Name: Enerji Substrat Oksidasyonunun In Vitro 14CO2 Trapping ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin, 14CO2 izleme ile in vitro enerji substrat oksidasyonu ölçüm yöntemini. Kemik dokusu ve çeşitli hücre tiplerinde metabolik bozuklukları araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma kısmen NIH hibe R01 AR060456 (FL) tarafından desteklenmiştir. Dr. Michael Robinson ve Elizabeth Krizman'a (Philadelphia Çocuk Hastanesi) parıltı sayacı konusundaki cömert yardımları için teşekkür ederiz.

Radyoaktif malzemelerin (RAM) kullanımı, her kurumda belirlenmiş bir güvenlik komitesi tarafından önceden onay alınmasını gerektirir. Bu protokolde kullanılan RAM'ler, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Çevre Sağlığı ve Radyasyon Güvenliği (EHRS) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların kullanımı, ev kurumundaki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından önceden onay alınmasını gerektirir. Aşağıdaki çalışma IACUC tarafından Philadelphia Çocuk Hastanesi'nde onaylanmıştır.
1. 14C etiketli substrat için stok çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>11 g BSA ve 33,1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) karıştırarak ve BSA tamamen çözünene kadar oda sıcaklığında ~3 saat hafifçe çalkalayarak 4 mM sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi yapın. BSA stok solüsyonunu kullanmadan önce 70 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.</li>
	<li>Şişede 50 μCi 14C-oleat (etanol içinde 50 μCi/μmol) hava ile kurutun, kapak 8 saat kapalıyken belirlenmiş bir RAM çalışma davlumbazında. 312.5 μLH2O ve daha sonra 3.5 mg (11.5 μmol) sodyum oleat ekleyin. İyice karıştırın.</li>
	<li>Elde edilen çözeltiyi bir su banyosunda 70 ° C'ye ısıtın. 10 mM sıcak oleat stok çözeltisi elde etmek için önceden ısıtılmış BSA stok çözeltisinin 0,9375 mL'sini ekleyin (14 C-oleatın etiketsiz oleata 1:11,5oranını içerir). Stok çözeltisini serbest bırakın ve uzun süreli kullanım için -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Çözüldükten hemen sonra 14C-glikoz ve 14C-glutamin kullanın.</li>
</ol>2. 14C etiketli substrat içeren ortamın hazırlanması
NOT: Ortamdaki enerji substratlarının güvenilir konsantrasyonlarını sağlamak için, kullanımdan kısa bir süre önce eklenen taze substratlarla birlikte ısmarlama ortam kullanılmalıdır. Burada, glikoz, piruvat, glutamin, fenol kırmızısı veya sodyum bikarbonat içermeyen özel yapım bir Minimum Esansiyel Ortam (MEMa) kullanılır. Bununla birlikte, her hücre tipi için en uygun ortam belirlenmelidir.
<ol><li>1 L arıtılmış suda 8.67 g orta tozu yeniden oluşturun. 7.4 pH elde etmek için 2.2 g sodyum bikarbonat ekleyin ve 0.22 μm vakum filtrasyonu kullanarak çözeltiyi filtreleyin.</li>
	<li>Son konsantrasyonlarda 5.5 mM glikoz, 2 mM glutamin, 1 mM piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile tam ortamı (cMEMa) elde etmek için taze bileşenler ekleyin. Ayrıca yağ asidi oksidasyonunu kolaylaştırmak için cMEMα'yı 100 mM L-karnitin ve 10 μM HEPES ile destekleyin.</li>
	<li>Kullanmadan hemen önce, sıcak ortam yapmak için taze hazırlanmış cMEMα'ya 14C etiketli substrat ekleyin. Oleat sıcak ortamını yapmak için, 100 μM oleatın son konsantrasyonu (1:100 seyreltme, son radyoaktivite 0,4 μCi / mL) için cMEMa'ya 10 mM sıcak oleat stok çözeltisini ekleyin. NOT: 1:11.5 oranında sıcak:soğuk oleat içeren 10 mM sıcak oleat stoğu (bkz. adım 1.3), radyoaktif madde miktarını en aza indirirken ortamda toplam 100 μM fizyolojik oleat seviyesine ulaşmak için kullanılır.</li>
	<li>70 ° C'de bir su banyosunda 2 mL H2 O'ya 24.36 mg sodyum oleat ekleyerek ~20dakika boyunca tamamen çözünene kadar 10 mM etiketsiz oleat stoğu yapın, 70 ° C'ye önceden ısıtılmış 4 mM BSA stok çözeltisinin 6 mL'si ile hızlı bir şekilde karıştırmadan önce. 37 °C'lik bir su banyosuna 1 saat boyunca aktarın ve 0,22 μm filtreden süzün. Aliquot ve uzun süreli kullanım için -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Glikozu sıcak ortam yapmak için, 1.333 μM'lik bir son konsantrasyona 14C-glikoz ekleyin (1: 4.125 seyreltme, son radyoaktivite 0.4 μCi / mL). Glutamin sıcak ortam yapmak için, 2 μM'lik son konsantrasyona 14C-glutamin ekleyin (1: 1.000 seyreltme, son radyoaktivite 0.4 μCi / mL).</li>
	<li>Glikoz ve glutamin sıcak ortamını, oleat sıcak ortamındakiyle aynı olan 100 μM oleatın nihai konsantrasyonunu elde etmek için adım 2.4'ten itibaren 10 mM'lik etiketsiz oleat stok çözeltisi ile destekleyin.</li>
</ol>3. Hücrelerin hazırlanması
NOT: Kalvarial preosteoblastlar ve kemik iliği makrofajları burada örnek olarak kullanılmıştır. Kullanıcılar seçtikleri hücre tipini uygun protokollere göre hazırlamalıdır. Enzimatik aktivite farklı partiler arasında değişebileceğinden, pilot deneylerde sindirim için kullanılacak kollajenaz II konsantrasyonunu optimize edin.
<ol><li>Kalvarial preosteoblastların izolasyonu ve kültürü<ol>
<li>Doğum sonrası gün 3-5 (P3-5) yavrularını kafalarını keserek kurban edin ve onları Penisilin-Streptomisin (P / S) içeren buz gibi soğuk DPB'lere aktarın.</li>
		<li>Cildi ve yumuşak dokuyu çıkararak kalvariyi açığa çıkarın. DPBS'de çevredeki dokuları arkadan öne doğru keserek orta bölgeyi toplayın (Şekil 1A). Kalvarinin iç ve dış yüzeylerini, sonraki sindirimde hücrelerin serbest bırakılmasına yardımcı olmak için cımbız kullanarak hafifçe çizin.</li>
		<li>DPBS'de 2 mg / mL ve 4 mg / mL'lik bir Kollajenaz tip II çözeltisi hazırlayın ve her bir çözeltiyi taze bir 0.22 μm filtre ile filtreleyin. Temizlenmiş kalvariyi önce 2 mg / mL kollajenaz çözeltisi ile 15 dakika boyunca sindirin ve sindirim çözeltisini atın. Temizlenen numuneleri her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez 4 mg / mL kollajenaz çözeltisinde sindirin, sindirim çözeltisini bir araya getirin ve saklayın.</li>
		<li>Çürütme çözeltisini 70 μm hücre süzgeçlerinden süzün ve filtrazı 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Hücre peletini cMEMα'da (bkz. adım 2.2) FBS ve P/S içeren yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücreleri 10 cm'lik plakalarda 4 × 104 hücre/cm2'de sayın ve tohumlayın. Hücreleri 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın. 7.5 × 105 / cm2'de% 10 FBS ve P / S içeren cMEMα ile24 kuyucuklu hücre kültürü plakalarındaki hücreleri sayın ve tohumlayın. Substrat başına hücre tipi başına en az 4 kuyucuk ve tahlilden önce hücre sayımı için her hücre tipi için en az üç ekstra kuyucuk tohumlayın.</li>
		<li>Substrat oksidasyon testlerinden önce hücreleri gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BMM'lerin izolasyonu ve kültürü NOT: BMM'lerin kültürü, rekombinant protein olarak ticari olarak satın alınabilen makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gerektirir. M-CSF'yi eksprese etmek için tasarlanmış CMG14-12 hücre hattından şartlandırılmış ortam, burada kullanılan ekonomik bir alternatiftir13.<ol>
<li>Kas ve bağ dokularını çıkardıktan sonra 8 haftalık farelerden femurları ve tibiasları toplayın. Kemiklerin her iki ucunu keskin makasla kesin ve atın.</li>
		<li>Kemik iliğini bir femur ve bir tibia'dan% 10 FBS, P / S ve% 10 CMG14-12 şartlandırılmış ortam (BMM ortamı) ile 15 mL cMEMa içeren 23 G'lik bir iğne ile donatılmış bir şırınga ile 10 cm'lik bir Petri kabına yıkayın. Petri kabındaki hücreleri% 5 CO 2 ile 37 ° C'lik bir inkübatördekültürleyin.</li>
		<li>3 gün sonra, kültür ortamını atın ve DPBS ile durulayın. Bağlı hücreleri 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA ile 5 dakika boyunca ayırın. BMM ortamında hücre peletini santrifüj yapın ve yeniden askıya alın.</li>
		<li>24 kuyucuklu hücre kültürü plakalarındaki hücreleri 7.5 × 105 /cm2'de 3.1.6'da tarif edildiği gibi sayın ve tohumlayın. Tahlillere başlamadan önce BMM ortamında gece boyunca 37 ° C'de kültür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. CO2 tuzaklı substrat oksidasyon testi
<ol><li><li><li></li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg"><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
<li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li>
<li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li>
<li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids%2C+ketone+bodies+and+pyruvate%2C+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation%2C+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li>
<li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li>
<li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+osteoblast%3A+implications+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li>
<li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).</li>
<li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li>
<li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li>
<li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+glucose%2C+glutamate%2C+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li>
<li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li>
<li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Protokol, ana enerji substratlarının oksidasyon oranını belirlemek için kullanımı kolay bir yöntem sağlar. Merkezi bir kuyu içeren ve14,15,16 kauçuk tıpalarla kaplı şişeler kullanan diğer protokollere daha basit bir alternatiftir. Buradaki örnek çalışma hücre kültürü ile yapılmasına rağmen, yöntem daha önce tarif edildiği gibi doku eksplantları veya bozulmamış mitokondri içeren doku homojenatları için kolayca uyarlanabilir<sup c...

Ökaryotlardaki oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), oksijen tüketimi yoluyla ATP şeklinde kimyasal enerjiyi serbest bırakmak için besinlerin mitokondri içinde parçalandığı işlemdir.  Trikarboksilik asit (TCA) döngüsü yoluyla mitokondri içindeki çeşitli substratların katabolizması doğrudan az sayıda ATP molekülü üretir, ancak elektron taşıyıcıları nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +) ve flavin adenin dinükleotidin (FAD +) indirgenmesi yoluyla enerji depolar. İndirgenmiş taşıyıcılar daha sonra membran boyunca bir proton konsantrasyon gradyanı oluşturmak için mitokondrinin iç zarında bulunan ETC tarafından oksitlenir. Protonlar sonunda ATP üretmek için gradyanlarını ATP sentaz yoluyla mitokondriyal matrise geri akarlar. OXPHOS, enerji substratlarından ATP üretiminin en verimli aracıdır ve genellikle aerobik ortamlarda tercih edilir. Önceden, aerobik glikolizin - oksijen mevcutken glikozdan laktat üretimi - patofizyolojik olduğu, genellikle kanser hücrelerinin bir işareti olduğu düşünülüyordu. Giderek daha fazla, bazı normal hücre tiplerinin henüz tam olarak deşifre edilmemiş nedenlerden dolayı aerobik glikoliz kullandığı keşfedilmektedir.
Metabolik esneklik, hücrelerin veya organizmaların değişen enerji taleplerine ve mevcut yakıt kaynaklarına uyum sağlama kapasitesidir. Örneğin, iskelet kasının enerjik talebi esas olarak sabit durumda OXPHOS tarafından karşılanır, ancak yüksek yoğunluklu egzersiz sırasında anaerobik glikoliz1. Egzersiz süresi arttıkça, glikoz ve yağ asidi oksidasyonu genel enerji üretimine daha fazla katkıda bulunur2. Bununla birlikte, substrat kullanımı sadece kullanılabilirliğe bağlı değildir, çünkü substratlar oksidasyon sırasında antagonistik olarak rekabet eder. En önemlisi, yağ asidi oksidasyonunun, Randle etkisi3 olarak bilinen bir fenomende iskelet kası tarafından glikoz kullanımını inhibe ettiği gösterilmiştir. Karşılıklı bir etki sonraki çalışmalarla gösterilmiştir 4,5. Ek olarak, birçok hastalık substrat tercihindeki bir değişiklik ve hücrelerde metabolik esnekliğin gelişmesi ile ilişkilidir. Örneğin, tip II diyabetik hastaların iskelet kasında yağ asidi oksidasyonu normal kontrol deneklerine kıyasla azalır6. Hastalık ortamlarındaki metabolik değişiklikler patogeneze katkıda bulunabileceği için yoğun bir araştırma konusudur.
İskelet hücre tiplerinde enerji metabolizması nispeten az çalışılmakla birlikte son yıllarda dikkat çekmektedir7. Önceki çalışmalar, aerobik glikolizin kalvarial osteoblastlarda baskın enerji yolu olduğunu, TCA döngüsü boyunca glikoz oksidasyonunun osteoklast oluşumunda rol oynadığını göstermiştir 8,9. Diğerleri, osteoblastlar için bir enerji kaynağı olarak yağ asitleri için kanıt sağlamıştır10. Glutamin katabolizmasının da osteoblast farklılaşmasını progenitörlerden11,12 desteklediği gösterilmiştir. Bununla birlikte, çeşitli iskelet hücresi tipleri tarafından substrat kullanımının kapsamlı bir şekilde anlaşılması hala eksiktir. Ek olarak, hücre farklılaşması sırasında veya patolojik sinyallere yanıt olarak hücresel metabolizmadaki değişikliklerin yakıt substrat kullanımını değiştirmesi beklenir. Aşağıda açıklanan, in vitro substrat oksidasyonunu test etmek için kullanımı kolay bir protokoldür.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m filtreleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>BSA çözeltisini filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Hücreleri hücre kültürü plakalarından ayırın</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tüpleri</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Reaksiyon inkübasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>10 cm plakalar</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Hücre kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Uzun kemiklerden iliği temizlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre kültürü ortamı için</td> <td>%10 FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td></tr><tr><td>14C-Glikoz</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Sıcak ortam yapmak için kullanılır</td></tr> <tr><td>14C-glutamin</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Sıcak ortam yapmak için kullanılır</td></tr> <tr><td>14C-oleat</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Sıcak ortam yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>23 G iğne</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Uzun kemiklerden iliği temizlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>70 & mu için kullanılır; m hücreli süzgeçler</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Kavarial sindirim sırasında süpernatanı filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Akridin Portakal/Propidyum İyodür (AO/PI) boya</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Tohum yoğunluğunu belirlemek için canlı hücreleri boyar</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Yağ asidi konjugasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Canlı hücrelerin sayısını belirleyin</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Hücreleri peletlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Hücreleri dokudan ayırın</td></tr><tr><td>Özel MEM alfa</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>Özel sıcak ortam oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Reaktifleri çözmek ve seyreltmek ve kültür kaplarını yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Sodyum hidroksit ile CO2 tuzakları</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Özel medya yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Tuzakları Hücre kültürü sırasında CO2</td></tr><tr><td>L-karnitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Yağ asidi oksidasyonu için takviye edilmiş</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Özel medya yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Plastik Ambalaj</td><td>PM998</td><td>Hücre kültürü kaplarını kapatmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Hücre kültüründe kontaminasyonu önler</td></tr><tr><td>Perklorik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td>, <td>metabolik tahlil sırasında CO2 salgılar</td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Özel medya yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sintilasyon Sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>Filtre kağıdından radyoaktiviteyi belirler</td></tr><tr><td>Sintilasyon Sıvısı</td><td>MP Biyomedikal</td><td>882453</td><td>RAM'ler tarafından yayılan enerjiyi emdirin ve ışık parlamaları olarak yeniden yayar</td></tr><tr><td>Parıldama Flakonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Sintilasyon sıvısı için reaksiyon kapları</td></tr><tr><td>Sodyum karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td> Orta Sodyum Hidroksit <td>için denge tamponu</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Metaboilc deneyi sırasında CO2 Tuzakları</td></tr><tr><td>Sodyum oleat</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA konjuge yağ asidi hazırlama</td></tr><tr><td>Vakum filtrasyonu 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filtre cMEM ve alfa;</td></tr></tbody></table>

enerji substrat oksidasyonunun in vitro 14co2 trapping ile değerlendirilmesi

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Mitokondri, enerji homeostazını korumak için adenozin trifosfat (ATP) üreten trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve elektron taşıma zinciri (ETC) için makinelere ev sahipliği yapar. Glikoz, yağ asitleri ve amino asitler, çoğu somatik hücrede mitokondriyal solunumu besleyen başlıca enerji substratlarıdır. Kanıtlar, farklı hücre tiplerinin belirli substratlar için farklı bir tercihe sahip olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, iskeletteki çeşitli hücreler tarafından substrat kullanımı ayrıntılı olarak çalışılmamıştır. Ayrıca, hücresel metabolizma fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklere uyum sağladığından, iskelet hücrelerinde substrat bağımlılığının doğrudan değerlendirilmesi, kemik hastalıklarının patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Aşağıdaki protokol, oksidatif fosforilasyonu takiben substrat moleküllerinden karbondioksit salınımı prensibine dayanmaktadır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş karbon atomları (14C) içeren substratları kullanarak, yöntem hücre kültüründeki substrat oksidasyon oranı için hassas ve kullanımı kolay bir test sağlar. Primer kalvarial preosteoblastlara karşı kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM'ler) ile yapılan bir vaka çalışması, iki hücre tipi arasındaki ana substratların farklı kullanımlarını göstermektedir.

Bu örnekte, CO2 yakalama yöntemi, sırasıyla in vitro osteoblast veya osteoklast farklılaşması için sıklıkla kullanılan primer kalvarial preosteoblastlar ile BMM'ler arasındaki substrat oksidasyonunu karşılaştırmak için kullanılmıştır. Birincil hücreler bir gecede cMEMa'da paslanıp kültürlendikten sonra, tipik olarak birleşmenin% 80-90'ına ulaşırlar ve karakteristik morfolojilerini sergilerler. Kalvarial preosteoblastlar BMM'lerden önemli ölçüde daha büyüktür (Şekil 2). He...

Bu protokol, in vitro 14CO2 üretimini izleyerek substrat oksidasyonunu incelemek için kullanımı kolay bir yöntemi açıklar.

Enerji Substrat Oksidasyonunun In Vitro 14CO2 Trapping ile Değerlendirilmesi

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

Farklı enerji substratlarının kullanımı hem hücre tipine özgü hem de hastalığın göstergesidir. Spesifik substratların tüketiminin ölçülmesi hem normal biyolojiye hem de patolojiye ışık tutabilir. Teknik özel ekipmana ihtiyaç duymaz ve ölçeklendirilmesi kolaydır.Kullanımı daha önce yayınlanmış yöntemlerden daha kolaydır. Substrat oksidasyon hızındaki değişikliklerin anlaşılması, metabolik bozukluklar için diyet ve farmakolojik müdahalelerin geliştirilmesine izin verecektir. Kemik dokusu ile gösterilmesine rağmen, bu teknik, metabolik kaymaların hem nedenlerini hem de sonuçlarını anlamayı sağlayan tüm hücre tiplerinde metabolik esnekliği incelemek için kolayca özelleştirilebilir.Doğum sonrası üç ila beş günün yavrularını feda ettikten sonra, onları penisilin streptomisin çift antibiyotik çözeltisi içeren buz gibi soğuk D PBS'ye aktarın. Cildi ve yumuşak dokuyu çıkararak kalvariyi açığa çıkarın. D PBS'de çevredeki dokuları arkadan öne doğru keserek orta bölgeyi toplayın.Kalvarinin iç ve dış yüzeylerini, sonraki sindirimde hücrelerin serbest bırakılmasına yardımcı olmak için cımbız kullanarak hafifçe çizin. D PBS'de mililitre başına 2 ve 4 miligram kollajenaz tip iki çözelti hazırlayın

assessing-energy-substrate-oxidation-in-vitro-with-14co2-trapping

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopisi demir (II)-N-metil-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) kullanılarak, insan nötrofil gelen sığır aort endotelyal hücreler ve süperoksit anyon radikal nitrik oksit tespit etmek için...

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Bu video, 14C-radyoaktif işaretli substrat kullanılarak substrat oksidasyonu sırasında salınan CO2 için bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Serbest bırakılan 14CO2, alkali bir çözelti içinde tutulur ve bir sintilasyon sayacı ile ölçülür. Farklı substratların oksidasyonu dokular arasında değişir ve dokunun patofizyolojik durumunu yansıtır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Substrat Oksidasyon Deneyi: Hapsolmuş CO2'den Radyoaktif Sinyalleri Ölçerek Hücrelerde Substrat Oksidasyonunu Ölçmek İçin Bir İn Vitro Test

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak oksidatif fosforilasyonun değerlendirilmesi, mitokondri ve hücresel enerji metabolizmasının fonksiyonel analizinin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Burada, oda ve mikroplaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak hücresel enerji metabolizmasının analizi için protokoller sunuyoruz ve her cihazın temel faydalarını tartışıyoruz.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Plazma zarını seçici olarak geçirimli hale getiren bir protokol sunuyoruz; böylece kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu (OXPHOS) değerlendirmek için substratlar ve inhibitörlerin hedefli şekilde teslim edilmesini sağlıyoruz ve genellikle bu tür analizleri engelleyen plazma zarı taşıma engellerini aşıyoruz. Bu teknikle, OXPHOS fonksiyonunun muskarinik agonistler ve antagonistler tarafından nasıl modüle edildiğini gösterdik.

Digitonin-permeabilize BE(2)-C nöroblastom hücrelerinde oksidatif fosforilasyon bağlanmasının kolinergik ligand-bağımlı modülasyonu

Keşfedin, 14CO2 izleme ile in vitro enerji substrat oksidasyonu ölçüm yöntemini. Kemik dokusu ve çeşitli hücre tiplerinde metabolik bozuklukları araştırmak için kullanılır.

Enerji Substrat Oksidasyonunun In Vitro ¹⁴CO₂ Trapping ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet