Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi
6 Haziran 2022
Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.
Bu SiMPull protokolü, antikor etiketleme ve fiksasyon koşullarını iyileştirerek, yeşil kanalda bulunan otofloresansı azaltarak ve sağlam tek moleküllü analiz algoritmaları sağlayarak protein fosforilasyonunun miktarını sağlar. SiMPull'un birincil avantajı, bireysel bozulmamış proteinlerin fosforilasyon durumunu sorgulamamıza izin vermesidir. Bu yöntemle, batı lekelenmesi ve kütle spesifikasyonu analizi gibi geleneksel tekniklerle erişilemeyen yeni bilgiler elde edebiliriz.
Protokolü göstermeye yardımcı olacak bir araştırmacı ekibimiz var. İlk olarak, Julian Rojo kapak camını nasıl piranha'nın kazıyacağını gösterecek. Rachel Grattan daha sonra kapak camının kaplanması için adımları gösterecektir.
Elizabeth Bailey, dizi ve görüntü örneklerinin nasıl çizileceğini gösterecek. Başlamak için, piranha, reaksiyon kabını 30 dakika boyunca her beş dakikada bir hafifçe çalkalayarak kapak kaymalarını aşındırın. Piranha çözeltisini yavaş yavaş zayıf bir baz ekleyerek nötralize etti.
Bir cam çubukla, kazınmış kapak kaymalarını bir Buchner hunisine aktarın ve çift damıtılmış suda beş dakika durulayın. Daha sonra kapak fişlerini bir cam Coplin kavanozuna yerleştirin ve metanol ile örtün. Kapağı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 10 dakika boyunca sonikat banyosu yapın.
Sonikasyondan sonra, metanolü bir cam saklama şişesine boşaltın. Bu adımı asetonla tekrarlayın. Coplin kavanozunda çift damıtılmış su ile kapak kaymalarını üç kez durulayın.
Kapak kapaklarındaki suyu boşaltın ve bir Bunsen brülörünün alevinden sallayarak kurutun. Kapak fişlerini kuru bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Daha sonra kapak kayma amino silanizasyonu gerçekleştirmek için Coplin kavanozuna amino silan çözeltisi ekleyin.
Işıktan korumak için bir sızdırmazlık filmi örtün ve uygulayın. Kapak kaymalarını metanol ile durulayın ve kullanılan çözeltiyi atın. Yine, kapak kaymalarını her biri iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla üç kez durulayın.
Fazla nemi uzaklaştırın ve 10 dakika boyunca tamamen kurutun. Ardından, hidrofobik bariyer kalemi ile ızgara dizisi çizin. Doğru yönü belirlemek için kapak fişindeki tanımlayıcıyı işaretleyin.
Mürekkep kuruduktan sonra, kapak kapaklarını nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. 609 mikrolitre 10 milimolar sodyum bikarbonat ve vortekste 153 miligram mPEG ve 3.9 miligram biotin-PEG'i yeniden askıya alın. Kabarcıkları gidermek için oda sıcaklığında bir dakikadan itibaren 10.000 x g'de santrifüj.
Diziyi taşmadan tamamen örtmek için kare başına bu çözeltinin 10 ila 15 mikrolitresini uygulayın. Kapak kaymalarını oda sıcaklığında üç ila dört saat boyunca karanlıkta nem odasına saklayın. Ardından, kapak fişlerini 10 saniye boyunca sırayla çift damıtılmış suyla doldurulmuş üç beherin içine batırarak yıkayın.
Nitrojen gazı kullanarak kapak kapaklarındaki tüm nemi temizleyin. Kapak kaymalarını azotla doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüp içinde arka arkaya saklayın ve bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Tüpü sızdırmazlık filmi ile sarın ve eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin.
Biotin-PEG işlevselleştirilmiş dizilerini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına dengeleyin. Kapak kaymasını, dizi, sızdırmazlık filmi ile kaplı 100 milimetrelik bir doku kültürü kabının üzerine bakacak şekilde yerleştirin. Dizinin her karesini, oda sıcaklığında dört dakika boyunca PBS'de mililitre sodyum borohidrit başına 10 miligram ile inkübe edin.
PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra beş dakika boyunca T50'de mililitre başına 0.2 miligram NeutrAvidin ile inkübe edin, ardından T50 BSA ile üç kez yıkayın. Kuluçkayı T50 BSA'da mililitre başına iki mikrogram biyotinile POI spesifik antikor ile 10 dakika boyunca tekrarlayın ve ardından yıkayın.
İlk olarak, çözülme lizatı pipetleme ile karıştırın. Bir mikrolitre lizatı 100 mikrolitre buz gibi soğuk T50 BSA PPI içine seyreltin. Dizi üzerindeki lizatı 10 dakika boyunca inkübe edin, ardından yıkayın.
AF647 konjuge anti-fosfotirozin antikorunu buz gibi soğuk T50 BSA PPI'da hazırlayın ve bir saat boyunca dizi üzerinde inkübe edin. Hedefe bir damla yağ koyun. Nanoızgarayı görüntüleme için sahneye yerleştirin.
İletilen beyaz ışığı kullanarak, ızgara desenine odaklanın. Izgaranın 20 görüntüsünden oluşan bir dizi elde edin, piksellerin doygun olmadığından emin olun ve görüntü serisini güvenilir olarak kaydedin. Havadar bir desen oluşturmak için nanoızgarayı bulanıklaştırın, kazanç kalibrasyonları için bir dizi 20 görüntü elde edin ve görüntüyü kazanç olarak kaydedin.
Ardından, kameraya gelen tüm ışığı engelleyerek kamera ofseti için 20 görüntüden oluşan bir dizi elde edin ve görüntülerin arka planını kaydedin. Basit görüntüler elde etmek için, önce yağ hedefini temizleyin ve hedefe ek yağ biriktirin. Kapak kayma dizisini mikroskop aşamasında sabitleyin.
Her örnek için, önce uzak kırmızı kanalda, ardından daha düşük dalga boylu floroforlarda görüntüler elde edin. Arabellek seviyesini her 30 ila 45 dakikada bir kontrol edin ve gerektiğinde doldurun. Bu teknik kullanılarak, EGFR-GFP toplam protein lizatlarından yakalandı.
Hidrofobik mürekkebin otofloresansı, numunenin odak düzlemini bulmak için bir rehber olarak kullanılmıştır. Ham veri görüntüleri, kamera çipi üzerinde ayrılmış spektral kanallarla elde edildi. Yeşil ve uzak kırmızı kanalların bir bindirmesi, veri toplama için daha fazla incelendi.
Nanogridden elde edilen görüntüler üzerinde kanal kaydı yapıldı. Güvenilir görüntülerin bir bindirmesi, eksik kayıt gösterdi. Hizalama, sonraki SiMPull verilerini kaydetmek için kullanılan uzak kırmızı ve yeşil kanal koordinatlarına yerel ağırlıklı ortalama bir dönüşüm uygulanarak yapıldı.
GFP ve AF647 kanallarından arka plan foton sayısının üzerindeki tek yayıcılar kutulandı ve yerleri belirlemek için Gauss lokalizasyonu yapıldı. Bir F647'de EGFR-GFP'nin kolokalizasyonu, fosforile reseptörleri tanımlamak için yapıldı. Fosforile reseptörlerin fraksiyonunu belirlemek için kolokalizasyon yüzdesi kullanıldı.
Piranha kazınmış cam sodyum borohidrit ile muamele edildiğinde arka plan tespitleri azaltıldı. Lizin içindeki EGFR-GFP'nin sağlam bağlanması, minimal spesifik olmayan PY99-AF647 bağlanması ile gözlendi ve bu teknik kullanılarak yüzey işlevselliğinin korunduğunu gösterdi. SiMPull, protein fosforilasyonu hakkında bilgi sağlar ve çok çeşitli kendi kendine sinyal veren soruları ele alabilir.
Bu, hem normal hem de hastalık durumlarında sinyal verme anlayışımızı geliştirebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu SiMPull protokolü, antikor etiketleme ve fiksasyon koşullarını geliştirerek protein fosforilasyonunun kantitatif analizini sağlar. Yeşil kanalda otofloresansı azaltır ve güçlü tek molekül analizi algoritmaları sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Protein Analizi
Arka Plan
- Protein fosforilasyonu kritik bir translasyon sonrası modifikasyondur.
- Western blotting ve kütle spektrometrisi gibi geleneksel tekniklerin sınırlamaları vardır.
- Tek molekül analizi protein davranışı hakkında yeni bilgiler sunar.
- Bu protokol, fosforilasyon kantitatif analizinin doğruluğunu artırmayı amaçlar.
Çalışmanın Amacı
- Tek molekül düzeyinde protein fosforilasyonunu kantitatif olarak belirlemek.
- Antikor etiketleme ve fiksasyonun güvenilirliğini artırmak.
- Geleneksel analitik teknikleri aşan bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tek molekül pull-down (SiMPull) analizi.
- Gelişmiş antikor etiketleme teknikleri.
- Otofloresansı azaltmak için optimize edilmiş fiksasyon koşulları.
- Güçlü tek molekül analizi algoritmaları.
Ana Sonuçlar
- Protein fosforilasyonunun geliştirilmiş kantitatif analizi.
- Yeşil kanalda otofloresansın başarılı bir şekilde azaltılması.
- Protokolün araştırmacılar ekibi tarafından gösterilmesi.
- Tek tek proteinlerin fosforilasyon durumunu sorgulama yeteneği.
Sonuçlar
- SiMPull protokolü protein analizinde önemli bir ilerleme sağlar.
- Önceden erişilemeyen fosforilasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, belirli uygulamalarda geleneksel tekniklerin yerini alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying protein phosphorylation at the single-molecule level addresses a critical gap in understanding signaling heterogeneity and mechanistic pathway activation in drug discovery. The optimized SiMPull assay enables robust, quantitative assessment of receptor phosphorylation, supporting predictive confidence in target validation and early discovery decisions. This capability enhances portfolio triage by providing high-resolution data on posttranslational modifications relevant to disease biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phosphorylation status for individual membrane receptors, clarifying pathway activation.
- Supports biological de-risking by revealing heterogeneity in posttranslational modification across protein populations.
- Improves predictive confidence for target engagement and functional validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative single-molecule readouts for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions through optimized antibody labeling and fixation protocols.
- Facilitates reproducible, scalable quantification of phosphorylation for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phosphorylation measurements with disease-relevant signaling pathways for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative modification data.
Pipeline & Workflow Integration
The SiMPull assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for quantitative posttranslational analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying phosphorylation at the single-molecule level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides robust statistical measurements of phosphorylation fractions across thousands of receptors.
- Translational Research: Enables alignment of signaling data with disease models for biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable protocol adaptable to diverse membrane receptors and signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of phosphorylation assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution modification data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule imaging and quantitative data analysis.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence imaging and robust computational infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of antibody labeling and fixation protocols.
- Adaptable to various model systems with protocol optimization for different protein targets.
- Practical limitations include the need for high-quality reagents and careful control of autofluorescence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Coverslip Preparation
3:18
Functionalization of Array with Biotinylated Antibody
4:09
SiMPull of Proteins of Interest from Whole-Cell Lysates
4:40
Image Acquisition
5:45
Results: Capture of EGFR-GFP from Protein Lysates Using SiMPull
7:19
Conclusion
