Name: Ex Vivoda Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Öğrenin, hücre dışı glikoz tükenmesi yöntemiyle 3T3-L1 fare fibroblastlarında yüksek verimli glikoz alımı ölçümü yapmayı. Bu teknik diyabet, kanser ve metabolik hastalıklar için terapötik keşiflere olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Proje, Ralph ve Marian Falk Tıbbi Araştırma Katalizörü Ödülü ve Kathleen Kelly Ödülü tarafından desteklendi. Diğer destekler arasında Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi UL1RR025755 ve NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası yer aldı. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi veya NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Hayvan çalışmaları, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (OSU, protokol 2007A0262-R4).
NOT: Tüm prosedürler, üfleyici açık ve ışıklar kapalı olarak sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
<ol><li>Sınıf II biyogüvenlik kabininde Tablo 1'e göre Ortam 1, santrifüjleme Ortamı 2 ve floresan 2-deoksi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino]-D-glikoz (2-NBDG veya FD-glikoz) depolama ve çalışma çözeltileri hazırlayın. Kaputun altındaki tüm ışıkları kapatarak deney boyunca FD-glikozu ışıktan koruyun.</li>
	<li>Kullanıma hazır hücre kültürü reaktifleri kullanın: Tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve glikozsuz ve fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (bundan böyle glikozsuz DMEM olarak anılacaktır).</li>
	<li>20 mL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu kullanın. NOT: Aşağıdaki bölümlerde, insülin stimülasyonu olan ve olmayan 3T3-L1 fibroblastlarında farklı FD-glukoz dozlarının hücre dışı tükenmesi ve hücre içi alımı karşılaştırılmıştır (Şekil 2).</li>
</ol>2. 3T3-L1 hücre kültürü ve bakımı
<ol><li>Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, iki adet96 delikli plakada 20 mL Orta 1'de seyreltilmiş 1 x 10 6 hücreyi kaplayarak kaplar. Plaka kuyu başına 100 μL hücre süspansiyonu, bu süspansiyonun homojenliğinin bozulmasını sağlayarak homojenliğin korunmasını sağlar. 37 °C'lik bir inkübatörde (% 5 CO2 ve% 95 nem) yaklaşık% 70 -% 80 akıcılığa kadar ortam değiştirmeden hücreleri 48 saat büyütün.</li>
	<li>Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyerek akıcı ve oruç tutun. İstenilen açlık katabolik durumuna bağlı olarak kuluçka süresini 24-72 saat arasında değiştirin.</li>
</ol>3. 3T3-L1 hücrelerinin açlığı
<ol><li>96 delikli plakalardaki hücrelerden gelen dekant ortam. Steril kağıt havlular kullanarak kalan sıvıyı emer.</li>
	<li>96 delikli plakayı kuyucuk başına 100 μL PBS ile durulayın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer.</li>
	<li>Kuyu başına 100 μL glikozsuz DMEM ekleyin ve 40 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre tipine, uyaranlara ve istenen açlık seviyesine bağlı olarak kuluçka süresini ayarlayın. NOT: Kuluçka zamanı, mevsime bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.</li>
</ol>4. Farklı konsantrasyonlarda FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması
NOT: Şekil 2'deki deney, insülin ile stimülasyonu olan ve olmayan hücre dışı ve hücreler arası ortamları incelemektedir.
<ol><li>Her stimülasyon koşulu için sekiz replikasyon (96 delikli bir plakada bir sıra) kullanın. Bu nedenle, her stimülasyon koşulu için 1 mL hazırlayın ( Tablo 2 ve aşağıda belirtilmiştir).</li>
	<li>İnsülin olmadan sekiz stimülasyon koşulu kullanın: 96 delikli bir plakada 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikozsuz kontrol) FD-glukoz.</li>
	<li>İnsülin ile sekiz stimülasyon koşulu kullanın (10 μg / mL, son konsantrasyon): Başka bir 96 delikli plakada 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikozsuz kontrol) FD-glukoz.</li>
	<li>Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, 1 mL çalışma stoğu çözeltisi (1:1000 seyreltme veya 5 μg / mL) elde etmek için 999 μL glikozsuz DMEM'de 1 μL 5 mg / mL FD-glikoz çalışma çözeltisini (Tablo 1) seyreltin.<ol><li>Bu çalışan stok çözeltisini kullanarak, ışıksız bir biyogüvenlik kabinindeki deneylerden hemen önce 2 mL tüplerde 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5g / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.1 μg / mL ve 0.05 μg / mL (Tablo 2) elde etmek için 1:2000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000, 1:50.000 ve 1:100.000 seyreltme FD-glikoz hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Adım 4.4'ü tekrarlayın ve yukarıda belirtilen koşulların her birine 1 μL insülin (10 mg / mL, son konsantrasyon) ekleyin. NOT: Bu numunelerdeki nihai insülin konsantrasyonu 10 μg / mL = 1.7 nmol / mL'dir. Homojenizasyonu sağlamak için, başka çözeltiler eklemeden önce tüplere insülin ekleyin.</li>
</ol>5. Aç kalan 3T3-L1 hücrelerinin tedavisi
<ol><li>40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikozsuz DMEM'yi 96 delikli plakalar halinde her bir kuyucuktan boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer.</li>
	<li>Yukarıda açıklanan çeşitli arıtma koşullarından her biri bir sütun boyunca kuyucuklara 100 μL (kuyu başına) ve aynı arıtma koşulundan her iki 96 kuyucuklu plakadaki sıra boyunca kuyucuklara (sekiz kopya) 100 μL (kuyu başına) ekleyin. İnsülinli ve insülinsiz koşulları kullanan plakaları etiketleyin. Kontrol kuyularına tek başına glikozsuz DMEM ekleyin (n = 8).</li>
	<li>Plakayı karanlıkta bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) 40 dakika boyunca inkübe edin.</li>
</ol>6. Uyarılmış 3T3-L1 hücreleri için hücre dışı ve hücreler arası ölçümler
<ol><li>Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra, stimülasyon ortamını her iki plakadan aynı deney düzenini koruyan yeni 96 delikli plakalara aktarın.</li>
	<li>Orijinal uyarılmış 96 delikli plakalardan kalan herhangi bir çözeltiyi, steril kağıt havlular üzerindeki hücrelerle boşaltın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve steril kağıt havluların üzerinde kalan solüsyonu boşaltın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa 100 μL RIPA lizis tamponu ekleyin. İsteğe bağlı olarak, proteinleri korumak için RIPA tamponuna proteaz inhibitörü ekleyin. RIPA içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
	<li>Bir mikroplaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm uyarma (Ex) ve emisyon (Em) dalga boylarında floresansı, önce hücre dışı FD-glikoz içeren ortamda, daha sonra 30 dakikalık inkübasyonun sonunda RIPA-lize hücrelere sahip plakayı ölçün (bkz. adım 6.4).</li>
</ol>7. Hücre içi glikoz alımının protein bazlı normalizasyonu
NOT: Hücre içi FD-glukoz alımı hücre sayısına bağlıdır. Hücresel lizatlardaki protein seviyeleri, hücre içi FD-glikoz seviyelerinin her bir kuyucuktaki hücre sayısına normalleştirilmesine izin veren hücre sayılarıyla orantılıdır.
<ol><li>BCA protein testini üreticinin talimatlarına göre yapın (bkz. RIPA-lize hücreler içeren her kuyucuktaki protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın.</li>
	<li>10 μL RIPA homojenatı kullanın ve 96 delikli plakalardaki ölçümlerin doğruluğunu artırmak için protein konsantrasyonlarını üçlü olarak ölçün.</li>
	<li>Her 96 delikli plakadaki örneklerle birlikte analiz edilen protein standartlarına (0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 60 μg / mL protein) dayanarak proteini sayısallaştırın.</li>
	<li>562 nm'deki absorbansı ölçün ve protein standardı için elde edilen doğrusal regresyon formülüne dayanarak her numunedeki protein konsantrasyonlarını ölçün.</li>
	<li>Her bir kuyucukta floresan değeri / protein konsantrasyonu kullanarak hücre içi FD-glikoz seviyelerini normalleştirin. Hücre dışı FD-glukoz tükenmesi normalizasyon gerektirmez.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, ek normalleştirme (%100) için denetim örneklerinde ortalama taban çizgisi değerlerini kullanın.</li>
</ol>8. Organlarda hücre dışı FD glukoz tükenmesinin ex-vivo ölçümü
<ol><li>Farelere, organ diseksiyonundan önce glikoz metabolizmasını uyaran bileşiklerle aşağıdaki gibi ön işlemden geçirin.</li>
	<li>Dokuz haftalık Lepob erkek fareleri kullanın (n = 11). Deneyden önce tüm fareleri düzenli bir chow diyetiyle besleyin.</li>
	<li>İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonlar için fareleri rastgele üç gruba ayırın.<ol><li>Kontrol Lepob grubundan farelere 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).</li>
		<li>İnsülin Lepob grubundaki farelere, vücut ağırlığının gramı (BW) başına 12 IU insan insülini içeren 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 3).</li>
		<li>AAC2 Lepob grubundaki farelere, gram vücut ağırlığı (BW) başına 0,1 nmol AAC2 içeren 0,1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).</li>
	</ol></li>
	<li>15 dakika sonra, fareleri% 5 izofluran inhalasyonuna maruz bırakın ve anestezi uygulanan hayvanlardan kardiyak ponksiyon yoluyla kanı ekssanguinatedin 26.</li>
	<li>Her hayvandan viseral epididim beyaz yağ dokusunu (200 mg), karaciğeri (200 mg) ve tüm beyni disseke edin. Doku taşıma için Sınıf II biyogüvenlik başlığı kullanın.</li>
	<li>FD-glukoz (0.29 mM) çalışma solüsyonunu glikozsuz DMEM'de ışıksız bir Sınıf II Biyogüvenlik kabininde hazırlayın.</li>
	<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, FD-glikoz çalışma çözeltisinin (0.29 mM) sırasıyla 485 ve 535 nm emisyon dalga boylarında floresansını ölçün.</li>
	<li>Hasat edilen dokuları/organları PBS içeren 6 delikli bir plakada 1 dakika boyunca inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun.</li>
	<li>1 dakika sonra, PBS'yi emmek için her bir mendili steril bir kağıt havluya yerleştirin. Dokuları/organları 4.000 μL glikozsuz DMEM içeren ayrı bir 6 delikli plakaya aktarın ve 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>2 dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 mM FD-glikoz çalışma çözeltisi (1 mL / kuyu) içeren 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına aktarın. FD-glikoz çalışma çözeltisindeki dokuları içeren 6 delikli plakaları 37 ° C'de (% 5 CO2 ve% 95 nem) inkübe edin.</li>
	<li>Hücre dışı FD glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her bir kuyucuktan 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisi toplayın. Toplamadan önce ve sonra sallayın.</li>
	<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm uyarma ve emisyon dalga boylarındaki floresanı ölçmek için 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisini 96 delikli plakalara aktarın.</li>
	<li>Floresansı, her hayvandaki her organ için 0 dakikalık değere (%100) normalleştirin (Şekil 3).</li>
</ol>

<ol><li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19%3F+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolic+Syndrome%3A+Clinical+Research+%26+Review%22%5BJournal%5D)">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556(2021).</li>
<li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of%3A+%282S%2C4R%29-4-%5B%2818%29F%5DFluoroglutamine%2C+%5B%2811%29C%5DMethionine%2C+and+2-Deoxy-2-%5B%2818%29F%5DFluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET%2FCT+systems+imaging+rat+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358(2021).</li>
<li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li>
<li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia%3A+Implications+for+function%2C+growth%2C+and+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959(2020).</li>
<li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574(2021).</li>
<li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications%3A+The+signals+at+the+intersection+of+exercise%2C+glucose+uptake%2C+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+report+on+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li>
<li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental%2Flifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131(2017).</li>
<li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275(2020).</li>
<li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE%3A+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li>
<li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes%3A+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li>
<li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+signatures+underlying+inflammation%3A+an+interplay+of+nutrition%2C+physical+activity%2C+metabolic+diseases%2C+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218(2021).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839(2020).</li>
<li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li>
<li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+%28glucose+transporter+1%29+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117(2020).</li>
<li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697(2020).</li>
<li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li>
<li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+PET+imaging+with+%5B%2818%29F%5DFDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li>
<li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li>
<li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266(2007).</li>
<li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat%2C+decreases+resistin%2C+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198(2016).</li>
<li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li>
<li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).</li>
<li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li>
<li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li>
<li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET%2FCT+in+normal+organs%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140(2018).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosahexaenoic+acid%2C+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li>
<li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li>
<li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+adaptation+by+Na%28%2B%29-dependent+transporters+and+ACE2%3A+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460(2020).</li>
<li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification%3A+comparison+with+other+cell+quantification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515(2021).</li>
<li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+clamp+technique%3A+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir sorunu yoktur ve çıkar çatışması yoktur.

Hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin hücre kültüründe normalize hücre içi glukoz alımı ile doğrudan karşılaştırılması, hücre dışı glikoz tükenmesinin glikoz alım değerlendirmesi için vekil bir ölçüm olabileceğini düşündüren yüksek bir korelasyon göstermiştir. Hücre dışı FD-glukoz ölçümü çok çeşitli FD glukoz konsantrasyonlarını kullanabilir, ayrıca 0.5-2.5 μg FD-glukoz / mL'nin optimal aralığı sağladığı görülmektedir. Hücre dışı FD-glukoz, hücre içi FD-glukoz alımı için gerekli hücre sayısına veya protein konsantrasyonların...

Glikoz alımını ölçme talebi, glikoz metabolizmasına bağlı çok sayıda hastalıkta salgın bir artışı ele alma konusundaki kritik ihtiyaçla birlikte artmaktadır. Dejeneratif metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmalar, nörolojik ve bilişsel bozukluklar1, enflamatuar2 ve bulaşıcı hastalıklar3, kanser 4,5 ve yaşlanma6, enerji ve depolanması için glikoz metabolizmasına, anabolik süreçlere, proteine ve gen modifikasyonuna, sinyalleşmeye, genlerin düzenlenmesine ve nükleik asitlerin sentezi ve replikasyonuna bağlıdır 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM), glukoz alım regülasyonunun arızalanması ile doğrudan ilişkilidir. DM, tip-1, -2 ve -3 diabetes mellitus, gestasyonel diyabet, gençlerin olgunluk başlangıçlı diyabeti ve bu hastalığın çevresel ve / veya genetik faktörlerin neden olduğu diğer türleri gibi kronik hastalıkların bir spektrumudur. 2016 yılında, diyabetle ilgili ilk DSÖ Küresel raporu, en yaygın DM ile yaşayan yetişkinlerin sayısının 1980'den bu yana neredeyse dört katına çıkarak 422 milyon yetişkine10 ulaştığını ve bu DM hastalarının sayısının son birkaç on yıldır katlanarak arttığını göstermiştir. Sadece 2019 yılında, 1,5 milyon ölüm tahmini doğrudan DM10'dan kaynaklandı. Bu dramatik yükseliş, tip-2 DM'deki artıştan ve aşırı kilolu ve obezite 10 dahil olmak üzere onu yönlendiren koşullardankaynaklanmaktadır. COVID-19 pandemisi, DM'li hastalarda mortalitede genel popülasyona kıyasla iki kat artış olduğunu ortaya koymuştur ve bu da glukoz metabolizmasının immün savunmadaki derin ancak tam olarak anlaşılmamış rolünü düşündürmektedir3. DM, obezite ve diğer hastalıkların önlenmesi, erken teşhisi ve tedavisi, farklı dokular tarafından glikoz alımının ölçümlerinin optimizasyonunu ve glukoz alımını etkileyen çevresel 11, beslenme 12, endokrin13, genetik14 ve epigenetik 15 faktörün tanımlanmasını gerektirir.
Araştırmada, hücre içi ve / veya doku glukoz alımı genellikle floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) in vitro 16,17,18 ve in vivo19 ile ölçülür. FD-glukoz, radyoaktif olarak etiketlenmiş glukoz 20, analitik kütle spektroskopisi analizi 21, metabolomik 22, nükleer manyetik rezonans yöntemleri23 ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)5,24 kullanılarak daha hassas yöntemlere kıyasla tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. FD-glikoz alımından farklı olarak, daha fazla biyolojik materyal gerektiren analitik yöntemler, çok adımlı bir numune hazırlama, pahalı aletler ve karmaşık veri analizini içerebilir. Hücre kültürlerinde FD-glikoz alımının etkili ve ucuz ölçümleri, kavram kanıtı deneylerinde kullanılmıştır ve diğer yöntemlerle doğrulama gerektirebilir.
Glukoz alım çalışmaları için FD-glukoz uygulamasının temeli, endojen glukoz25'e kıyasla FD-glukoz metabolizmasının azalmasıdır. Bununla birlikte, hem endojen glikoz hem de FD-glikoz, anabolik, katabolik ve sinyal süreçlerinde kullanılmak üzere tüm hücresel bölmeler arasında dinamik olarak dağıtılır. FD-glikozun bölümlendirilmesi ve zamana bağlı işlenmesi25 , floresan ölçümlerine müdahale eder ve bu tahlilin yüksek verimli tarama deneyleri, kinetik analiz, 3D hücre kültürü, ko-kültürler ve doku eksplant deneylerinde kullanımı için ana sınırlayıcı faktörleri temsil eder. Burada, FD-glukozun hücre dışı tükenmesi ile hücre içi alımı arasında yüksek bir korelasyon olduğunu gösteren veriler sunuyoruz, bu da FD-glukozun hücre içi glikoz alımı için vekil bir ölçüm olarak hücre dışı tükenmesini düşündürmektedir. Glikozun hücre dışı tükenmesinin ölçümü, insülin ile tedavi edilen farelerde glikoz alımındaki dokuya özgü farklılıkları doğrulamak için ve bu yöntemin bir ilke kanıtı sağlamak için deneysel bir ilaç18 uygulanmıştır.
Mevcut protokol, 3T3-L1 hücrelerinde FD-glukoz alımının hücre içi ve hücre dışı (Şekil 1) ölçümlerini tanımlamaktadır. Protokol bölümleri 1-7, 48 saat boyunca hücrelerin kültürünü ve büyümesini açıklar; hücre açlığı, stimülasyon ve temel hücre dışı ölçümler; ve hücre dışı FD-glukozun stimülasyon sonrası ölçümleri ve FD-glukoz ve proteinin hücre içi ölçümleri. Protokol bölüm 8, başka bir yerde tarif edilen insülin ve amino asit bileşiği 2'nin (AAC2) varlığı ve yokluğunda ob / ob farelerinden diseke edilen dokularda FD-glukozun hücre dışı alımının ex vivo ölçümünü açıklamaktadır18.

<table><tbody><tr><td>3T3-L1 fare fibroblastları</td><td>ATCC</td><td>CL-173</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Falcon</td><td>353227</td><td>Plastik eşya</td></tr><tr><td>B6. V-Lepob/J erkek fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>stok numarası 000632</td><td>Fareler</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 modüler çok modlu mikroplaka okuyucu (Fisher Scientific, ABD)</td><td>Fisher Scientific, ABD</td><td>&nbsp; B-SHT</td><td>Cihazı</td></tr><tr><td>Sığır serumu</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>161790-060</td><td>Hücre kültürü Buzağı</td></tr><tr><td>serumu</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>26010-066</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Hücre inkübatörü</td><td>Forma</td><td>Seri II Su Ceketi</td><td>Cihazı</td></tr><tr><td>Diyeti (fare/sıçan diyeti, ışınlanmış)</td><td>Envigo</td><td>Teklad LM-485</td><td>Diyet</td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma LifeScience</td><td>D2650-100mL</td><td>Reaktifi</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp; 11965-092</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500mL</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Floresan 2-deoksi-2 - [(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] -D-glikoz)</td> <td>Sigma</td><td>72987-1MG</td><td>Test</td></tr><tr><td>Glikoz içermeyen ve fenol kırmızısı içermeyen DMEM</td><td>Gibco / ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>İnsan insülini 10 mg / mL</td><td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td><td>Cat N 91077C</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>İzofluran, %5</td> <td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Anestaetik</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin (P / S)</td> <td>Gibco / ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DA537-500 mL</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Pierce bikinkoninik asit (BCA) protein testi</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat N23225</td><td>Testi</td></tr><tr><td>Radyoimmünopresipitasyon testi lizis tamponu</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>Test Tripsin-EDTA (% 0.05)</td> <td>Gibco / ThermoFisher</td> <td>ve nbsp; 25300-054</td><td>Hücre kültürü</td></tr></tbody></table>

ex vivo'da hücrelerde ve dokularda glikoz alımının dolaylı bir Ölçüsü olarak hücre dışı glikoz tükenmesi

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Dünya çapında devam eden diyabet salgını, glikoz alımını etkileyen çevresel, beslenme, endokrin, genetik ve epigenetik faktörlerin tanımlanmasına olan talebi artırmaktadır. Hücre içi floresan ölçümü, in vitro hücrelerde floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) alımını test etmek veya glikoz tüketen dokuları in vivo olarak görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlil, seçilen bir zaman noktasında glikoz alımını değerlendirir. Hücre içi analiz, FD-glikoz metabolizmasının, katabolik ve anabolik reaksiyonlara ve sinyalleşmeye katılan endojen glikozunkinden daha yavaş olduğunu varsayar. Bununla birlikte, dinamik glikoz metabolizması, farklı faktörlere yanıt olarak glikoz alımının kinetik ölçümlerini gerektiren alım mekanizmalarını da değiştirir. Bu makalede, hücre dışı FD-glukoz tükenmesini ölçmek için bir yöntem açıklanmakta ve hücre ve dokularda hücre içi FD-glukoz alımı ile korelasyonunu ex vivo olarak doğrulamaktadır. Hücre dışı glikoz tükenmesi, yüksek verimli kinetik ve doza bağımlı çalışmaların yanı sıra glisemik aktiviteye sahip bileşikleri ve dokuya özgü etkilerini tanımlamak için potansiyel olarak uygulanabilir.

İnsülin stimülasyonu olan ve olmayan farklı FD-glukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 3T3-L1 preadipositlerde hücre içi alım ve hücre dışı glukoz tükenmesi ölçüldü (Şekil 2). Şekil 2A , insülin varlığında önemli ölçüde artmış olan FD-glukozun hücre içi alımında doza bağlı bir artış göstermektedir. Aynı hücrelerde hücre dışı FD-glukozdaki eşzamanlı azalma, insülin stimülasyonunun insülin stimülasyonu olmayan örneklere kıyasla hücre dışı FD-glikoz seviyelerinin ö...

Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Glikoz alımı, sağlığı ve hastalığı anlamanın anahtarıdır. Glikoz, insan vücudundaki metabolik ve yapısal taleplerde çok önemli bir rol oynadığından, aynı zamanda düzenlemede hayati bir rol oynamaktadır. Glikozun hücre dışı ölçümü, besin maddelerine veya ilaçlara yanıt olarak farklı genetik geçmişe sahip hücrelerde, dokularda ve organlarda glikoz alımının kinetiği için yüksek verimli testlerin geliştirilmesine izin verir.Bu tahlil, diyabet, kanser, merkezi sinir sisteminin dejeneratif hastalıkları, obezite ve tüm glikoz ve metabolizma hastalıkları için terapötiklerin ve beslenmenin keşfi için değerli bir araç olacaktır. Tahlil, farklı dokular ve hücre kültürleri için metabolik özelliklere dayanması gereken açlık ve stimülasyon için zamanın ayarlanmasına ihtiyaç duyar. Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, 10'u 6 hücreye kaplayarak 296 kuyu plakasında 20 mililitre orta 1'de seyreltilir.Plaka kuyu başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu, bu süspansiyonun homojenliğini karıştırmak suretiyle korunmasını sağlar. 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 48 saat boyunca hücreleri, yaklaşık% 70 ila% 80 akıcıya kadar ortam değiştirmeden büyütün. Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyer

extracellular-glucose-depletion-as-an-indirect-measure-glucose-uptake

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, hücre içi glikoz alımını dolaylı olarak ölçmek için bir in vitro testi göstermektedir. Test, hücre dışı glikoz tükenmesi ile hücre içi glikoz alımı arasında bir korelasyon kurmak için floresan etiketli bir glikoz analoğu kullanır.

İn Vitro Glikoz Tükenme Testi: Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi Ölçümü Yoluyla Hücresel Glikoz Alımını Ölçmek İçin Floresan Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, hasat edilmiş fare organlarında hücre dışı glikoz analog tükenmesini ölçmek için ex vivo bir teknik gösteriyoruz. Fare dokusunun, hücreler tarafından alınan floresan etiketli deoksiglukoz içeren bir çözelti içinde inkübe edilmesini içerir. Glikoz analog alımı, inkübe edilmiş ortamın floresansının ölçülmesiyle dolaylı olarak belirlenebilir.

Hücre Dışı Floresan Glikoz Analog Tükenmesinin Ölçümü: Ex vivo Fare Organlarında Glikoz Alımını Değerlendirmek İçin Vekil Bir Ölçüm Tekniği

Burada in vitro glikojen titrasyonu için bir doğru, tekrarlanabilir ve uygun biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik Abcam Glikojen deney kiti kullanır ve floresan ile titrasyon glikoz ve glikoz glikojen ardışık hidrolizi dayanmaktadır.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Monositler, aktive edildiğinde glikolitik metabolizmaya dayanan insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bileşenleridir. Taze tam kandaki toplam monositler ve monosit alt popülasyonları tarafından glikoz taşıyıcı ekspresyonunu ve glikoz alımını ölçmek için bir akış sitometrisi protokolü tanımladık.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Bu çalışma, 18F-FDG'nin dokulara in vivo, gerçek zamanlı alımını ölçmek için kinetik modelleme ile birlikte 18F-FDG ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT) görüntülemeyi kullanan bir protokolü açıklamaktadır.

Kullanımı Glukoz Metabolizma Kinetiği Belirlenmesi<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Mikro PET / BT

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt<em&gt; In vitro</em&gt; Kültürlü İnsan Primer Miyotları

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) proteinopatisi tarafından etkilenen Drosophila motor nöronlarında, FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış bir glikoz sensörü tarafından belirtildiği gibi glikoz alımı artar.

TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Adipositlerde trigliserit lipoliz, serbest yağ asitlerinin ve gliserolün serbest bırakılmasıyla sonuçlanan önemli bir metabolik süreçtir. Burada, adipositlerde bazal ve uyarılmış lipolizi ve farelerden ex vivo yağ dokusunu ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Endotel hücreleri, nöronlar ve glial hücreler dahil olmak üzere retinadaki çoklu hücre tipleri, hücrelere glikoz alımını sağlamak için glikoz taşıyıcılarını (GLUT'lar) eksprese eder. Ex vivo fare nöral retinası ve floresan glukoz analogu 6-NBDG'yi kullanarak, tüm fare retinasındaki glukoz alımını ölçmek için nispeten hızlı ve ucuz bir yöntem tarif ediyoruz.

Bozulmamış Murin Nöral Retinasında Glikoz Analogu, 6-(N-(7-Nitrobenz-2-Oksa-1,3-Diazol-4-il)Amino)-6-Deoksiglukozun Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, hücre dışı glikoz tükenmesi yöntemiyle 3T3-L1 fare fibroblastlarında yüksek verimli glikoz alımı ölçümü yapmayı. Bu teknik diyabet, kanser ve metabolik hastalıklar için terapötik keşiflere olanak tanır.

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

Daha fazla video keşfet