Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi
5 Mayıs 2022
Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.
Bu protokol, sınırlı sayıda mitokondri içeren küçük bir dokuda zorlu bir prosedür olan izole mitokondrinin parselasyonu ile sinir içindeki mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine izin verir. Bu teknik, oksijen tüketimi ve ROS üretimi gibi mitokondri fonksiyonlarını aynı anda korunmuş bir mitokondri in situ içinde analiz etme imkanı sağlar. Çoklu substratlar, inhibitörler ve uncoupler tasarım protokolleri ile.
Bazı hastalıklar mitokondriyal fonksiyonu, özellikle de tip iki diyabet veya kemoterapinin neden olduğu nöropatileri paylaşır. Bu hastalıklarda, mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun bozulması, hastalık gelişimini belirleyen tek işarettir. Bu yöntem, mitokondriyal hastalık mekanizmalarının araştırılması, mitokondriyal güçlendiriciler veya iyileştirilmiş nöropatik ağrı gibi tedavilerin araştırılması ile nörobiyoloji, biyokimya ve farmakoloji hakkında fikir verir.
Başlamak için, her bir odaya 2,1 mililitre MR tamponu pipetleyerek oksijen sensörlerini kalibre edin. Tapalarla kapatın ve bir kabarcık oluşana kadar odaya hava çekin. Kütle başına oksijen akışı stabilize olana kadar kalibrasyon modunda bir saat boyunca 37 santigrat derecede karıştırın.
HRR yazılımını kullanarak, üreticinin talimatlarına göre polarografik oksijen sensörlerinin hava kalibrasyonunu gerçekleştirin. Doku hazırlığı için, siyatik siniri, onu örtmek için yeterli TP tamponuna sahip bir Petri kabına yerleştirin. Forseps ile sinirin bir ucunu tutun ve başka bir çift forseps ile sinir demetlerini yatay olarak çekin.
İlk olarak, görüntülenen dokuyu doku geçirgenliği için bir mililitre TP tamponu içeren küçük bir kaba aktarın. Permeabilizasyonu başlatmak için, forsepsli dokuyu, mililitre saponin başına 50 mikrogram içeren, bir mililitre TP tamponu içeren başka bir kaba aktarın. Plakayı bir mikro plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın.
Daha sonra, forseps içeren dokuyu bir mililitre MR tamponu içeren taze bir kaba aktarın ve 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Forseps ile dokuyu kalibre edilmiş bir HRR odasına aktarın. HRR odalarını 2,1 mililitre MR tamponu ile doldurun.
Amplex Red ve peroksidaz'ı sırasıyla beş mikromolar ve mililitre başına iki birim nihai konsantrasyonuna ekleyin. Ardından, geçirgen siyatik siniri ekleyin. Cihazın floresan sensörlerini takın.
Ardından, yazılımın kontrol bölümündeki ışıkları kapatın ve yazılımdaki oksigrafa bağlan'a tıklayın "Protokolleri düzenlemeye git" ve doku ağırlığını ekleyin. Mizanpaja gidin ve birim numune başına belirli akıyı seçin" seçeneği. Ardından, oksijen tüketimi okumasına ve gerekirse hidrojen peroksit üretimine aynı anda erişmek için grafikleri seçin.
Yaklaşık 10 dakika bekleyin. Odanın kalibrasyonu için her biri 260 mikromolar'lık son konsantrasyona iki hidrojen peroksit darbesi enjekte edin. Mitokondriyal elektron taşıma sistemini aktive etmek için bir mitokondriyal kompleks II substratı olan 20 mikrolitre süksinat enjekte edin.
ATP sentezini aktive etmek için 20 mikrolitre ADP ekleyin. Sırayla, membran bütünlüğünün bir göstergesi olarak beş mikrolitre sitokrom c ekleyin. Oksijen tüketiminde daha fazla azalma gözlenene kadar mililitre oligomisin başına 0.2 mikrogram alikotlarla titre edin.
Litre başına 0.5 mikromol alikotlu titre edici FCCP, mitokondriyal uncoupler, oksijen tüketiminde daha fazla artış gözlenmeyene kadar. Deneyi bitirmek için iki mikrolitre antimisin A enjekte edin, beş milimolar son konsantrasyonda yapın ve akışın stabilize olmasını bekleyin. Komut çubuğuna gidin.
Yazılımda "multisensory" araması yapın. Kontrol'e tıklayın", ardından dosyayı kaydet" e basın ve bağlantıyı kesin. Kaydedilen dosyayı açın ve deneysel oksijen tüketimi sonuçlarını elde etmek için kütle tepsileri başına oksijen akışını seçin.
Shift artı farenin sol düğmesine basarak enjeksiyonlar arasındaki pencereyi manuel olarak seçin. İşaretlere gidin ve her substrat, inhibitör ve uncoupler protokolü enjeksiyonunun sonuçlarını görselleştirmek için istatistikleri seçin. Hidrojen peroksit üretimi için amplifikatör eğim izi ile aynı prosedürü uygulayın.
ATP sitaz aktivitesi tarafından teşvik edilen membran potansiyelindeki azalma, oksijen tüketimini hızlandırdı. Eksojen sitokrom C'nin eklenmesi, solunumun sadece minimal uyarılmasını teşvik etti ve bu preparat için mitokondriyal dış membran bütünlüğünü onayladı. Mutlak oksijen akışları kaydedildi ve solunumda sadece% 6.3'lük bir artış gözlendi, bu da doku preparatının kalitesini gösterdi.
Oksijen tüketimi ve ROS üretimi, elektron taşıma sistemi için yakıt sağlayan farklı substratların varlığında aynı anda ölçüldü. Mitokondriyal kompleks için piruvat ve malat ilavesi solunumu arttırdı. Ve kompleks II için süksinat ilavesi de oksijen tüketimini arttırır.
Bu nedenle diğer substratlar test edilebilir. ROS üretimi de arttı ve elektron taşıma sisteminden oksijen sızıntısını gösterdi. Doygunluk konsantrasyonuna adenozin difosfat ilavesi, ATP oluşumunu tetikleyen oksijen tüketimini arttırdı ve ROS üretimini azalttı.
Buna karşılık, oligo titrasyonu oksijen tüketimini azalttı ve ROS üretimini artırdı. Bu, permeablize siyatik sinirin mitokondriyal fizyolojideki standart ilişkiyi kopyalayabileceğini düşündürmektedir. Beklenen oksijen akısı değişiklikleriyle uyumlu FCCP ve retinon ilavesi, mitokondriyal fizyolojinin ve biyoenerjetik profilin geçirgen siyatik sinirde korunduğunu doğrulamaktadır.
En önemli adım, doku bölümünü nazikçe hazırlamak, tüm oda açıklıklarının uygun şekilde temizlendiğinden emin olmaktır. Mitokondri fonksiyonundaki değişiklikler, işlev bozukluğuna veya daha düşük bir mitokondriyal sayıya bağlı olabilir. bu nedenle belirtilen sentaz aktivitesi ve PCR ile mitokondriyal DNA içeriği doğrulaması önerilmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, mevcut sayılarının sınırlı olması nedeniyle zorlu bir görev olan mitokondri yalıtımı yoluyla sinir dokularında mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanır. Aynı anda mitokondriyal oksijen tüketiminin ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminin in situ analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Farmakoloji
Arka Plan
- Mitokondri fonksiyonu hücre sağlığı için kritik öneme sahiptir.
- Tip iki diyabet veya kemoterapiden kaynaklananlar gibi nöropatilerin çoğu, mitokondriyal işlev bozukluğunu içerir.
- Oksidatif fosforilasyondaki bozulmalar hastalık ilerlemesini belirleyebilir.
- Mitokondri mekanizmalarının anlaşılması potansiyel tedavilere yol açabilir.
Çalışmanın Amacı
- Sinir dokularında mitokondriyal solunum oranlarını değerlendirmek.
- Geçirgenleştirilmiş siyatik sinirlerde ROS üretimini ölçmek.
- Mitokondriyel hastalık mekanizmalarını ve potansiyel tedavileri araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Floresan sensörlerle eşleştirilmiş yüksek çözünürlüklü respirometri.
- Birden fazla substrat, inhibitör ve çiftlerin kullanılması.
- Sinir dokularında mitokondri yalıtımı.
- Oksijen tüketimi ve ROS üretiminin eşzamanlı ölçümü.
Ana Sonuçlar
- Sinir dokularında mitokondriyal fonksiyonun başarılı bir şekilde değerlendirilmesi.
- Oksijen ve ROS seviyelerinin eşzamanlı ölçümünün gösterilmesi.
- Nöropatilerde mitokondriyal işlev bozukluğunun rolüne dair görüşler.
- Mitokondri sağlığına yönelik terapiler geliştirme potansiyeli.
Sonuçlar
- Bu yöntem, sinir dokularında mitokondriyal fonksiyonu incelemek için değerli bir araç sağlar.
- Nörobiyoloji ve hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecek araştırmaları, mitokondriyal ilgili hastalıklar için terapötik müdahalelere odaklanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-resolution respirometry in permeabilized sciatic nerve enables direct, quantitative assessment of mitochondrial function in small, disease-relevant peripheral nerve samples. This approach addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuropathy-related drug development by providing simultaneous measurement of oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) production. The method supports predictive confidence in mitochondrial dysfunction as a mechanistic driver of neuropathies, informing portfolio triage and therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial respiratory states and ROS generation in intact nerve tissue.
- Supports mechanistic de-risking for neuropathy targets by quantifying mitochondrial dysfunction.
- Facilitates functional target validation through substrate and inhibitor response profiling.
- Provides predictive confidence for mitochondrial involvement in disease progression.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for mitochondrial function in peripheral nerves.
- Delivers standardized readouts for oxygen consumption and ROS production across conditions.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening targeting mitochondrial pathways.
- Enables reliable evaluation of mitochondrial modulators in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with neuropathy disease models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mitochondrial-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mitochondrial metrics.
- Enhances predictive de-risking for therapies addressing mitochondrial dysfunction in neuropathies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct mitochondrial function assessment in peripheral nerve models, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiratory states and ROS output to clarify disease mechanisms.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative oxygen consumption and ROS measurements for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical neuropathy models with functional mitochondrial endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mitochondrial assessment across neuropathy research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuropathy target validation.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial function assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mitochondrial data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted assets in neuropathy pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-resolution respirometry and peripheral nerve handling.
- Needs specialized instrumentation for simultaneous oxygen and ROS detection.
- Demands rigorous cross-team standardization of tissue preparation and assay protocols.
- May require adaptation for different nerve types or disease models.
- Sample size and mitochondrial content limitations must be considered for data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:19
Calibration of Polarographic Oxygen Sensors for High-Resolution Respirometry (HRR)
1:56
Dissection and Permeabilization of the Sciatic Nerve
2:58
Oxygen Consumption and Reactive Oxygen Species (ROS) Production Determination
5:51
Results: Assessing the Mitochondrial Oxygen Consumption by the Permeabilized Sciatic Nerve
7:41
Conclusion
