Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Kuyruklu yıldız testi, genotoksisiteyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Protokolümüz, standart kuyruklu yıldız testine göre bir dizi metodolojik avantaj sunmaktadır. Teknolojimiz, standart kuyruklu yıldız slaytlarını dikey olarak tutmaya ve amaca yönelik bir rafta 25'lik gruplar halinde işlenmeye odaklanmaktadır.

Buna elektroforez de dahildir, bu nedenle tank daha küçüktür, daha az tampon kullanır ve entegre soğutmaya sahiptir. Bir rafta tutulan slaytlardaki hassas jeller daha fazla korunur ve 25 saniye içinde çözeltiden çözeltiye geçer. Kan kuyruklu yıldızı protokolümüzü kullanarak, araştırmacılar insanlarda, diğer türlerde ve çok çeşitli potansiyel olarak genotoksik çevresel maruziyetlerde DNA hasarını incelemek için bir iğne kan iğnesi kullanabilirler.

Kuyruklu yıldız jelleri için katı destek olarak mikroskop slaytlarını kullanan kuyruklu yıldız testi için farklı formatlardan herhangi biri yaklaşımımıza uygundur. Bu tekniğin en önemli kısmı, LMP agarozu ile karıştırıldıktan sonra numunelerin yüklenmesidir. Numuneler kabarcık oluşturmadan hızlı bir şekilde yüklenmeli ve katılaşmadan hemen önce bir kapak kayması ile kaplanmalıdır.

Başlamak için, PBS'de% 0.6 düşük erime noktası agarozu hazırlayın ve 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Önceden kaplanmış slaytların buzlu ucunu kalıcı bir işaretleyici veya kalem kullanarak ad, tarih ve işlem bilgileriyle etiketleyin. Düz bir tezgaha bir soğutma plakası yerleştirin ve metal yüzeyin altındaki sürgülü çekmeceye iki dondurulmuş soğutma paketi yerleştirin.

Ardından, slaytları bir ila iki dakika önceden soğutmak için soğutma plakasına yerleştirin. Süpernatantı numune tüplerinden santrifüj yapın ve çıkarın ve hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin. Hücre peletini 200 mikrolitre% 0.6 düşük erime noktalı agaroz ile yeniden askıya alın ve pipetleme ile karıştırın.

Daha sonra, soğutulmuş bir slayta 80 mikrolitre agaroz içeren hücre ekleyin ve jel üzerine hızlı bir şekilde bir kapak kayması yerleştirin. Jelin soğutma plakasına bir ila iki dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Bu arada, 500 mililitre çalışma lizis tamponu çözeltisi hazırlayın ve lizis kabına dökün.

Jeller ayarlandıktan sonra, başparmak ve işaret parmağı arasındaki sürgüyü hafifçe tutarak ve kapak kaymasını jelden kaydırarak kapak kaymalarını hızlı bir şekilde çıkarın. Ardından, slaytları, slaytlardaki tüm siyah nokta işaretleri aynı yöne bakacak şekilde bir slayt taşıyıcısının içine yerleştirin. Sürgü taşıyıcıyı lizis kabının içine yerleştirin.

Lizis kabının kapağını kapatın ve inkübasyona koyun. Jelleri rahatsız etmeden sürgü taşıyıcıyı lizis kabından dikkatlice çıkarın. Sürgü taşıyıcıyı, buz gibi soğuk çift damıtılmış suyla önceden yüklenmiş bir çamaşır kabına yavaşça yerleştirin.

Slaytların tamamen suya batırıldığından emin olun ve kurulumu 30 dakika boyunca bırakın. Optimum tampon sıcaklığını korumak için elektroforez tankının altına dondurulmuş bir soğutma paketi yerleştirin. Daha sonra, tanka buz gibi soğuk elektroforez çalışma çözeltisi ekleyin ve sürgü taşıyıcıyı içine aktarın.

Slaytları, hücre içeren jeller katotu gösterecek şekilde yönlendirin. DNA'nın gevşemesine izin vermek için elektroforez tankındaki slaytları 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, santimetre başına 1,19 voltta 20 dakika boyunca elektroforez yapmak için güç kaynağını açın.

Elektroforez tamamlandıktan sonra, güç kaynağını kapatın ve sürgü taşıyıcıyı elektroforez tankından çıkarın. Slayt taşıyıcısının 30 saniye boyunca kağıt mendil üzerinde boşalmasına izin verin. Ardından, slayt taşıyıcısını nötralizasyon tamponu içeren bir kaba yerleştirin ve 20 dakika bekletin.

Bunu takiben, buz gibi soğuk çift damıtılmış su içeren bir çamaşır kabına koyun ve 20 dakika bekletin. Yıkadıktan sonra, sürgü taşıyıcıyı sudan çıkarın ve slaytların bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde kurumasını bekleyin. Slaytları yeniden sulandırmak için, slayt taşıyıcısını buz gibi soğuk çift damıtılmış su içeren bir çamaşır kabına aktarın ve 30 dakika bekletin.

Ardından, slayt taşıyıcısını mililitre propidium iyodür çözeltisi başına 2.5 mikrogram içeren bir boyama kabına yerleştirin. Boyama kabının kapağını kapatın ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, slayt taşıyıcısını ayrı bir kaba aktarın ve 20 dakika boyunca buz gibi soğuk çift damıtılmış suyla yıkayın.

Sürgü taşıyıcıyı tabaktan çıkarın ve karanlıkta, 37 santigrat derecelik bir inkübatörde veya oda sıcaklığında tamamen kurulayın. Slaytlar tamamen kuruduktan sonra, görüntü analizine hazır olana kadar karanlıkta bir slayt kutusunda saklayın. İnsan keratinositleri farklı dozlarda UVA ve UVB ile ışınlandı veya DNA hasarını indüklemek için 50 mikromolar hidrojen peroksit ile muamele edildi.

En uygun voltaj 1.19 volt santimetreydi, çünkü en hassas tepkiyi ve kuyruk DNA'sının en büyük yüzdesini indükledi. İnsan tam kanı farklı dozlarda UVA ile ışınlandı ve farklı konsantrasyonlarda Fpg ile muamele edildi. Yüksek verimli alkali kuyruklu yıldız testi, optimal DNA hasarı seviyelerinin mililitre Fpg başına dört ünite ile indüklendiğini ortaya koydu.

Yumurtalık kanseri hücre hattı SK-OV-3, sisplatin ve hidrojen peroksit kombinasyonu ile tedavi edildi. Maruz kalmayan hücreler hiçbir hasar göstermedi. Tek başına hidrojen peroksite maruz kalmak, DNA intrastrand çapraz bağlantılarının indüklendiği hücrelere kıyasla önemli bir ortalama Zeytin kuyruğu momenti üretti.

100-mikromolar sisplatin ile tedaviden sonra, DNA intrastrand çapraz bağları 12 saatte bir zirve ile artmış, bundan sonra seviyeler 30 saat sonra sıfıra düşmüştür Buz paketini elektroforez tankına koymak ve elektroforezden önce DNA'yı gevşetmek için slaytları 20 dakika boyunca inkübe etmek önemlidir. Bu adım, hasarlı DNA'nın akımla seyahat etmesine yardımcı olacaktır. Tahlili dikey olarak yerleştirilmiş slaytlarla çalıştırmak, kuyruklu yıldız tahlilini otomatikleştirmemizi sağladı.

Ek olarak, tekniğimiz araştırma için kuyruklu yıldız testini basitleştirdi.