EM haritasının ayrıntılı bir görünümünü göstermektedir. Amino asit yan zincirlerinin yoğunluğu iyi çözülmüştür ve atomik model harita içinde açık bir şekilde inşa edilebilir.
Buradaki görüntü, aynı Cryo-EM ızgarasından toplanan farklı bulanıklaştırma değerlerinde iki farklı veri kümesini, tamamen açık bir yarık ve 10 elektron voltluk bir yarık ile benzer ızgara kareleri ile göstermektedir; bu, 10 elektron voltluk yarığın görüntü kontrastını önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermektedir. Buradaki şekil, standart Cryo-EM örneği olarak kullanılan segmentli alt birimlere sahip 20S proteazom Cryo-EM haritasına genel bir bakış göstermektedir. Ve takılı bir atomik modelle yakınlaştırılmış görünümü, proteazom kompleksinin D7 simetrisine sahip kararlı katalitik çekirdeğini temsil eder.
Protokol iki kritik adım içerir. Birincisi, homojen parçacıklar içeren ince vitreus buzlu alanları aramak. İkincisi, veri toplama için paralel aydınlatmanın kurulması.
Çözünürlükte iki ila üç angstrom elde eden proteinlerin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlarıyla, hastalığın moleküler mekanizmalarını daha iyi anlayabilir ve ilaç kurşunlarını iyileştirebilirsiniz. Önceden, biyolojik olayların yapısal temelini incelemek istiyorsanız kristalleşme gerekliydi. Bugün Cryo-EM ile, bu artık gerekli değil.
Ve böylece Cryo-EM ile, bilim adamlarının yapısal düzeyde daha geniş bir biyolojik fenomen yelpazesini incelemelerini sağlıyoruz.
Genel Bakış
Bu protokol, 200 kV TEM mikroskopları kullanarak yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri setleri elde etmek için en iyi uygulamaları belirlemektedir. Doğru optik hizalamalar, veri toplama şemaları ve görüntüleme alanı seçimini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kriyo-Elektron Mikroskobu
- Strüktürel Biyoloji
Arka Plan
- Kriyo-EM, protein yapısı belirleme için standart bir tekniktir.
- Proteinlerin neredeyse doğal koşullarda çalışılmasını sağlar.
- Bu yöntem aynı anda birden fazla konformasyonel ve fonksiyonel durumu yakalayabilir.
- Son gelişmeler, Kriyo-TEM'lerin kullanımını kolaylaştırmıştır.
Çalışmanın Amacı
- Yüksek çözünürlüklü Kriyo-EM verilerini elde etme sürecindeki kritik adımları göstermek.
- Apoferritin ve proteazom gibi standart örneklerin kullanımı için bir protokol sağlamak.
- Ayrıntılı yapısal bilgiler aracılığıyla yapı temelli ilaç tasarımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Örnek hazırlığı için otomatik ızgaraların ve sıvı nitrojen koşullarının kullanımı.
- Seçilen ızgaralardan atlasların otomatik toplanması.
- Veri toplama için ızgara karelerinin manuel seçilmesi.
- Verimli veri toplama için gelişmiş otomasyon özelliklerinin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- 200 kV TEM mikroskoplarından yüksek çözünürlüklü veri setlerinin başarılı bir şekilde elde edilmesi.
- Görüntüleme için en uygun ızgara karelerinin belirlenmesi.
- Otomatik ve manuel veri toplama tekniklerinin gösterimi.
- Gelecek çalışmalar için güvenilir bir protokolün kurulması.
Sonuçlar
- Protokol, yüksek çözünürlüklü Kriyo-EM verilerini elde etmek için kapsamlı bir rehber sağlar.
- Yeni başlayanlar için deneyimli kullanıcılarla eğitim alınması tavsiye edilir.
- Otomasyondaki gelişmeler, Kriyo-EM işlemlerinin verimliliğini artırmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-resolution cryo-EM using 200 kV TEM systems enables routine atomic-level protein structure determination, expanding access beyond specialized 300 kV platforms. Automation and real-time quality assessment streamline data acquisition, supporting rapid, reproducible generation of structural insights for early-stage drug discovery. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and lead identification inflection points across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables elucidation of molecular mechanisms underlying protein function and disease relevance.
- Supports structure-based drug design by providing atomic-resolution maps for target interrogation.
- Facilitates functional target validation through direct visualization of conformational and binding states.
- Reduces reliance on crystallization, broadening the range of tractable targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated structural templates for downstream screening and assay development workflows.
- Standardizes imaging parameters and data quality, ensuring reproducibility across experiments.
- Enables quantitative assessment of ligand binding and conformational changes.
- Supports scalable, automated data collection for high-throughput structural screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by clarifying structure-function relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions 200 kV cryo-EM as a core capability from early discovery through preclinical research, bridging target validation, lead identification, and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein structures in near-native states.
- Screening: Provides reproducible, quantitative structural data for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Enables high-resolution measurements and statistical comparison of structural conditions and ligand interactions.
- Translational Research: Connects atomic-level insights to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, automated workflow adaptable across diverse protein targets and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and real-time quality control.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM operation and data interpretation, with initial training recommended.
- Needs access to 200 kV TEM systems equipped with energy filters and direct electron detectors.
- Demands robust data management and quality assessment infrastructure for high-throughput workflows.
- Standardization of imaging parameters and automation protocols is critical for cross-team reproducibility.
- Adaptation to specific protein targets may require optimization of sample preparation and imaging conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
