Name: İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Öğrenin, insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücre izolasyonu ve iskelet kası soylarına farklılaşma yöntemlerini. Bu protokol yüksek canlılıkta hücre sağlar ve rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli taşır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sayın Ojas Tikoo'ya film çekimi ve video prodüksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Gurugram Sivil Hastanesi'ndeki GARBH-Ini (İleri Araştırma ve Doğum Sonuçları Disiplinlerarası Grup-DBT Hindistan) personelinden, hemşirelerinden ve kıdemli araştırma görevlilerinden ve Dr. Pallavi Kshetrapal'dan lojistik konusunda yardım için alınan yardımı da kabul ediyoruz. Bu çalışma, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'nden Suchitra Gopinath'a verilen hibelerle desteklenmiştir (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Bu çalışmada göbek kordonu dokusunun kullanımı Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR), Kurumsal Etik Komitesi, Translasyonel Sağlık Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (IEC-THSTI), Sivil Hastane Kurumsal Etik Komitesi, Gurugram, Haryana ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi, THSTI tarafından onaylanmıştır. İnsan kordon dokusu örnekleri, doğum sırasında term doğumlardan toplandı. Deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Tüm yöntemler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. MSC'lerin kordon dokusundan izolasyonu
<ol><li>Doğum sırasında, tercihen plasentaya daha yakın olan en az 5 cm'lik kordonu kesin ve dış yüzeyi% 70 etanol ile süpürerek kordonu sterilize edin. Kordon dokusu parçasını, fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir 50 mL toplama tüpünden aynı şeyi içeren bir başkasına sırayla aktarın. Buz üzerinde deneğin adını taşıyan toplama tüpünü 1 saat içinde laboratuvara taşır. NOT: Daha büyük bir etüt için, numunelerin etüt boyunca izlenmesini sağlamak için numunelerin barkodlanması yararlı olabilir. Önemli olarak, insan dokularını işleyen tüm personele hepatit B aşısının tam rejimi sunulmalıdır.</li>
	<li>Laboratuvarda, kullanmadan önce otoklavlanmış aletleri ve pipetleri sterilize etmek için BSL-2 davlumbazda 25 dakika boyunca UV'yi açın.</li>
	<li>Kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 5 g / L glikoz, 50 μg / mL gentamisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile zenginleştirilmiş PBS içeren 10cm2 doku kültürü ile muamele edilmiş bir kaba aktarın ( Şekil 1'de şematik).</li>
	<li>Bir neşter kullanarak, iki yarı silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına ekseni boyunca dikey olarak dilimleyin. Kordon burulması ve mukoid yüzey nedeniyle, diğer elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.</li>
	<li>Bu noktada, göbek damarlarını ve damarı gözlemleyin ve kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazımak için bir neşter kullanarak çıkarın. Dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de bir kez daha durulayın. Damarları çevreleyen WJ'deki hücrelerin bütünlüğünü korumak için kazımanın nazik olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kordon dokusunun her bir yarısını 0,5cm3 büyüklüğünde parçalar halinde kesin ve parçaları ışık yüzeyi aşağı bakacak şekilde tabağın üzerine yerleştirin. Çanağı,% 5 CO 2 içeren 37 ° C nemlendirilmiş bir odada 10 dakika boyunca kısaca kuluçkayayatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, kordon dokusu parçalarını içeren çanağı, L-glutamin, ribo- ve deoksiribonükleositler,% 15 fetal sığır serumu (ısıl inaktive değil) ve 50 μg / mL gentamisin-içermeyen MEM Alpha Modifikasyonu içeren 20 mL ortam ile doldurun. Doku eksplantlarının oryantasyonlarından çıkmasını önlemek için büyüme ortamını yanlar boyunca yavaşça ekleyin. Kuluçka sırasında doku eksplantları tarafından ıslatılacak bir fraksiyonu hesaba katmak için fazla ortam ekleyin.</li>
	<li>3 günlük inkübasyondan sonra, kültürlere taze ortam ekleyin. Bulaşıkları tutarken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunduğundan emin olun.</li>
	<li>1 hafta sonra, steril forseps kullanarak doku parçalarını ayrı ayrı çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler% 70'lik bir birleşime ulaşana kadar büyüme ortamını her 4 günde bir değiştirin. NOT: Hücrelerin çanak boyunca eşit olarak dağılmaması muhtemeldir, çünkü zamanla birleşmesi için izlenmesi gereken bireysel proliferatif koloniler olacaktır. Genel olarak, bir ay içinde, 10cm2'lik bir çanak, ayrı bir kaba bölünmek için yeterli hücre üretir.</li>
	<li>Tripsin / EDTA çözeltisi (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde [HBSS]'de% 1x% 0.25 tripsin ve% 0.02 EDTA) kullanarak yapışkan hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu 470 × g'da 25 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini büyüme ortamında yeniden askıya alın.</li>
</ol>2. uMSCS'nin immünofenotiplenmesi ve yayılması
<ol><li>Yapışkan hücreler% 50-60 birleşimine ulaştığında ve iyi yayıldığında immünofenotiplemeye geçin. MSC işaretleyici analizini tam akıcı kültürler üzerinde yapmayın, çünkü bu anahtar MSC belirteçlerinin aşağı regülasyonuna neden olma eğilimindedir.</li>
	<li>Tripsinizasyondan sonra, FACS tüplerinde 1 × 106 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu dağıtın (1 × 105 hücre / tüp) ve uygun florofora bağlı antikorlarla (hepsi 1:50 seyreltme) kombinasyon halinde boyanın: lekelenmemiş; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (ortak florofor); Her florofor için izotip kontrolleri. Daha fazla analiz için akış sitometresine en az 10.000 toplam olay sayısı kaydedin. NOT: Hücreler her yüzey işaretçisi için ayrı ayrı analiz edildiğinden, hücre alt kümeleri üzerinde geçit gerekli değildir.</li>
	<li>Yukarıdaki belirteçlere ek olarak, bireysel kordon dokusu örneklerinden oluşturulan uMSC hatlarında pozitif ve negatif yüzey belirteçlerinin varlığını doğrulamaktadır (Tablo 1).</li>
	<li>Etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 + CD90 + ve CD105 + CD73 + hücrelerinin yüzdesini belirleyin. CD105+ ve CD34−CD45− hücrelerini ayrı ayrı analiz edin.</li>
</ol>3. uMSC'lerin iskelet kasına farklılaşması
<ol><li>PBS'de %0.01 kollajen ve 20 μg/mL laminin içeren doku kültürü plakalarını kaplayın. Bu plakaları oda sıcaklığında en az 4 saat kaplayın.</li>
	<li>Büyüme ortamında 10.000 hücre/cm2 yoğunlukta plaka uMSC'ler.</li>
	<li>Hücreler% 70 birleştiğinde, büyüme ortamını aspire edin ve kültürleri PBS ile 2 kat durulayın. uMSC'lere DMEM +% 5 at serumu + 0.1 μM deksametazon + 50 μM hidrokortizondan oluşan miyojenik farklılaşma ortamı (M1) ekleyin. Miyojenik progresyonun kinetiğinin belirlenmesi için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin.</li>
	<li>Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, sırasıyla 2 gün, 4-5 gün, 6-7 gün ve 10-14 günde Pax7, MyoD, Myogenin ve MyHC ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Kritik adımlar Bu protokoldeki kritik bir adım, tüm yayılma süresi boyunca, doğum anından steril kültürlerin bakımına kadar aseptik koşullar altında dokunun toplanmasıdır. Kordon toplama sırasında, kordonun sterilize edilmemiş herhangi bir yüzeye temas etmemesi ve antibiyotik takviyeli PBS içeren tüplerde toplanmadan önce% 70 etanol ile harici olarak temizlenmesi esastır. uMSC izolasyonu için kordon toplanması ve dokunun işlenmesi arasındaki süreyi sınırlamak önemlidir. Dokunun toplandığı yerden labor...

İnsan göbek kordonunun, sağlam proliferasyon ve farklılaşma oranları, immünomodülatör özellikleri ve üç germ katmanının hepsinden hücre üretme yetenekleri nedeniyle şu anda rejeneratif tedaviler için araştırılmakta olan sağlam bir mezenkimal kök hücre rezervuarına sahip olduğu düşünülmektedir1. Göbek kordonu dokusu, göbek kordonu kanı, göbek damarı subendoteli ve Wharton'un jölesi (WJ) gibi kendi içinde üç belirsiz bölgeyi kapsayan çoklu bölmelerden oluşur - perivasküler bölge, intervasküler bölge ve alt amniyon veya kordon astarı (CL)2. uMSC'ler tüm bu farklı bölgelerden izole edilebilse ve anahtar MSC belirteçlerini geniş çapta ifade edebilse de, bu bölmelerin aynı uMSC popülasyonunu içerip içermediği veya farklılaşma potansiyellerinde farklılıklar gösterip göstermediği konusunda netlik yoktur3. Bu nedenle, uMSC'lerin izolasyonu için protokoller, izolasyon modlarında ve bölgelerinde daha büyük bir hassasiyet, farklılaşma potansiyellerinin sağlam karakterizasyonu ve son olarak, kablonun farklı bölmelerinden karşılaştırmalı bir analiz gerektirir. 
Bu bağlamda, az sayıda çalışma, kordonun farklı kısımları arasındaki uMSC proliferatif ve farklılaştırıcı potansiyellerinde farklılıklar göstermiştir. Bunlardan CL ve WJ bölgelerinden izole edilen uMSC'ler arasındaki karşılaştırmalı analizler, CL kaynaklı uMSC'lerde daha büyük bir proliferatif potansiyel ortaya koymuştur 3,4. Ayrı bir çalışmada, WJ kaynaklı uMSC'ler, proliferasyon tahlillerinde perivasküler hücrelere (HUCPV) kıyasla daha iyi performans göstermiştir5. Kordon kanı kaynaklı uMSC'ler ile vasküler kontaminasyondan yoksun kordon dokusu kaynaklı uMSC'ler arasındaki farkların incelenmesinde, iki bölme arasında anahtar MSC belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonunun yanı sıra kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde proliferasyon oranlarının arttığı bildirilmiştir6.
uMSC'lerin öncelikle osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar gibi mezoderm soyunun dokularına farklılaşma potansiyellerini inceleyen çeşitli çalışmalardan çok azı, miyojenik farklılaşma ve müteakip karakterizasyon için ayrıntılı protokollerin yanı sıra çeşitli kordon bölmeleri arasındaki karşılaştırmalı analizler sağlamıştır. Bu bağlamda sağlam bir kas farklılaşma protokolü geliştirdik ve kordon dokusu kaynaklı uMSC'lerin kordon kanı6'ya kıyasla daha üstün miyojenik farklılaşma yetenekleri gösterdiğini gözlemledik. Burada, uMSC'lerin vaskülatür ile ilişkili hücrelerden yoksun tüm kordon dokusundan izolasyonu, karakterizasyonu ve miyojenik soya farklılaşması için kademeli bir protokol detaylandırılmıştır.

<table><tbody><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik çözeltisi 100x Sıvı, endotoksin test edildi (% 0.9 normal salin içinde 10.000 U Penisilin ve 10 mg Streptomisin / mL)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC antikoru (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD antikoru (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Miyojenin antikoru (Klon F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pax7 antikoru</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Fare anti-insan CD90 klonu 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II veya FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli Brezilya</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>ısıyla etkisiz hale getirilmemelidir</td></tr><tr><td>FITC Fare anti-insan CD106 klonu 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-insan CD14 klonu M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-insan CD31 klonu WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-insan CD34 klonu 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-insan CD45 klonu HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare anti-insan CD49D klonu 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare anti-insan CD90 klonu 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-insan HLA-A, B, C klonu G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-insan IgG klonu G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alfa L-glutamin, ribo- ve deoksiribonükleozitler olmadan</td> modifikasyon <td></td><td>Hidroklon SH30568. </td><td>FS uMSC'ler için bazal ortam</td></tr><tr><td>PE Fare anti-insan CD105 klonu 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare anti-insan CD44 klonu 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare anti-insan CD49E klonu llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare anti-insan IgG klonu G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Fare anti-insan CD73 KLON AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH = 7.4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA çözeltisi (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 1x %0.25 Tripsin ve %0.02 EDTA)</td> <td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücrelerin Üretimi ve İskelet kas soyuna farklılaşması

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Mezenkimal kök hücrelerin terapötik potansiyelini araştırmak, izolasyonun kolaylığına, farklılaşmaya yönelik potansiyele ve kaynağın güvenilirliğine ve sağlamlığına bağlıdır. Burada, mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan (uMSC'ler) izolasyonu, immünofenotiplenmesi ve bu kültürlerin birkaç pasaj üzerinde yayılması için kademeli bir protokol tarif ediyoruz. Bu prosedürde, enzimatik sindirim olmadığı için uMSC'lerin yaşayabilirliği yüksektir. Ayrıca, göbek kordonu arterleri ve damar dahil olmak üzere kan damarlarının çıkarılması, endotel kökenli hücrelerin kirlenmemesini sağlar. Akış sitometrisi kullanılarak, izolasyon üzerine uMSC'ler CD45-CD34-'dür ve hematopoetik soydan hücrelerin yokluğunu gösterir. Önemli olarak, anahtar yüzey işaretleyicilerini, CD105, CD90 ve CD73'ü ifade ederler. Kültürlerin kurulmasından sonra, bu yazıda bu uMSC'lerde iskelet kası soyuna farklılaşmayı indüklemek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Diferansiye uMSC'lerde miyojenik progresyonun ayrıntılı bir analizi, uMSC'lerin farklılaşmanın ilk aşamalarında miyojenik progenitörler için bir belirteç olan Pax7'yi, ardından MyoD ve Myf5'in ekspresyonunu ve son olarak bir terminal farklılaşma belirteci olan miyozin ağır zincirini (MyHC) ekspresyonunu ifade ettiğini ortaya koymaktadır.

uMSC'lerin kordon dokusundan izole edilmesinin başarısı, tam kordon kanından elde edilen zayıf başarı oranlarının aksine% &gt;95'tir. uMSC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi üzerine, FACS analizi tüm hücrelerin CD34-CD45-CD105 + CD90 + olduğunu ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, karşılaştırmalı analizde, kordon kanından izole edilen uMSC'ler, hücrelerin bir kısmının CD34 + CD45 + CD105 + (~% 15) gösterdiği heterojen popülasyonları gösterir.<...

Mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan izolasyonu ve iskelet kası soyuna farklılaşması için bir protokol tanımladık.

İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Mezenkimal kök hücreyi insan göbek kordonu dokusundan izole etmek için protokolümüzü ve bunları iskelet kası soyuna ayırmak için sağlam bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu teknik, yüksek canlılığa ve ısıya sahip mezenkimal kök hücreleri, endotel kökenli hücrelerin kontaminasyonu çok az veya hiç kirlenmeden izole etmemizi ve bu hastalıklarda miyojenik farklılaşmayı etkili bir şekilde indüklememizi sağlar. Kordon burulması ve mukoid kıvamı, kablonun tutulmasını zorlaştırır.Kordonun nasıl işleneceğini, Wharton'un jölesini kazımamayı ve endotel hücrelerini popülasyondan dışlamayı gösteriyoruz. Kordon dokusunu teslim zamanında topladıktan sonra, kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 10 santimetrekarelik doku kültürü ile işlenmiş bir kaba aktarın ve dokuyu taze PBS ile iyice yıkayın. Kordon burulması ve mukoid yüzeye dikkat etmek için, bir elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.Bir neşter kullanarak, iki yarım silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına erişimi boyunca dikey olarak dilimleyin. Bu noktada, göbek damarlarını ve damarlarını gözlemleyin. Bir neşter kullanarak, kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazıyarak çıkarın ve dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de durulayın.Kordon dokusunun her yarısını 0,5 santimetreküp büyüklüğünde parçalara ayırın. Parçaları, ışıklı yüzeyi çanağın üzerine bakacak şekilde yerleştirin ve tabağı 10 dakika boyunca kısaca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, kordon dokusunu içeren kabın kenarları boyunca yavaşça MEM Alpha modifikasyonu içeren 20 mililitre ortam ekleyin.Eksplantların oryantasyonlarından ayrılmadığından emin olun ve doku eksplantlarının kuluçka sırasında emeceği bir kısmı hesaba katmak için fazla ortam ekleyin. Sonra tabağı üç gün boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın bitiminden sonra, kültüre taze ortam ekleyin ve yemeklerle uğraşırken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunmasını sağlayın.Bir hafta sonra, steril forseps kullanarak, doku parçalarını tek tek çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler %70'lik bir birleşime ulaşana kadar her dört günde bir büyüme ortamını değiştirin Makalede açıklandığı gibi hücreleri boyadıktan sonra, etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 CD90 pozitif ve CD105 CD73 pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.CD105 pozitif ve CD34 CD45 negatif hücreleri ayrı ayrı analiz edin. Doku kültürü plakasını PBS'de% 0.01 kollajen vemililitre laminin başına 20 mikrogram ile kaplayın ve oda sıcaklığında en az dört saat boyunca rocker'ın üzerine yerleştirin. Kuluçkadan sonra, kollajeni çıkarın ve plakayı PBS ile yıkayın, ardından uMSC'leri büyüme ortamında santimetrekare yoğunluğu başına 10.000 hücrede plakalayın.Hücreler% 70 akıcılığa ulaştığında, büyüme ortamını aspire edin ve kültür plakasını PBS ile iki kez durulayın. Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin ve sırasıyla iki gün, dört ila beş gün, altı ila yedi gün ve on ila on dört günde pax7, MyoD, miyogenin ve miyozin ağır zincirinin ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin. uMSC'ler CD105 ve CD90 ekspresyonunu görüntüler ve CD34 ve CD45 hematopoetik belirteçlerini eksprese etmez.uMSC'ler, uMSC'lerin CD73 işaretleyicisinin ekspresyonu için de pozitifti, bu da uMSC'lerin birden fazla anahtar belirteci ifade ettiğini gösteriyordu. uMSC'ler, M1 ilavesinin ilk iki günü içinde pax7 ekspresyonunu gösterdi, bunu M1 ilavesinin ilk dört günü içinde MyoD ekspresyonu izledi. Hücreler altı günlük farklılaşmada miyojenin proteinini eksprese eder, bunu takiben farklılaşma indüksiyonunun 10 gün ila 14 günü arasında miyozin ağır zincirinin ekspresyonu gelir.Diferansiye edilmemiş uMSC'lere kıyasla miyojenik farklılaşmanın indüksiyonuna yanıt olarak 970 gen yukarı regüle edildi. Kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde, kordon kanı kaynaklı uMSC'lere kıyasla daha fazla miyojenik gen yukarı regüle edildi. Hem kordon dokusu hem de kordon kanı, aktin bağlama ve sarkomer montajı ile ilişkili sitoiskelet proteinleri ile ilişkili genlerin regülasyonunu, kontraktil fonksiyonla ilişkili taşıyıcıları, kas kütlesini korumayı, kalsiyum sinyallemesini ve enzimatik fonksiyonu gösterdi.Dokuyu aseptik durumda toplayın ve steril kültürü koruyun. Kordon dışarıdan% 70 etanol ile süpürülmeli ve mümkün olduğunca hızlı işlenmelidir. Birçok rejeneratif tedavi, erken pasajlardan çok sayıda hücre gerektirir.Ayrıca tüm kuru ortamı taklit etmek ve doğum sonrası metabolizmayı yansıtmak için bir model olarak da kullanılabilir.

generation-mesenchymal-stem-cells-from-human-umbilical-cord-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Balona hücre bağlılık hızına göre kas-iskelet yumuşak dokulardan Yalıtımlı yetişkin kök hücreleri.

Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada, kordon kanı mononükleer hücre kaynaklı insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden kondrojenik farklılaşma için bir protokol önermekteyiz.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

İnsan göbek kordonu (UC) sonucu olarak preterm, terim perinatal dönemde elde edilebilir ve teslimat postterm. Bu protokol için biz yalıtım ve UC kaynaklı mezenkimal kök hücre (UC-MSCs) karakterizasyonu fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik açıklar.

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Öğrenin, insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücre izolasyonu ve iskelet kası soylarına farklılaşma yöntemlerini. Bu protokol yüksek canlılıkta hücre sağlar ve rejeneratif tıpta uygulama potansiyeli taşır.

İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması

Daha fazla video keşfet