Name: Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Keşfedin, 3D hücre kültürü ve sıvı kromatografi kütle spektrometrisi kullanarak C3A hepatositlerinde histon post-translasyonel modifikasyonlarını nicelendirmeyi. Bu yöntem, kromatin dinamiklerini ve hastalık durumlarındaki rolünü anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sidoli laboratuvarı, Lösemi Araştırma Vakfı (Hollis Brownstein Yeni Araştırmacı Araştırma Bursu), AFAR (Sagol Network GerOmics ödülü), Deerfield (Xseed ödülü), Relay Therapeutics, Merck ve NIH Direktör Ofisi'ni (1S10OD030286-01) minnetle kabul eder.

<ol><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultural+divide%3A+exponential+growth+in+classical+2D+and+metabolic+equilibrium+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments.</a> PLoS One. 9 (9), 106973(2014).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).</li>
<li>Gonda, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+transgenic+cell+model+to+quantify+genotoxic+effects+of+space+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment.</a> Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Tvardovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+and+middle-down+protein+analysis+reveals+that+intact+and+clipped+human+histones+differ+in+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).</li>
<li>Azad, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+chromatin+by+histone+tail+clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modifying chromatin by histone tail clipping.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).</li>
<li>Kragesteen, B. K., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+or+tails%3A+histone+tail+clipping+regulates+macrophage+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity.</a> Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).</li>
<li>Dhaenens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+clipping%3A+the+punctuation+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Histone clipping: the punctuation in the histone code.</a> EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).</li>
<li>Anderson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+histone+proteoforms+using+front-end+electron+transfer+dissociation-enabled+orbitrap+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).</li>
<li>Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+roles+of+histone-modifying+enzymes+and+their+associated+chromatin+modifications+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation.</a> Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Chan, J. C., Maze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothing+is+yet+set+in+%28hi%29stone%3A+novel+post-translational+modifications+regulating+chromatin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Fischle, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+discrimination+of+repressive+methyl-lysine+marks+in+histone+H3+by+Polycomb+and+HP1+chromodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains.</a> Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).</li>
<li>Onder, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+epigenetic+histone+modification+analysis+by+mass+spectrometry+for+clinical+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations.</a> Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Moradian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epiproteomics%3A+quantitative+analysis+of+histone+marks+and+codes+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics%3A+a+still+unexploited+resource+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).</li>
<li>Stampar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+%28HepG2%2FC3A%29+cell-based+3D+model+for+genotoxicity+testing+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals.</a> Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).</li>
<li>Calitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+anti-prolific+properties+of+Xysmalobium+undulatum+water+extract+during+short-term+exposure+to+two-dimensional+and+three-dimensional+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).</li>
<li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+window+acquisition+of+all+theoretical+mass+spectra+%28SWATH%29+analysis+for+characterization+and+quantification+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).</li>
<li>Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+histone+PTMs+using+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+quantifies+histone+peptides+with+modifications+by+extracting+retention+time+and+intensity+in+high-resolution+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Pino, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skyline+ecosystem%3A+Informatics+for+quantitative+mass+spectrometry+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).</li>
<li>Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+protein+fold+change+and+p-value+calculation+for+non-experts+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics.</a> Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).</li>
<li>Lex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UpSet%3A+Visualization+of+intersecting+sets%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">UpSet: Visualization of intersecting sets.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Shah, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTome2%3A+a+database+of+histone+proteins%2C+modifiers+for+multiple+organisms+and+epidrugs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs.</a> Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+succinylation+and+lysine+malonylation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysine succinylation and lysine malonylation in histones.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+succinylation+and+its+function+on+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Histone succinylation and its function on the nucleosome.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).</li>
<li>Howe, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+H3K4me3+instructive+for+transcription+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Is H3K4me3 instructive for transcription activation.</a> Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+H3K9me3+heterochromatin+in+cell+identity+establishment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).</li>
<li>Wojcik, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27+dimethyl+loss+is+highly+specific+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+and+distinguishes+true+PRC2+loss+from+isolated+H3K27+trimethyl+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss.</a> Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).</li>
<li>Sellers, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Farrelly, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+serotonylation+is+a+permissive+modification+that+enhances+TFIID+binding+to+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3.</a> Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP-ribosylation+of+histone+variant+H2AX+promotes+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair.</a> The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+histone+glycation+is+associated+with+disease-related+changes+in+chromatin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture.</a> Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Histon PTM'lerin analizi, tipik proteomik analiz boru hattından temel olarak farklıdır. Çoğu histon PTM'nin hala esrarengiz biyolojik fonksiyonları vardır; Sonuç olarak, Gen Ontolojisi veya yol veritabanları gibi ek açıklamalar kullanılamaz. Histon modifikasyonlarını, katalizörlerinden sorumlu enzim veya bu PTM'leri bağlayan alanları içeren proteinlerle ilişkilendiren çeşitli kaynaklar mevcuttur (örneğin, HISTome36). Ayrıca, küresel histon PTM seviyeleri düzenlendiğinde kromatinin genel durumu hak...

19. yüzyılın sonlarından bu yana, hücre kültürü sistemleri, insan vücudunun dışındaki hücrelerin büyümesini ve gelişmesini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır 1,2. Kullanımları, dokuların ve organların hem sağlıklı hem de hastalıklı bağlamlarda nasıl çalıştığını incelemek için genişletilmiştir 1,3. Süspansiyon hücreleri (örneğin, kan hücreleri) Petri kaplarında veya şişelerinde sorunsuz ve birbirinin yerine büyür, çünkü in vivo üç boyutlu (3B) yapılarda bir araya gelmezler. Katı organlardan türetilen hücreler iki boyutlu (2B) veya 3B kültür sistemlerinde büyüyebilir. 2D kültürde, hücreler düz bir yüzeye yapışan tek katmanlı bir tabakada yetiştirilir 2,4. 2D hücre kültürü sistemleri, üstel büyüme ve hızlı bir iki katına çıkma süresi, tipik olarak 24 saat ila birkaç gün5 ile karakterize edilir. 3B sistemlerdeki hücreler, doku benzeri konglomeraları daha yakından modelleyen karmaşık hücre-hücre etkileşimleri oluşturmak için büyürler ve iki katına çıkma sürelerinin 1 aya veya daha uzun bir süreye ulaşabileceği dinamik bir dengeye ulaşma yetenekleri ile karakterize edilirler5.
Bu yazıda, azaltılmış yerçekimini simüle eden dönen hücre kültürü sistemlerinde 3D sferoidleri büyütmek için yenilikçi bir metodolojisunulmaktadır 6. Bu, NASA tarafından 1990'lardatanıtılan bir hücre kültürü sisteminin basitleştirilmiş bir türevidir 7. Bu yaklaşım, eğirme şişeleri gibi mevcut yöntemlerde ortaya çıkan kesme kuvvetlerini en aza indirir ve küresel tekrarlanabilirliğiarttırır 6. Ek olarak, dönen biyoreaktör aktif besin difüzyonunu artırarak medya değişiminin pratik olmadığı asılı damla hücre kültürü gibi sistemlerde meydana gelen nekrotik oluşumu en aza indirir6. Bu şekilde, hücreler çoğunlukla bozulmadan büyür ve dokuda büyüyen hücrelerle ilişkili yapısal ve fizyolojik özelliklerin oluşmasına izin verir. Bu şekilde kültürlenen C3A hepatositleri (HepG2 / C3A) sadece ultrastrüktürel organellere sahip olmakla kalmadı, aynı zamanda in vivo1,2 olarak gözlemlenen seviyelerle karşılaştırılabilir miktarda ATP, adenilat kinaz, üre ve kolesterol üretti. Ek olarak, 2D ve .3D hücre kültürü sistemlerinde yetiştirilen hücreler farklı gen ekspresyon kalıpları sergiler8. 3D sferoidler olarak yetiştirilen C3A hepatositlerinin gen ekspresyon analizi, bu hücrelerin çok çeşitli karaciğere özgü proteinleri ve karaciğer fonksiyonunu düzenleyen anahtar yollarda yer alan genleri ifade ettiğini göstermiştir8. Önceki yayınlar, 2D kültürde üstel olarak büyüyen hücrelerin proteomları ile 3D sferoid kültürlerde dinamik dengedeki hücreler arasındaki farkları göstermiştir5. Bu farklılıklar, hücre5'in yapısını, işlevini ve fizyolojisini etkileyen hücresel metabolizmayı içerir. 2D kültürde yetiştirilen hücrelerin proteomu hücre replikasyonunda yer alan proteinlerde daha zenginleştirilirken, 3D sferoidlerin proteomu karaciğer işlevselliğinde daha zenginleştirilmiştir5.
3D sferoidler olarak yetiştirilen hücrelerin daha yavaş replikasyon hızı, kromatin durumu ve modifikasyonları (örneğin histon kırpma9) ile ilişkili spesifik fenomenleri daha doğru bir şekilde modeller. Histon kırpma, histon N-terminal kuyruğunun bir kısmının proteolitik bölünmesine neden olan geri dönüşümsüz bir histon post-translasyonel modifikasyondur (PTM). Biyolojik işlevi hala tartışılırken10,11,12,13, birincil hücrelerdeki ve karaciğer dokusundaki varlığının, sferoidler olarak yetiştirilen HepG2 / C3A hücreleri tarafından modellendiği, ancak düz hücreler olarak modellenmediği açıktır9. Bu kritiktir, çünkü kromatin durumu ve modifikasyonları çoğunlukla genlere erişilebilirliği ve dolayısıyla ekspresyonlarını modüle ederek DNA okumasını düzenler14. Histon PTM'leri ya histonların monte edildiği nükleozomların net yükünü etkileyerek ya da dolaylı olarak kromatin yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini işe alarak kromatin durumunu doğrudan etkiler14. Bugüne kadar yüzlerce histon PTM15 tanımlanmıştır ve kromatinin hücre tarafından DNA16'yı yorumlamak için kullanılan bir "histon kodu" barındırdığı hipotezini güçlendirmiştir. Bununla birlikte, sayısız PTM kombinasyonunun tanımlanması15 ve histon PTM'lerin kombinasyonlarının sıklıkla izolasyonda bulunan PTM'lerden farklı biyolojik işlevlere sahip olduğunun keşfi (örneğin Fischle, et al.17), "histon kodunun" şifresini çözmek için daha fazla çalışmanın gerekli olduğunu vurgulamaktadır.
Şu anda, histon PTM analizi, antikorları (örneğin, batı lekeleri, immünofloresan veya kromatin immünopresipitasyonunu takiben dizileme [ChIP-seq]) veya kütle spektrometrisi (MS) kullanan tekniklere dayanmaktadır. Antikor bazlı teknikler yüksek duyarlılığa sahiptir ve histon izlerinin genom çapında lokalizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir, ancak kombinasyonlarda bulunan nadir PTM'lerin veya PTM'lerin incelenmesinde sıklıkla sınırlıdır18,19,20. MS, tek ve birlikte var olan protein modifikasyonlarının, özellikle histon proteinlerinin 18,19,20 yüksek verimli ve tarafsız tanımlanması ve nicelleştirilmesi için daha uygundur. Bu nedenlerden dolayı, bu ve diğer birkaç laboratuvar, MS boru hattını histon peptitlerinin (aşağıdan yukarıya MS), bozulmamış histon kuyruklarının (orta-aşağı MS) ve tam uzunlukta histon proteinlerinin (yukarıdan aşağıya MS) analizi için optimize etmiştir 21,22,23.
Aşağıda, HepG2 / C3A sferoidlerini büyütmek ve bunları nano-sıvı kromatografisi yoluyla histon peptid analizine (aşağıdan yukarıya MS) hazırlamak için bir iş akışı, çevrimiçi olarak tandem kütle spektrometresi (NLC-MS / MS) ile birleştirilmiştir. Bir 2D hücre kültürü yetiştirildi ve hücreler toplandı ve sferoidler oluşturmaya başlayacakları bir biyoreaktöre aktarıldı (Şekil 1). Kültürde 18 gün sonra, sferoidler, histon asetilasyon ve süksinilasyonun göreceli bolluğunu arttırmak için sodyum bütirat veya sodyum süksinat ile muamele edildi. Özellikle, 3D kültürler, düz kültür eşdeğerlerinin yanı sıra genotoksik bileşiklerle de tedavi edilebilir; Aslında, son yayınlar, 3D kültürdeki hücrelerin toksikoloji yanıtının, birincil dokulara 2D düz kültür24,25'tekilerden daha benzer olduğunu vurgulamaktadır. Hücreler daha sonra belirtilen zaman noktalarında toplandı ve nükleer izolasyon yapıldı. Daha sonra, ilk olarak Garcia ve ark.26 tarafından geliştirilen bir protokole göre, tripsin sindiriminden önce ve sonra propiyonik anhidrit ile histonlar çıkarıldı ve türetildi. Bu prosedür, ters faz kromatografisi (C18) ile çevrimiçi ayırma ve MS ile tespit için uygun boyutta peptitler üretir. Son olarak, histon peptitleri tanımlandı ve ölçüldü ve üretilen veriler daha eksiksiz bir biyolojik yorumlama için çeşitli şekillerde temsil edildi.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.5-20 &mikro; L pipet uçları</td><td>MARKA</td><td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; L çok kanallı pipet</td><td>MARKA</td><td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr> <tr><td>10 mL şırınga</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td> <td>Luer kilit ucu, 12 mL</td></tr><tr><td>10, 20, 200 ve 1000 & mikro; L tek kanallı pipetler</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1000 & mikro; L pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>18 G şırınga iğnesi</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td><td>3" uzunluk, 0,05" çap</td></tr><tr><td>200 & mikro; L çok kanallı pipet</td><td>Corning</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 & mikro; L pipet uçları</td><td>MARKA</td><td>Z740118 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu ultra düşük bağlantılı mikroplaka</td><td>Corning</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2&nbsp; U-şekilli hücre kültürü şişesi</td><td>Corning</td><td>461464U</td><td>İşlenmemiş, havalandırma kapaklı</td></tr><tr><td>96 kuyulu etekli plaka</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C (Corning)</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>Aseton soğuk kullanılmalıdır</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözüm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü sınıfı su</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>3D hücre kültürü için biyoreaktör</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Clinostat CO2 3D hücre kültürü için inkübatör</td></tr><tr><td>ClinoStar için kontrol ünitesi</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Tablet ayarlar</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>Corning</td><td>17-205-CV</td><td>1X çözeltisi 4.5 g/L glikoz ve sodyum piruvat içeren, L-glutamin ve fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>içermeyen Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Model 7121000</td></tr><tr><td>Cam Pastör pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9", pamuk tıkalı, borosilikat cam, steril olmayan</td></tr><tr><td>Glutagro takviyesi</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-ananil-L-glutamin</td></tr><tr><td>Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>Kalsiyum, magnezyum ve fenol içermeyen 1X çözelti</td></tr><tr><td>kırmızı HPLC sınıfı asetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td>100X çözeltisi</td></tr><tr><td>Oasis HLB reçine</td><td>Suları</td><td>186007549</td><td>30&mikro ile Hidrofilik-Lipofilik-Dengeli (HLB) Reçine; m parçacık boyutu</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi</td></tr><tr><td>Oro-Flex I polipropilen filtre plakası</td><td>Orochem</td><td>OF1100</td><td>96 kuyulu polipropilen filtre plakası w / 10 &; mikro; M PE frit</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X çözelti</td></tr><tr><td>pH kağıdı</td><td>Hydrion Z111848</td><td>(Sigma-Aldrich)</td><td>0-13 pH test kağıdı</td></tr><tr><td>Pipet tabancası</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Polimikro kılcal</td><td>Molex</td><td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td><td>Polimid kaplamalı esnek erimiş silika kılcal boru, 75 &; M Kimlik x 363 ve mikro; M OD</td></tr><tr><td>Polistiren 10 mL serolojik pipetler, steril</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Propiyonik anhidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur reçine</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.0003</td><td>120 & Aring; gözenek boyutu, C18-AQ fazı, 3 & mikro; M boncuk boyutu</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Clay Adams</td><td>25477 (Amerikan Laboratuvar Ticareti)</td> <td>Nutator Karıştırıcı 1105</td></tr><tr><td>Sıralama sınıfı modifiye tripsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bütirat</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum süksinat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı (1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri)</td><td>Savant</td><td>20249 (Amerikan Laboratuvar Ticareti)</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı (96 kuyulu)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Steril başlık</td><td>Thermo Scientific</td><td>1375</td><td>Sınıf II, Tip A2</td></tr><tr><td>Sülfürik asit (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker Analiz ACS reaktifi</td></tr><tr><td>Doku kültürü ile tedavi edilmiş 100 mm x 20 mm çanak</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit (TCA)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>AC421451000</td> HPLC dereceli su Trifloroasetik asit (TFA) içinde<td>% 100 w / v yeniden askıya alın</td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28904</td><td>Sıralama derecesi</td></tr><tr><td>Vakum manifoldu 96 kuyulu</td><td>Kırlangıç</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>Geniş çaplı pipet uçları 1000 & mikro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Geniş çaplı pipet uçları 200 & mikro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-730 (Fisher Bilimsel)</td><td></td></tr></tbody></table>

karaciğer dokusunun 3d hücre kültürü modelinde histone post-translasyonel modifikasyonlarının küresel düzeyde nicelleştirilmesi

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Memeli hücrelerinin düz kültürleri, hücre fizyolojisini anlamak için yaygın olarak kullanılan in vitro bir yaklaşımdır, ancak bu sistem doğal olmayan hızlı hücre replikasyonu nedeniyle katı dokuların modellenmesinde sınırlıdır. Bu, olgun kromatini modellerken özellikle zordur, çünkü hızlı çoğalan hücreler sıklıkla DNA replikasyonuna katılır ve heterojen bir poliploid popülasyona sahiptir. Aşağıda, üç boyutlu (3B) bir hücre kültürü sistemi kullanarak sessiz kromatin modifikasyonlarının modellenmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için bir iş akışı sunulmaktadır. Bu protokolü kullanarak, hepatosellüler karsinom hücre hatları, aktif besin difüzyonu ve düşük kesme kuvvetleri sağlayan bir inkübatörde tekrarlanabilir 3D sferoidler olarak yetiştirilir. Sodyum bütirat ve sodyum süksinat ile tedavi, sırasıyla histon asetilasyon ve süksinilasyonda bir artışa neden oldu. Histon asetilasyon ve süksinilasyon seviyelerindeki artışlar daha açık kromatin durumu ile ilişkilidir. Sferoidler daha sonra hücre çekirdeklerinin izolasyonu için toplanır ve histon proteinleri translasyonel modifikasyonlarının analizi için ekstrakte edilir. Histon analizi, tandem kütle spektrometrisi ile çevrimiçi olarak birleştirilmiş sıvı kromatografisi ve ardından şirket içi hesaplamalı bir boru hattı ile gerçekleştirilir. Son olarak, kombinatoryal histon işaretlerinin sıklığını ve oluşumunu araştırmak için veri gösterimi örnekleri gösterilmiştir.

Bu protokolde, HepG2 / C3A sferoidleri, her ikisi de histon PTM'lerin küresel seviyelerini etkileyen 20 mM NaBut ve 10 mM NaSuc ile tedavi edildi (Şekil 3A). Histon PTM'leri daha sonra MS / MS edinimi yoluyla tek kalıntı seviyesinde tanımlanmış ve ölçülmüştür (Şekil 3B).
Numuneler replikalarda çalıştırıldığında, numuneler arasında bir PTM'nin katlama değişimi zenginleştirmesini ve gözlemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek...

Bu protokol, üç boyutlu bir hücre kültürü sisteminin, kromatin modifikasyonlarını fizyolojik bir durumda modellemek, tedavi etmek ve analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini özetlemektedir.

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Küresel kromatin dinamiklerinin, kanser ve yaşlanma gibi çeşitli hastalık durumlarının önemli bir aracısı olduğu gösterilmiştir. Protokolümüz bu süreci incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar. Histon post-translasyonel modifikasyonların veya PTMS'nin standart laboratuvar analizi genellikle antikor bazlı tahliller kullanılarak bir seferde tek bir PTM için problama ile sınırlıdır.Histon PTMS'nin sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi analizi, yüzlerce PTMS'nin bolluğunu tek bir deneyde ölçmemizi sağlar. Prosedürü gösterenler, sırasıyla laboratuvardan Stephanie Stransky, Ronald Cutler ve doktora sonrası, yüksek lisans öğrencisi ve araştırma teknolojisi olan Julie Kim olacak. İlk olarak, standart büyüme ortamını kullanarak, hücreleri% 80 birleşene kadar tek katmanlı olarak büyütün.Sonra hücreleri HBSS ile yıkayın. HBSS'de seyreltilmiş beş mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin.Hücre ayrılmasını kontrol etmek için mikroskop kullanın. Hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu taze büyüme ortamı ile seyreltin. Her birinde birden fazla mikro kuyucuk bulunan ultra düşük ataşmanlı 24 delikli yuvarlak alt plakayı dengelemek için 0,5 mililitre büyüme ortamı ekleyin.Daha sonra, plakanın yüzeyindeki hava kabarcıklarını gidermek için plakaları 3000 x g'de santrifüj edin. Şimdi daha önce yapılmış hücre süspansiyonunu 24 delikli plakaya aktarın ve 120 x g'de üç dakika boyunca santrifüj yapın. 24 delikli plakadaki hücreleri kontrol edin ve ardından küresel oluşum için plakaları 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Bu arada, biyoreaktörü dengelemek için, nem odasına 25 mililitre steril su ve hücre odasına dokuz mililitre büyüme ortamı ekleyin. Biyoreaktörü, dönen bir klinostat inkübatöründe 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir mililitre genişliğinde delik uçları kullanarak hafifçe pipetleyerek sferoidleri ultra düşük ataşmanlı 24 delikli plakadan ayırın ve bir doku kültürü kabına aktarın.Yeterli form sferoidlerini seçmek için, mikroskop altında sferoidlerin kalitesini kontrol edin. Kaliteli sferoidler tek tip boyuta, kompaktlığa ve yuvarlaklığa sahiptir. Dengeli biyoreaktörü beş mililitre taze büyüme ortamı ile doldurun ve sferoidleri içine aktarın.Daha sonra biyoreaktörü tamamen taze büyüme ortamı ile doldurun ve biyoreaktörü klinostat inkübatörüne 10 ila 11 RPM'de yerleştirin. Her iki ila üç günde bir, 10 mililitre eski medyayı taze medyayla değiştirerek büyüme ortamını değiştirin. Bu sferoidlerin büyüklüğü ve sayısı arttıkça, inkübatörün dönme hızını arttırın.Küresel peleti elde ettikten sonra, peleti bozmak ve histonları serbest bırakmak için pelet ve pipete beş hacim soğuk 0.2 molar sülfürik asit ekleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatant elde edildikten sonra, soğuk konsantre trikloroasetik asit ekleyin, böylece nihai konsantrasyon hacimce% 25 ila% 30 hacim haline gelir. Ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve el yazmasında açıklandığı gibi santrifüj yapın.Süper natantı attıktan sonra, bir cam mera pipeti kullanarak, peleti ve tüpün duvarlarını yaklaşık 500 mikrolitre soğuk aseton ve% 0.1 hidroklorik asit ile yıkayın ve ardından dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın. Sonra süpernatanı atmak için tüpü çevirin. Bir cam mera pipeti kullanarak, daha önce gösterildiği gibi pelet ve santrifüjü yıkamak için 500 mikrolitre% 100 soğuk aseton ekleyin.Süpernatanı attıktan sonra, dikkatlice pipetleyerek, asetonunu tamamen çıkarın ve numunenin açık bir kapakla yaklaşık 20 dakika kurumasını bekleyin. Pelet, pH 8'in 100 milimolar amonyum bikarbonatında 20 mikrolitrelik 15 ila% 20 asetonitril içinde yeniden askıya alın. Girdaptan sonra, süspansiyonu 30 saniye boyunca 1000 x g'de döndürün.Sekiz veya daha fazla numune için, her bir askıya alınmış numuneyi 96 delikli bir plakaya aktarın. Daha sonra, bir davlumbazda, iki mikrolitre propiyonik anhidrit ekleyin ve beş kez pipetleyerek karıştırın. Hızlı bir şekilde 10 mikrolitre amonyum hidroksit ekleyin ve beş kez pipetleyerek karıştırın.HLB reçinesini manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Ardından, 96 delikli bir toplama plakası üzerindeki 96 delikli bir filtre plakasının her bir kuyucuğuna 70 mikrolitre HLB süspansiyonu ekleyin. Akışı attıktan sonra, reçineyi 100 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile yıkayın.Her numuneyi 100 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit içinde yeniden askıya aldıktan sonra, her bir numuneyi her bir kuyucuğa yükleyin ve bir vakum kullanarak sıçramayı önleyin. Akışı attıktan sonra, numuneleri 100 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile yıkayın ve filtre plakasını yeni bir toplama plakasına koyun. Daha sonra, her bir oyuğa% 0.1 trifloroasetik asit içinde 60 mikrolitre% 60 asetonitril ekleyin ve vakum kullanarak sıçramayı önleyin.Akışı toplayın ve hızlı bir vakumda kurutun. Kurutulmuş toplama plakasını HPLC'ye yükleyin ve makalede açıklandığı gibi LC/MS/MS yöntemini çalıştırın. Bu çalışmada, üç boyutlu sferoidler olarak yetiştirilen C3A hepatositlerinde ortak histon post-translasyonel modifikasyonların göreceli bolluğu gözlenmiştir.Post-translasyonel modifikasyonlar, histon proteinlerinden üretilen peptitlerdeki tek bir kalıntı üzerinde de gözlemlenebilir. Sferoidlerin sodyum bütirat ile tedavisi, histon asetilasyonunun göreceli bolluğunu arttırırken, sodyum süksinat ile histon kalıntısı süksinasyonunu arttırdı. Yöntem ayrıca sodyum bütirat tedavisinden sonra histon asetilasyonunun ve sodyum süksinat ile tedaviden sonra histon süksinilasyonun dağılım paternini göstermiştir.Sonuç ayrıca farklı histon modifikasyonlarının ortak paternlerini de gösterdi. Sodyum bütirat tedavileri, lizin kalıntısı 14'ün histon proteini H3'ten üretilen bir peptit üzerindeki asetilasyonunu önemli ölçüde arttırdı, ancak dokuzuncu lizin kalıntısı iki metil grubuna sahip olduğunda, ancak bir veya üç metil grubuna sahip olmadığında. H3 türevi peptiddeki bireysel modifikasyonların ve çeşitli post-translasyonel modifikasyonların kombinasyonlarının göreceli bollukları da hesaplandı.Sodyum bütirat tedavisinden sonra translasyonel modifikasyonların kombinatoryal paternleri, histon proteini H4'ten üretilen bir peptidde de gözlenmiştir. Burada da, sodyum bütirat tedavisi asetilasyonda önemli bir artışa neden olmuştur. Numune dökülmesini önlemek için sferoidlerin tezgahta mümkün olduğunca az tutulmasına ve tuzdan arındırma adımına dikkat edilmelidir. Bu iş akışı, hızlı çoğalan düz hücre kültürlerinden daha fizyolojik bir model kullanarak katı dokulardaki kromatini keşfetmek için kullanılabilir.

global-level-quantification-histone-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz H1 bağlayıcı histonlarının ekspresyon düzeyleri analiz testleri bir dizi açıklar. H1 histon protein miktarının HPLC analizi ile elde edilir ise bireysel H1 genlerin mRNA kantitatif gerçek zamanlı PCR ile takip rastgele astar göre ters transkripsiyon ile ölçülür.

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca...

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Bu makalenin amacı, bir kapsamlı, sistematik rehber histon H3 ve H4 etkili arınma ve miktar acetylated histon kalıntılarının sağlamaktır.

Arıtma H3 ve H4 histon proteinleri ve Acetylated histon işaretleri hücrelerinde ve beyin dokusu miktar

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Bu çalışma, izole beyin mikrogliasında intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel histon modifikasyonlarının ölçülmesi için bir protokolü açıklamaktadır. Çalışma ayrıca veri toplama için kullanılan mikroglia izolasyon protokolünü de içermektedir.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Bu yöntem, histon proteoform karakterizasyonu ve araştırması için basit ve hızlı bir stratejiyi tanımlar.

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Bu protokol, çeşitli klinik örneklerden verimli histon çıkarımı ve ardından LC-MS/MS ile translasyonel sonrası modifikasyon analizini sağlar. Önemli histon modifikasyonlarının sağlam tespitini kolaylaştırarak, büyük klinik kohortlarda kapsamlı epigenetik profilleme için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

Burada, izotopik iki plex etiketleme stratejisi ve ArgC sindirimi kullanarak tek hücreli histon post-translasyonel modifikasyon analizini otomatikleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, tek hücre çözünürlükte kromatin heterojenliği ve epigenetik yanıtların nicel, tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyetli profillenmesini mümkün kılar.

Tek Hücreli Histon Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Çoklayıcı Analizi için Otomatik Örnek Hazırlığı (sc-hPTM2)

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, fare genetiği kullanılarak fibroblastların floresan etiketlenmesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirerek optik şeffaflığı sağlar.

Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

Keşfedin, 3D hücre kültürü ve sıvı kromatografi kütle spektrometrisi kullanarak C3A hepatositlerinde histon post-translasyonel modifikasyonlarını nicelendirmeyi. Bu yöntem, kromatin dinamiklerini ve hastalık durumlarındaki rolünü anlamaya yardımcı olur.

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

Daha fazla video keşfet