Name: Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Keşfedin tek moleküllü pull-down (SiMPull) yöntemiyle protein fosforilasyonunun niceliksel analizini. Antikor etiketleme ve fiksasyon koşullarını optimize ederek otofloresansı azaltın ve bireysel proteinlerin fosforilasyon durumunu inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R35GM126934, R01AI153617 ve R01CA248166 to DSL tarafından desteklenmiştir. EMB, ASERT-IRACDA programı (NIH K12GM088021) ve UNM MARC programı (NIH 2T34GM008751-20) tarafından JAR aracılığıyla desteklenmiştir. NIH P30CA118100 tarafından desteklenen New Mexico Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi floresan mikroskobu ortak kaynağını kullanarak minnetle teşekkür ederiz. SiMPull'un orijinal gelişimi bu çalışmaya ilham veren Dr. Ankur Jain ve Taekijip Ha'ya teşekkür etmek istiyoruz. ES-C mevcut adresi: İmmünodinamik Grubu, Bütünleştirici Kanser İmmünolojisi Laboratuvarı, Kanser Araştırmaları Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada açıklanan protokol, tek protein seviyesinde reseptör fosforilasyonunun kantitatif ölçümlerini sağlamak için optimize edilmiştir. SiMPull protokolünde, NaBH4 tedavisi ile otofloresanın azaltılması ve antikor ayrışmasını önlemek için numunenin son sabitlenmesi de dahil olmak üzere fosfo-tirozin tespiti için ölçümün güvenilirliğini artıran birkaç basit ama önemli değişiklik geliştirilmiştir. Anti-PY antikoru ile kolokalizasyonun hesaplanması için reseptör konumlarını tanımlamak için yeşil kanal maskesinin ...

Membranla ilişkili sinyalleşme, ligand kaynaklı membran reseptör aktivasyonu ve sinyali yayan aşağı akış aksesuar proteinlerinin işe alınmasının bir kombinasyonu ile ayarlanır. Reseptör sitoplazmik kuyruklarındaki anahtar tirozinlerin fosforilasyonu, sinyal komplekslerinin veya sinyalozomların oluşumunu başlatmak için kritik öneme sahiptir 1,2. Bu nedenle, biyolojide önemli bir soru, sinyal ortaklarını işe almak ve hücresel sonuçları dikte etmek için fosforilasyon modellerinin nasıl oluşturulduğu ve sürdürüldüğüdür. Bu, reseptör fosforilasyonunun heterojenliğini, hem bol miktarda hem de sinyalozom 3,4,5,6,7'nin bileşimini dikte ederek sinyal çıkışlarını manipüle etmenin bir yolunu sağlayabilen spesifik fosfotirozin modellerinde anlamayı içerir. Bununla birlikte, protein fosforilasyonunu sorgulamak için mevcut yöntemlerde sınırlamalar vardır. Batı leke analizi, protein fosforilasyon eğilimlerini tanımlamak için mükemmeldir, ancak yarı kantitatif8'dir ve sistemin heterojenliği hakkında bilgi sağlamaz, çünkü binlerce ila milyonlarca reseptörün ortalaması birlikte alınır. Batı lekeleri, spesifik tirozinlere fosfo-spesifik antikorlar kullanarak bir numunenin araştırılmasına izin verirken, aynı protein içindeki çok bölgeli fosforilasyon paternleri hakkında bilgi sağlayamazlar. Kantitatif fosfoproteomikler fosfotirozin bolluğu hakkında rapor verir, ancak çok bölgeli fosforilasyonun saptanmasında sınırlamalar vardır, çünkü ilgilenilen kalıntıların enzimatik sindirim9,10,11 tarafından üretilen aynı peptid (tipik olarak 7-35 amino asit) içinde bulunması gerekir.
Yukarıda belirtilen sınırlamaların üstesinden gelmek için, tek moleküllü aşağı çekme (SiMPull) testi, tek moleküllü seviyedeki sağlam reseptörlerin fosforilasyon durumlarını ölçmek için uyarlanmıştır. SiMPull, makromoleküler kompleksleri sorgulamak için güçlü bir araç olarak ilk olarak Jain ve ark.12,13 tarafından gösterilmiştir. SiMPull'da, makromoleküler kompleksler antikor işlevselleştirilmiş cam kapaklar üzerinde immünoprepite edildi (IP) ve daha sonra protein alt birim sayısı ve karmaşık bileşenlerle ko-IP için tek moleküllü mikroskopi ile analiz edildi12. Kim ve ark.14 tarafından SiMBlot olarak adlandırılan bir modifikasyon, denatüre proteinlerin fosforilasyonunu analiz etmek için SiMPull'un bir varyasyonunu kullanan ilk kişi oldu. SiMBlot protokolü, NeutrAvidin kaplı kapaklar kullanılarak biyotinile hücre yüzey proteinlerinin yakalanmasına dayanır ve bunlar daha sonra fosfo-spesifik antikor etiketleme14 ile fosforilasyon için incelenir. Bu ilerlemelere rağmen, posttranslasyonel modifikasyonun nicelleştirilmesini daha sağlam ve daha geniş bir protein yelpazesine uygulanabilir hale getirmek için iyileştirmelere ihtiyaç vardı.
Mevcut protokol, bir dizi ligand koşuluna ve onkojenik mutasyonlara yanıt olarak bozulmamış epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyon paternlerini ölçmek için kullanılan optimize edilmiş bir SiMPull yaklaşımını tanımlamaktadır15. Bu çalışma EGFR'ye odaklanırken, bu yaklaşım, kaliteli antikorların mevcut olduğu herhangi bir membran reseptörü ve sitozolik proteinlere (POI) uygulanabilir. Protokol, numune otofloresansını azaltma adımlarını, 20 numuneye kadar eşzamanlı hazırlık ile minimum numune hacmi gerektiren bir numune dizisi tasarımını ve antikor etiketleme ve sabitleme koşullarının optimizasyonunu içerir. Fosforile proteinlerin tek moleküllü tespiti ve nicelleştirilmesi için veri analiz algoritmaları geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Tampon</td></tr><tr><td>100 mm Doku Kültürü kabı</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Piranha kazınmış cam/dizilerin saklanması</td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit Sulu Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td></td><td></td><td>Fonksiyonelleştirilmiş Cam depolama/ KOH yeniden kullanım</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>Lizis Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>60 mm Doku Kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>%8 Glutaraldehit Sulu Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16020</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Aseton (C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>Hayvansız Rekombinant İnsan EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan EGFR (Harici Alan) &ndash; Biotin</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p-Tyr Antikoru (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Banyo sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Test Kiti</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-420-1</td><td>Tyrode'un Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Buchner hunisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen brülörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode'un Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Hücre Kazıyıcı</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Konik Filtreleme Şişesi</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanoz</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Lameller 24 x 60 # 1.5</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Keson Laboratuvarları</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>emCCD kamera</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>Isı İnaktive</td></tr><tr><td>Füzyon 360 yazılımı</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disülfat</td><td>Keson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Cam serolojik pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam Karıştırma Çubuğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz (D-(+)-Glikoz)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode'un Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Halt Fosfotaz ve Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Lizis Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Tyrode'ın Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit (H2O2) (%3)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit (H2O2) (%30)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Lizis Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>ImmEdge Hidrofobik Bariyer Kalem</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F daldırma yağı</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>kurum içi vakum hattı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Magnessium Klorür Hekzahidrat (MgCl2-6H2O)</td> <td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode'un Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Eğrisi Uydurma Araç Kutusu, Paralel Bilgi İşlem Araç Kutusu ve İstatistik ve Makine Öğrenimi araç kutusu</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Milli-Q suyu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF Boya Antikor Etiketleme Kitleri</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Önerilen konjugasyon kiti</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-süksinimidil valerat, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>N- (2-aminoetil) -3-aminopropiltrimetoksisilan</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Nanogrid</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotin Bağlayıcı Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Azot (sıkıştırılmış gaz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUDA</td><td></td><td></td> ile NVIDIA GPU <td>Uyumluluğu https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Olympus iX71 Mikroskopta</td> arayın <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Sızdırmazlık Filmi</td><td>Laboratuvar Deposu</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Keson Laboratuvarları</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Analog Sıcak</td><td>Plaka Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-EGF Reseptörü (Tyr1068) (1H12) Fare mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Tyrode'un Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit (KOH)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Premium PLA Filament, 1,75 mm çap</td><td>3D PMS'yi Yükselt</td>: <td>2035U / RAL: 3028</td><td>Baskı sıcaklık aralığı: 205-235 ve derece; C</td></tr><tr><td>Pro2 3D yazıcı</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L beher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 mL saklama şişeleri</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>CH3OH / C 3H 6O yeniden kullanım</td></tr><tr><td>Pyrex 250 mL beherler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 4 L beher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dörtlü görünüm Görüntü Bölücü Fotometri</td><td></td><td>Modeli QV2</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount Hücre Sayaçları, EVE Hücre Sayma Slaytları</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Semrock emisyon filtreleri: mavi (445/45 nm), yeşil (525/45 nm), kırmızı (600/37 nm), uzak kırmızı (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet kontrolörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>smite tek molekül analiz paketi</td><td></td><td></td><td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Sodyum Borhidrür (NaBH4)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Tampon Bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Ardışık ısı ve pH döngüsü ile etkinleştirin</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Ortovanadat (Na3VO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Sülfürik Asit (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikro</td><td>Küreler Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>çoklu floresan boncuklar</td></tr><tr><td>Tris (Trizma) tabanı</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavi leke, %0,4</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0,05</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

protein fosforilasyonunun miktarının belirlenmesi için optimize edilmiş tek moleküllü bir pull-down testi

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Fosforilasyon, protein fonksiyonunu düzenleyen ve hücre sinyal sonuçlarını yönlendiren gerekli bir posttranslasyonel modifikasyondur. Protein fosforilasyonunu ölçmek için mevcut yöntemler, tek tek proteinler arasında fosforilasyondaki heterojenliği koruyamaz. Tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi, makromoleküler komplekslerin bileşimini, proteinlerin bir cam kapak kapağı üzerindeki immünopresipitasyonu ve ardından tek moleküllü görüntüleme yoluyla araştırmak için geliştirilmiştir. Mevcut teknik, tek molekül seviyesinde tam uzunluktaki membran reseptörlerinin fosforilasyon durumunun sağlam bir şekilde ölçülmesini sağlayan SiMPull'un bir uyarlamasıdır. Binlerce bireysel reseptörün bu şekilde görüntülenmesi, protein fosforilasyon paternlerinin ölçülmesine izin verir. Mevcut protokol, numune hazırlamadan görüntülemeye kadar optimize edilmiş SiMPull prosedürünü detaylandırır. Cam hazırlama ve antikor fiksasyon protokollerinin optimizasyonu veri kalitesini daha da artırır. Mevcut protokol, bir numune içinde fosforile edilen reseptörlerin fraksiyonunu hesaplayan tek moleküllü veri analizi için kod sağlar. Bu çalışma epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyonuna odaklanırken, protokol diğer membran reseptörlerine ve sitozolik sinyal moleküllerine genelleştirilebilir.

SiMPull işlemini gösteren bir karikatür Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kapak fişleri, toplam protein lizatlarından EGFR-GFP'yi yakalamak için biyotinile anti-EGFR antikorları için bir çapa olarak NeutrAvidin kullanılarak işlevselleştirilir. Bağlı olmayan proteini yıkadıktan sonra, fosforile reseptörler bir anti-fosfotirozin (anti-PY) antikoru15 ile etiketlenir. Şekil 1B , aynı kapak fişi üzerinde birden fazla numunenin hazırlanabileceği ve g...

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Bu SiMPull protokolü, antikor etiketleme ve fiksasyon koşullarını iyileştirerek, yeşil kanalda bulunan otofloresansı azaltarak ve sağlam tek moleküllü analiz algoritmaları sağlayarak protein fosforilasyonunun miktarını sağlar. SiMPull'un birincil avantajı, bireysel bozulmamış proteinlerin fosforilasyon durumunu sorgulamamıza izin vermesidir. Bu yöntemle, batı lekelenmesi ve kütle spesifikasyonu analizi gibi geleneksel tekniklerle erişilemeyen yeni bilgiler elde edebiliriz.Protokolü göstermeye yardımcı olacak bir araştırmacı ekibimiz var. İlk olarak, Julian Rojo kapak camını nasıl piranha'nın kazıyacağını gösterecek. Rachel Grattan daha sonra kapak camının kaplanması için adımları gösterecektir.Elizabeth Bailey, dizi ve görüntü örneklerinin nasıl çizileceğini gösterecek. Başlamak için, piranha, reaksiyon kabını 30 dakika boyunca her beş dakikada bir hafifçe çalkalayarak kapak kaymalarını aşındırın. Piranha çözeltisini yavaş yavaş zayıf bir baz ekleyerek nötralize etti.Bir cam çubukla, kazınmış kapak kaymalarını bir Buchner hunisine aktarın ve çift damıtılmış suda beş dakika durulayın. Daha sonra kapak fişlerini bir cam Coplin kavanozuna yerleştirin ve metanol ile örtün. Kapağı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 10 dakika boyunca sonikat banyosu yapın.Sonikasyondan sonra, metanolü bir cam saklama şişesine boşaltın. Bu adımı asetonla tekrarlayın. Coplin kavanozunda çift damıtılmış su ile kapak kaymalarını üç kez durulayın.Kapak kapaklarındaki suyu boşaltın ve bir Bunsen brülörünün alevinden sallayarak kurutun. Kapak fişlerini kuru bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Daha sonra kapak kayma amino silanizasyonu gerçekleştirmek için Coplin kavanozuna amino silan çözeltisi ekleyin.Işıktan korumak için bir sızdırmazlık filmi örtün ve uygulayın. Kapak kaymalarını metanol ile durulayın ve kullanılan çözeltiyi atın. Yine, kapak kaymalarını her biri iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla üç kez durulayın.Fazla nemi uzaklaştırın ve 10 dakika boyunca tamamen kurutun. Ardından, hidrofobik bariyer kalemi ile ızgara dizisi çizin. Doğru yönü belirlemek için kapak fişindeki tanımlayıcıyı işaretleyin.Mürekkep kuruduktan sonra, kapak kapaklarını nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. 609 mikrolitre 10 milimolar sodyum bikarbonat ve vortekste 153 miligram mPEG ve 3.9 miligram biotin-PEG'i yeniden askıya alın. Kabarcıkları gidermek için oda sıcaklığında bir dakikadan itibaren 10.000 x g'de santrifüj.Diziyi taşmadan tamamen örtmek için kare başına bu çözeltinin 10 ila 15 mikrolitresini uygulayın. Kapak kaymalarını oda sıcaklığında üç ila dört saat boyunca karanlıkta nem odasına saklayın. Ardından, kapak fişlerini 10 saniye boyunca sırayla çift damıtılmış suyla doldurulmuş üç beherin içine batırarak yıkayın.Nitrojen gazı kullanarak kapak kapaklarındaki tüm nemi temizleyin. Kapak kaymalarını azotla doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüp içinde arka arkaya saklayın ve bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Tüpü sızdırmazlık filmi ile sarın ve eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin.Biotin-PEG işlevselleştirilmiş dizilerini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına dengeleyin. Kapak kaymasını, dizi, sızdırmazlık filmi ile kaplı 100 milimetrelik bir doku kültürü kabının üzerine bakacak şekilde yerleştirin. Dizinin her karesini, oda sıcaklığında dört dakika boyunca PBS'de mililitre sodyum borohidrit başına 10 miligram ile inkübe edin.PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra beş dakika boyunca T50'de mililitre başına 0.2 miligram NeutrAvidin ile inkübe edin, ardından T50 BSA ile üç kez yıkayın. Kuluçkayı T50 BSA'da mililitre başına iki mikrogram biyotinile POI spesifik antikor ile 10 dakika boyunca tekrarlayın ve ardından yıkayın.İlk olarak, çözülme lizatı pipetleme ile karıştırın. Bir mikrolitre lizatı 100 mikrolitre buz gibi soğuk T50 BSA PPI içine seyreltin. Dizi üzerindeki lizatı 10 dakika boyunca inkübe edin, ardından yıkayın.AF647 konjuge anti-fosfotirozin antikorunu buz gibi soğuk T50 BSA PPI'da hazırlayın ve bir saat boyunca dizi üzerinde inkübe edin. Hedefe bir damla yağ koyun. Nanoızgarayı görüntüleme için sahneye yerleştirin.İletilen beyaz ışığı kullanarak, ızgara desenine odaklanın. Izgaranın 20 görüntüsünden oluşan bir dizi elde edin, piksellerin doygun olmadığından emin olun ve görüntü serisini güvenilir olarak kaydedin. Havadar bir desen oluşturmak için nanoızgarayı bulanıklaştırın, kazanç kalibrasyonları için bir dizi 20 görüntü elde edin ve görüntüyü kazanç olarak kaydedin.Ardından, kameraya gelen tüm ışığı engelleyerek kamera ofseti için 20 görüntüden oluşan bir dizi elde edin ve görüntülerin arka planını kaydedin. Basit görüntüler elde etmek için, önce yağ hedefini temizleyin ve hedefe ek yağ biriktirin. Kapak kayma dizisini mikroskop aşamasında sabitleyin.Her örnek için, önce uzak kırmızı kanalda, ardından daha düşük dalga boylu floroforlarda görüntüler elde edin. Arabellek seviyesini her 30 ila 45 dakikada bir kontrol edin ve gerektiğinde doldurun. Bu teknik kullanılarak, EGFR-GFP toplam protein lizatlarından yakalandı.Hidrofobik mürekkebin otofloresansı, numunenin odak düzlemini bulmak için bir rehber olarak kullanılmıştır. Ham veri görüntüleri, kamera çipi üzerinde ayrılmış spektral kanallarla elde edildi. Yeşil ve uzak kırmızı kanalların bir bindirmesi, veri toplama için daha fazla incelendi.Nanogridden elde edilen görüntüler üzerinde kanal kaydı yapıldı. Güvenilir görüntülerin bir bindirmesi, eksik kayıt gösterdi. Hizalama, sonraki SiMPull verilerini kaydetmek için kullanılan uzak kırmızı ve yeşil kanal koordinatlarına yerel ağırlıklı ortalama bir dönüşüm uygulanarak yapıldı.GFP ve AF647 kanallarından arka plan foton sayısının üzerindeki tek yayıcılar kutulandı ve yerleri belirlemek için Gauss lokalizasyonu yapıldı. Bir F647'de EGFR-GFP'nin kolokalizasyonu, fosforile reseptörleri tanımlamak için yapıldı. Fosforile reseptörlerin fraksiyonunu belirlemek için kolokalizasyon yüzdesi kullanıldı.Piranha kazınmış cam sodyum borohidrit ile muamele edildiğinde arka plan tespitleri azaltıldı. Lizin içindeki EGFR-GFP'nin sağlam bağlanması, minimal spesifik olmayan PY99-AF647 bağlanması ile gözlendi ve bu teknik kullanılarak yüzey işlevselliğinin korunduğunu gösterdi. SiMPull, protein fosforilasyonu hakkında bilgi sağlar ve çok çeşitli kendi kendine sinyal veren soruları ele alabilir.Bu, hem normal hem de hastalık durumlarında sinyal verme anlayışımızı geliştirebilir.

an-optimized-single-molecule-pull-down-assay-for-quantification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Bu video, tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak protein fosforilasyonunun hassas bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Polietilen glikol-biyotinin işlevselleştirilmesi ve etiketli antikorların kullanılması, fosforile tirozinin özgüllük ile saptanmasını arttırır.

Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir nitroselüloz bağlanma testini rapor ediyor ve gösteriyoruz. Yöntemimiz, geleneksel SDS-PAGE tabanlı tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir ve bu önemli proteinleri karakterize etmek için değerli bir alternatif sunar.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.

İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Keşfedin tek moleküllü pull-down (SiMPull) yöntemiyle protein fosforilasyonunun niceliksel analizini. Antikor etiketleme ve fiksasyon koşullarını optimize ederek otofloresansı azaltın ve bireysel proteinlerin fosforilasyon durumunu inceleyin.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Daha fazla video keşfet