Name: In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Öğrenin, zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek mRNA ve protein ekspresyonunu aynı anda görüntülemeyi. Bu yöntem, gelişim nörobilimi araştırmalarında gen etkileşimlerini kapsamlı şekilde incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (MS12019011), Çin Nantong Bilim ve Teknoloji Vakfı (JC2021058) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumları Doğa Bilimleri Vakfı (21KJB180009) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan protokolleri Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (No. S20191210-402).
1. Zebra balığı embriyolarının toplanması
<ol><li>Yumurtaların toplanmasından önceki gece üreme tanklarında bir çift zebra balığı kurun, biri transgenik zebra balığı ve diğeri AB vahşi tip zebra balığı (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB vahşi tip veya Tg (hb9: egfp) X AB vahşi tipi) (Malzeme Tablosuna bakınız). Fiziksel erişimi engellemek için erkek ve dişiyi ayırmak için çapraz bir plastik bölücü kullanın. Ertesi gün, üreme tankının üst kısmını tatlı suyla dolu temiz bir alt kısma yerleştirin ve üreme tankının bölücüsünü çıkarın. Balıkların 10-20 dakika çiftleşmesine izin verin ve üreme tankının dibine battıktan sonra yumurtaları toplayın.</li>
	<li>28.5 °C'de metilen mavisi (1 L E3 embriyo ortamında 1 mL% 0.05 metilen mavisi) içeren E3 embriyo ortamındaki embriyoları kültürleyin ( Materyaller Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Pigment oluşumunu önlemek için embriyoları döllenmeden (hpf) 24 saat sonra feniltiyoüre (PTU, Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin. NOT: Deneylerde her iki cinsiyetten hayvanlar kullanılır.</li>
</ol>2. In situ hibridizasyon
NOT: Adım 2.1-2.11 için kullanılan su, dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış sudur ( Malzemeler Tablosuna bakınız).
<ol><li>0.5-1 mL taze% 4 paraformaldehit (PFA, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren ~ 10 embriyoyu, 12-14 saat boyunca gece boyunca 4 ° C'de 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde sabitleyin. NOT: In situ hibridizasyon protokolü daha önce yayınlanmış literatür12'den biraz değiştirilmiştir. PFA, kullanımdan sonraki bir hafta içinde 4 ° C'de veya -20 ° C'de bir ay boyunca taze olarak hazırlanmalı ve saklanmalıdır. İn situ hibridizasyonda aşağıdaki tüm adımlar 1.5 mL mikrofüj tüpler kullanılarak gerçekleştirildi.</li>
	<li>Sadece 48 hpf'den eski embriyoların derisini çıkarmak için cımbız kullanın. NOT: RNA problarının 48 hpf'den eski embriyoların gövde bölgesine nüfuz etmesini kolaylaştırmak için deri çıkarılır.</li>
	<li>Embriyoları, oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca% 0.1 Ara-20 içeren 1x fosfat tamponlu salin içinde% 25,% 50 ve% 75 metanol ile yıkayarak kademeli olarak dehidrate edin (PBST, Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, embriyoları oda sıcaklığında% 100 metanol içinde 5 dakika yıkayın. Embriyoları -20 ° C'de% 100 metanol içinde en az 12-14 saat boyunca en az bir gece boyunca inkübe edin. NOT: Susuz bırakılan embriyolar 6 ay boyunca -20 °C'de %100 metanol içinde saklanabilir.</li>
	<li>PBST'de her biri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca art arda %75, %50 ve %25 metanol ile yıkayarak embriyoları kademeli olarak yeniden sulandırın. Embriyoyu PBST ile üç kez oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>Embriyoları PBST'de oda sıcaklığında 10 μg / mL proteinaz K ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile sindirin (bakınız Tablo 1).</li>
	<li>Embriyoları PBST ile 5 dakika yıkayın. Bu yıkama adımını üç kez gerçekleştirin.</li>
	<li>Yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA'da sabitleyin. NOT: Bu adım sindirimi durdurur, çünkü PFA proteinaz K'yı inaktive eder. Tüpler, embriyoları çözelti içinde eşit olarak dağıtmak için yanlarına yerleştirilebilir. Bu PFA'nın taze olması gerekmez (2 haftaya kadar soğutulabilir).</li>
	<li>Embriyoyu PBST ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Prehibridizasyon çözeltisi (preHYB, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe ederek embriyoların prehibridizasyonunu gerçekleştirin. PreHYB'yi hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin (HYB, Malzeme Tablosuna bakın) ve HYB'de en az 4 saat prehibridize edin. NOT: Prehibridizasyona geçmeden önce, çözeltileri önceden 65 ° C'ye ısıtın. Formamid ( Malzeme Tablosuna bakınız) dokunun şeklini ve yapısını korumak için kullanılır. Formamid ayrıca homolog olmayan parçaların düşük sıcaklıklarda bağlanmasını önler.</li>
	<li>Probu (Insm1a veya 5-HT2C) embriyolara eklemeden önce 95 ° C'de 5 dakika boyunca HYB'de ısıtın. Probu 1 μg/mL HYB'de kullanın. Embriyoların hava ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla preHYB çıkarın ve embriyoları içeren tüpe HYB'de önceden ısıtılmış prob ekleyin. NOT: Embriyolarda hedef mRNA dizisi ile hibridize etmek için etiketli bir RNA probu kullanılabilir. Bu nedenle, prob, ilgilenilen bir genin ekspresyonunu ve mRNA'nın yerini tespit etmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Probun gece boyunca (12-14 saat) 50-70 ° C'de melezleşmesine izin verin. NOT: Hibridizasyon sıcaklığı farklı problar için farklılık gösterir.</li>
	<li>Ertesi gün, prob çözeltisini bir pipetle aspire edin ve -20 ° C'de bir tüpte saklayın, böylece birçok kez tekrar kullanılabilir.</li>
	<li>Embriyoları aşağıdaki gibi yıkayın:<ol><li>Embriyoları 65 °C'de %100 HYB ile 15 dakika yıkayın.</li>
		<li>Embriyoları, her biri 65 ° C'de 15 dakika boyunca% 0.1 Ara-20 (SSCT, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren 2x standart salin sitrat içinde% 75,% 50 ve% 25 HYB ile sırayla yıkayın.</li>
		<li>Embriyoları 65 ° C'de 2x SSCT'de 15 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Embriyoları 65 ° C'de 0.2x SSCT'de 15 dakika boyunca yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyoları oda sıcaklığında% 0.02 Tween-20 (MABT, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren maleik asit tamponunda 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>Hibridize edilmiş ve yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca %2 bloke edici çözelti-1 ile bloke edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Blokaj çözeltisi-1'i antidigoxigenin AP (1:4.000 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) ile %2'lik yeni bir bloke edici çözelti-1 içinde değiştirin ve 4 °C'de 12-14 saat boyunca gece boyunca çalkalayın.</li>
	<li>Embriyoları oda sıcaklığında MABT'de 30 dakika boyunca dört kez yıkayın. NOT: Üçüncü yıkama sırasında BM morunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) buzdolabından çıkarın ve sonraki yıkamalarda ara sıra çalkalayın.</li>
	<li>Embriyoları NTMT'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl,% 1 Ara-20, Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Embriyolardan mümkün olduğunca fazla NTMT'yi çıkarmak için bir pipet kullanın. BM mor AP substratı ile değiştirin ve embriyoları karanlıkta oda sıcaklığında boyayın. Boyama derecesini kontrol etmek için her 30 dakikada bir renk değişikliklerini izleyin. NOT: Özel boyama süresi farklıdır ve her bir proba göre ayarlanması gerekir. Embriyoların 37 ° C'de inkübe edilmesi reaksiyonu hızlandırabilir. Embriyoların 4 ° C'de inkübe edilmesi reaksiyon süresini artırabilir ve gece boyunca yapılabilir.</li>
	<li>İstenilen ölçüde geliştirildikten sonra, NTMT ile iki kez kısa bir süre durulayarak reaksiyonu durdurun. In situ hibridizasyondan sonra, embriyoları PBST ile 20 dakika boyunca üç kez durulayın.</li>
</ol>3. Gömme
<ol><li>Embriyoları, 4 ° C'de 12-14 saat boyunca gece boyunca% 5 sakkaroza 1x PBS'ye ( Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın.</li>
	<li>Embriyoları kapsayan çözeltiyi 1x PBS'de% 15 sakkaroz olarak değiştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Embriyoları kaplayan çözeltiyi 1x PBS'de% 30 sakkaroz olarak değiştirin ve 4 ° C'de 1-2 gün inkübe edin. NOT: Embriyolar tüpün dibine batana kadar bu çözeltide inkübe edin.</li>
	<li>Bir kriyomoldu optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamıyla doldurun ( Malzeme Tablosuna bakın). Embriyoları% 30 sakkaroz içinde OCT ortamı ile kriyomusta aktarın. Sakkarozu embriyolardan çıkarmak için onları karıştırın.</li>
	<li>Embriyoları doku için yeni bir kriyomusta aktarın ve kabarcık oluşumunu önleyerek OCT ortamıyla yavaşça doldurun.</li>
	<li>Her embriyoyu batırın, kriyomoldun dibine itin ve her embriyoyu istenen yöne (dorsal-ventral veya lateral) yerleştirin. Embriyoları düz bir çizgide tutun. NOT: Her kriyomold içine sadece bir embriyo yerleştirilmesi şiddetle tavsiye edilir ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Gömülü embriyoları kuru bir buz etanol banyosunda kriyomoldlara yerleştirin.</li>
	<li>-80 ° C'de en az bir gece boyunca 12-14 saat saklayın. NOT: Kriyomoldlar en az bir ay boyunca -80 °C'de tutulabilir.</li>
</ol>4. Kriyokesim
<ol><li>Bir kriyostat kullanarak kriyokesitleri -20 ° C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Numune bloğunu kriyomusttan çıkarın ve kriyostata yerleştirin. OCT ortamını soğutulmuş aynanın tabanına yerleştirin ve bloğu üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Numune bloğunun tıraş bıçağına paralel olduğundan emin olun. Numunenin etrafındaki fazla OCT ortamını dikkatlice kesin.</li>
	<li>Bir kriyostat kullanarak 12-20 μm kalınlığında kesitler halinde kesin. Her slaytta 3-4 bölüm olması için bölümleri hızlı bir şekilde cam slaytlara aktarın. Numunelerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve bölümleri daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de kapalı bir sürgü kutusunda saklayın.</li>
</ol>5. İmmün boyama
NOT: Kesitlerde GFP boyama işlemi yapılır.
<ol><li>Bölümleri içeren slaytları PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>Sitrat tamponunu mikrodalgada kaynatmak için ısıtın.</li>
	<li>Slaytları tampona yerleştirin ve çözeltiyi yaklaşık 20 dakika kaynamaya yakın tutmak için ısıtmaya devam edin. NOT: Bu adım antijen alımına yardımcı olur. Doku, yüksek sıcaklıklarda bile bozulmadan kalır, bu da dokuların katlanmasını, hasar görmesini veya ayrılmasını önleyerek lekelenme kalitesini artırır.</li>
	<li>Bir sonraki adımdan önce numunelerin yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Fazla çözeltiyi boşaltın, her bölümün etrafındaki alanı bir parça doku ile dikkatlice kurutun ve hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bölümün etrafına su itici bir kalemle ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir daire çizin. Doku bölümlerini kurutmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Slaytları PBS ile iki kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında blokaj çözeltisi-2'de 2 saat boyunca bloke edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Slayt başına pipet birincil antikor çözeltisi (fare monoklonal α-GFP, 1:250, Malzeme Tablosuna bakınız) ve slaytları gece boyunca 4 °C'de immünohistokimyasal ıslak bir kutuda inkübe edin.</li>
	<li>Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Fazla PBS'yi boşaltın. Slaytları PBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun ikincil antikorla (1:400, Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.</li>
	<li>Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama sırasında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Fazla PBS'yi boşaltın, montaj ortamını slaytın üzerine pipet edin ve bir sürgü kapak kayması ile monte edin.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+genomics+research+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li>
<li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018).</li>
<li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li>
<li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li>
<li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li>
<li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li>
<li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li>
<li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+5-HT%282C%29+receptors+regulate+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li>
<li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344(2019).</li>
<li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575(2020).</li>
<li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos+and+larvae+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Garbage+in%2C+garbage+out%3A+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu protokol, zebra balığı embriyoları üzerindeki kolokalizasyon deneylerinde önemli bir adım olan in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu önermektedir. Bu yöntem, bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve antikor boyama yapıldı. Daha önce14,15,16 yayınlanan çeşitli protokollerin aksine,</s...

Zebra balığı, gelişim ve genetik çalışmaları için güçlü bir omurgalı modelidir 1,2. Zebra balığı ve insanlar yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar (genlerin% 70'i insan genomu ile paylaşılır), bu da insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin verir3. Zebra balığında, iki genin ekspresyon kalıplarını ve mekansal ilişkilerini tespit etmek oldukça yaygındır. İmmünohistokimya ilk olarak 1941'de FITC etiketli antikorlar4 uygulayarak enfekte dokulardaki patojenleri tespit etmek için kullanılmıştır. Doku bölümündeki hedef protein ilk önce birincil bir antikor ile etiketlenir ve bölüm daha sonra birincil antikorun konakçı türü immünoglobuline karşı ikincil bir antikor ile etiketlenir. Antikor boyama, hücre içi düzeyde yüksek optik çözünürlük sunan proteinlerin lokalizasyonunu tespit etmek için sağlam bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, zebra balıklarında mevcut antikorların sayısı çok sınırlıdır. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, fareler için yaklaşık 112.000 antikorun ticari olarak mevcut olduğunu göstermektedir; Bununla birlikte, zebra balığı5'te çok az antikorun güvenilir olduğu gösterilmiştir.
Bunun yerine, zebra balıklarında, in situ hibridizasyon, gen ekspresyon paterni analizi için yaygın olarak uygulanmıştır. Bu yöntem ilk olarak 1980'lerde Drosophila embriyolarında gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır 6,7 ve o zamandan beri bu teknoloji sürekli olarak geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Başlangıçta, mRNA transkriptlerini tespit etmek için radyoaktif işaretli DNA probları kullanıldı; Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük nispeten düşüktü ve radyoaktivitenin neden olduğu potansiyel sağlık riskleri vardı. Daha sonra, in situ hibridizasyon, alkali fosfataza (AP) konjuge edilen veya floresan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) ile tespit edilen digoxigenin (DIG) veya floresein (Fluo) ile etiketlenmiş RNA problarına dayanır8,9. TSA, iki veya üç geni tespit etmek için kullanılmasına rağmen, RNA problarının DIG etiketlemesi ve antiDIG AP-konjuge antikor, in situ hibridizasyon için hala oldukça hassas, kararlı ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır. Bu nedenle, DIG etiketli in situ problarla birleştirilen ticarileştirilmiş antikorlar, protein lokalizasyonu ve bir genin ekspresyonu hakkında fikir vermek için yararlıdır.
Tam montajlı embriyolar, zebra balığı embriyoları küçük ve şeffaf10 olmasına rağmen, düşük optik çözünürlük nedeniyle genler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkaramazlar. Bu nedenle, hücre içi düzeyde genlerin ekspresyon kalıplarını analiz etmek için kesitleme gereklidir. Kriyoseksiyon, zebra balıklarında yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü gerçekleştirilmesi kolaydır ve antijeni etkili bir şekilde koruyabilir. Bu nedenle, zebra balığı kriyoseksiyonlarında immünohistokimya ile kombine edilen in situ hibridizasyon, iki genin ekspresyon modellerini analiz etmek için güçlü bir yol sunar. Zebra balığı11'e in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonu uygulanmıştır. Bununla birlikte, proteinaz K tedavisi, antijen bütünlüğü pahasına prob penetrasyonunu arttırmak için kullanılmıştır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu protokol antijen alımını indüklemek için ısıtma kullanır. Bu protokol sadece farklı aşamalardaki embriyolara ve çeşitli kalınlıklardaki doku kesitlerine (14 μm kafa bölümleri ve 20 μm omurilik bölümleri) uygulanamaz, aynı zamanda baş ve omurilik de dahil olmak üzere iki organda eksprese edilen genler kullanılarak doğrulanmıştır.
Bu makalede, zebra balığı embriyolarında kriyoseksiyonlarda in situ hibridizasyon ve antikor boyamanın nasıl birleştirileceği anlatılacaktır. Bu protokolün çok yönlülüğü, iki farklı nöron için in situ hibridizasyon probları da dahil olmak üzere bir dizi in situ hibridizasyon-immünohistokimya kombinasyonu kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntem, farklı bölgelerdeki mRNA ve proteini ve farklı yaşlardaki embriyoları ve ayrıca iki genin ekspresyon modellerini tespit etmek için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin AP Fab parçaları</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antikoru</td><td>Millipore</td><td>MAB3580</td><td></td></tr><tr><td>Bloke edici reaktif</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvarda yapılan</td><td>engelleme solüsyonu-1</td><td>Yok</td><td>Bloke edici reaktifi 1X MAB içinde %10'luk (ağırlık/hacim) bir nihai konsantrasyona çözün. Otoklav ve -20 & # 176'da saklayın; Kullanmadan önce C.</td></tr><tr><td>Laboratuvarda yapılan</td> <td>bloke edici çözelti-2</td><td>N/A</td><td>%0.1 Triton X-100, %3 BSA, 1x PBS BM'de %10 keçi serumu</td></tr><tr><td>mor</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat tamponu</td><td>Leagene</td><td>IH0305</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Doku için kriyokalıp, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>Kafa Biyoteknolojisi</td><td>H4566</td><td></td></tr><tr><td>DEPC ile Arıtılmış Su</td><td>Sangon Biotech</td><td>B501005</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera, floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>NI-SSR 931479</td><td></td></tr><tr><td>laboratuvarda yapılan</td><td>E3 embriyo ortamı</td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>J& Laboratuvarda yapılan K Scientific</td><td>542858</td><td></td></tr><tr><td>HYB</td><td></td><td>N/A</td><td>preHYB plus 50 &mikro; g / mL heparin sodyum tuzu, 100 &mikro; g/mL ribonükleik asit dietilaminoetanol tuzu</td></tr><tr><td>İmmünohistokimyasal ıslak kutu</td><td>Mkbio</td><td>MH10002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Düşük profilli leica bıçakları</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>MABT (1x)</td><td>laboratuvarda üretilmiştir</td><td>N/A</td><td>0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCl, %0.02 Tween-20, pH 7.5</td></tr><tr><td>Maleik asit</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J& K Scientific</td><td>116481</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Macklin</td><td>M859248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NTMT</td><td>laboratuvarda üretilmiştir</td><td>N/A</td><td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, %1 Ara-20</td></tr><tr><td>OCT orta</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ADI-950-233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %4</td> <td>Abbexa</td><td>abx082483</td><td>1x PBS'de laboratuvarda üretilmiştir</td></tr><tr><td>PBST (1x)laboratuvarda</td> <td>yapılmıştır</td><td>N/A</td><td>1x PBS artı %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Merck</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>preHYB</td><td>laboratuvarda üretilmiştir</td><td>N/A</td><td>%50 formamid, 5x SSC, 9.2 mM sitrik asit (pH 6.0), %0.1 Ara-20</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Roche</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Ribonükleik asit dietilaminoetanol tuzu</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen 1.5 mL tüpler</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>SSCT (0.2x)</td><td>laboratuvarda üretilmiştir</td><td>N/A</td><td>0.2x SSC artı %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (1x)</td><td>laboratuvarda üretilmiştir</td><td>N/A</td><td>1x SSC artı %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zebra Balığı Laboratuvar Hayvanları Merkezi N</td><td>/A</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ kriyokesitli zebra balığı embriyolarında İmmünohistokimya ile kombine hibridizasyon

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Bir omurgalı olarak, zebra balığı biyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı ve insanlar, insan hastalıkları için bir model olarak kullanılmasına izin veren yüksek genetik homolojiyi paylaşırlar. Gen fonksiyon çalışması, gen ekspresyon paternlerinin tespitine dayanmaktadır. İmmünohistokimya, protein ekspresyonunu test etmek için güçlü bir yol sunsa da, zebra balığında ticari olarak temin edilebilen sınırlı sayıda antikor, costaining uygulamasını kısıtlamaktadır. In situ hibridizasyon, zebra balığı embriyolarında mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, zebra balığı embriyo kesitleri için in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. İmmünohistokimya ve tek kriyokesimin görüntülenmesi in situ hibridizasyon sonrası yapıldı. Protokol, iki genin ekspresyon paternini, önce in situ transkript tespiti ve daha sonra aynı bölümdeki bir proteine karşı immünohistokimya ile çözmeye yardımcı olur.

Bu protokol, bir mRNA ve bir proteinin ekspresyon paternini aynı anda incelemek için kullanılabilir. Şekil 1'de deneysel iş akışı gösterilmektedir. 5-HT2C reseptörü, nörotransmitter serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) tarafından bağlanan 5-HT reseptörünün bir alt tipidir. Merkezi sinir sisteminde (CNS) yaygın olarak dağılmıştır ve iştah, ruh hali, anksiyete ve üreme davranışı dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyonlarını önemli ölçüde düzenleyebilir13. CNS'deki 5-...

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Bu protokol, in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu kullanır ve bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Bu protokol farklı aşamalardaki embriyolara, çeşitli kalınlıktaki doku kesitlerine ve farklı organlara uygulanabilir. Başlamak için, yaklaşık 10 embriyoyu, 12 ila 14 saat boyunca gece boyunca dört santigrat derecede 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünde 0.5 ila 1 mililitre taze% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.PBST'de% 25, 50 ve% 75 metanol ile art arda oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca yıkayarak embriyoları kademeli olarak dehidrate edin. Daha sonra, embriyoları oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 100 metanol içinde yıkayın. Embriyoları, en az bir gecede, 12 ila 14 saat boyunca, eksi 20 santigrat derecede% 100 metanol içinde inkübe edin.PBST'de% 75, 50 ve% 25 metanol ile art arda oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca yıkayarak embriyoları kademeli olarak yeniden sulandırın. Yine, embriyoyu PBST ile üç kez oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca yıkayın. Embriyoları oda sıcaklığında PBST'de mililitre proteinaz K başına 10 mikrogram ile sindirin ve embriyoları beş dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.Daha sonra, yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde tekrar sabitleyin. Yine, her yıkama sırasında beş dakika boyunca inkübe ederken embriyoyu PBST ile üç kez yıkayın. Embriyoları önceden hibridize etmek için, onları beş dakika boyunca 65 santigrat derecede hibridizasyon öncesi çözeltide inkübe edin.Ardından, hibridizasyon öncesi çözeltiyi hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin ve en az dört saat boyunca önceden hibridize edin. Probu, embriyolara eklemeden önce hibridizasyon çözeltisinde 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Embriyoların hava ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla hibridizasyon öncesi çözeltiyi çıkarın.Embriyoları içeren tüpe, hibridizasyon çözeltisine önceden ısıtılmış prob ekleyin ve probun gece boyunca 50 ila 70 santigrat derecede 12 ila 14 saat boyunca melezleşmesine izin verin. Ertesi gün, prob çözeltisini bir pipetle aspire edin ve eksi 20 santigrat derecede bir tüpte saklayın, böylece birçok kez tekrar kullanılabilir. Embriyoları% 100 hibridizasyon çözeltisi ile yıkayın, ardından 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca SSCT konsantrasyonunun iki katı içinde% 75, 50 ve% 25 hibridizasyon çözeltisi ile sıralı yıkama yapın.Daha sonra, embriyoları 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca SSCT konsantrasyonunun iki kez ve 0.2 katı kadar yıkayın. Embriyoları oda sıcaklığında MABT'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Hibridize edilmiş ve yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında en az iki saat boyunca,% 2 bloke edici çözelti-1 ile bloke edin.Bloke edici çözelti-1'i% 2'lik yeni bir bloke edici çözelti-1'de antidigoxigenin alkalen fosfataz ile değiştirin ve dört santigrat derecede 12 ila 14 saat boyunca gece boyunca çalkalayın. Daha sonra, embriyoları MABT'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dört kez yıkayın. Yine, embriyoları NTMT'de iki kez yıkayın ve bir pipet kullanarak embriyolardan mümkün olduğunca fazla NTMT'yi çıkarın.BM mor alkalen fosfataz substratı ile değiştirin ve embriyoları karanlıkta oda sıcaklığında boyayın. Leke geliştikten sonra, NTMT ile iki kez kısaca durulayarak reaksiyonu durdurun. In situ hibridizasyondan sonra, embriyoları PBST ile 20 dakika boyunca üç kez durulayın.Embriyoları, dört santigrat derecede 12 ila 14 saat boyunca gece boyunca PBS'de% 5 sakkaroza batırın. Daha sonra, embriyoları kaplayan çözeltiyi PBS'de% 15 sakkaroz olarak değiştirin ve dört santigrat derecede 12 ila 16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin. Yine, embriyoları kapsayan çözeltiyi PBS'de% 30 sakkaroz olarak değiştirin ve dört santigrat derecede bir ila iki gün boyunca inkübe edin.Embriyoları doku için yeni bir kriyomusta aktarın ve kabarcık oluşumunu önlerken yavaşça optimum kesme sıcaklığı ortamıyla doldurun. Daha sonra, numuneleri bir kriyostat kullanarak 12 ila 20 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın ve bölümleri hızlı bir şekilde cam slaytlara aktarın. Numunelerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve bölümleri daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede kapalı bir slayt kutusunda saklayın.Bölümleri içeren slaytları PBS ile beş dakika boyunca yıkayın. Ardından, slaytları tampona yerleştirin ve kaynama sıcaklığına yakın tutmak için çözeltiyi yaklaşık 20 dakika ısıtın. Fazla çözeltiyi boşaltın ve her bölümün etrafındaki alanı bir parça doku ile dikkatlice kurutun.Daha sonra, hidrofobik bir bariyer oluşturmak için su itici bir kalemle bölümün etrafına bir daire çizin ve bölümü oda sıcaklığında çözelti-2'yi bloke ederek iki saat boyunca bloke edin. Slayt başına pipet birincil antikor çözeltisi ve slaytları gece boyunca dört santigrat derecede immünohistokimyasal ıslak bir kutuda inkübe edin. Her yıkama sırasında 10 dakika boyunca inkübe ederken slaytları PBS ile üç kez yıkayın ve fazla PBS'yi boşaltın.Daha sonra, slaytları PBS'de oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorla inkübe edin. Yine, her yıkama sırasında 10 dakika boyunca inkübe ederken slaytları PBS ile üç kez yıkayın ve fazla PBS'yi boşaltın. Daha sonra, montaj ortamını sürgü üzerine pipetleyin ve bir sürgü kapak kayması ile monte edin.Merkezi sinir sisteminde 5-HT2C reseptörünün ekspresyonu transgenik foxP2 egfp-caax hattında tespit edildi. 5-HT2C'nin eşzamanlı ekspresyonu, transgenik çizgide, floresein yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş foxP2 nöronları ile birlikte gözlendi. Zebra balığı omuriliğinde ve motor nöronlarında bir çinko-parmak transkripsiyon faktörü olan insm1a'nın ekspresyonu, transgenik çizgide tespit edildi.Insm1a'nın eşzamanlı ekspresyonu, transgenik çizgide, floresein yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş hb9 nöronları ile birlikte gözlendi. Zebra balığı taze hazırlanmış paraformaldehit ile sabitlenmelidir.

in-situ-hybridization-combined-with-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

Öğrenin, zebra balığı embriyolarında in situ hibridizasyon ve immünohistokimyayı birleştirerek mRNA ve protein ekspresyonunu aynı anda görüntülemeyi. Bu yöntem, gelişim nörobilimi araştırmalarında gen etkileşimlerini kapsamlı şekilde incelemeyi sağlar.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Daha fazla video keşfet