Name: Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Öğrenin, DNA ve ligandlar arasındaki bağlanma etkileşimlerini yüksek verimli topluluk kuvveti spektroskopisi ile biyofiziksel çalışmalarda gerçek zamanlı algılama için nasıl incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma çalışması, Ulusal Bilim Vakfı [CBET-1904921] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [NIH R01CA236350] tarafından H. M. tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve kimyasal reaktifler Tablo Malzemeleri'nde listelenmiştir.
1. Kesme kuvveti mikroskobunun hazırlanması
NOT: Kesme kuvveti mikroskobu, bir reaksiyon ünitesi (homojenizatör) ve bir algılama ünitesi (floresan mikroskobu) olmak üzere iki bölümden oluşur. Göz merceğinin büyütülmesi 10x'tir ve objektif lensin (hava) büyütmesi 4x'tir.
<ol><li>Homojenizatörü ve mikroskobu bir montaj tablasına monte edin. Gözlük takın ve floresan mikroskobu açın ve ardından uygun bir dalga boyundaki uyarma ışık demetinin (burada 488 nm kullanıldı) homojenizatörün dispersiyon ucunun merkezinden geçtiğinden emin olmak için homojenizatörü ayarlayın.</li>
	<li>Enine kesitte 5 cm yüksekliğinde ve 1,5 cm2 x 1,5cm2 yüksekliğinde düz tabanlı bir reaksiyon odası hazırlayın. Arka planı azaltmak için, seçilen hazne malzemesinin cam gibi floresan olmadığından emin olun (bazı plastiklerde floresan vardır).</li>
	<li>İstenilen kesme kuvvetini sağlayabilen uygun bir homojenizatör dispersiyon ucu seçin. NOT: Kesme hızı, aşağıdaki denkleme göre sabit bir dönme hızında rotor ve stator arasındaki mesafeye bağlıdır11 : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63741/63741eq01.jpg" style="margin: auto;"> burada μ, 20 ° C'de suyun dinamik viskozitesidir; D, statorun iç çapıdır; d, rotorun dış çapıdır ve V, kesme hızıdır (rpm / s).</li>
	<li>Reaksiyon odasını floresan mikroskobun numune aşamasına sıkıştırın ve ardından odayı homojenizatörün dispersiyon ucunu tutacak şekilde ayarlayın (Şekil 1). Dispersiyon ucunun, reaksiyon odasının alt yüzeyinin biraz üzerinde (~1 mm) olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mikroskopun odağının dispersiyon ucunun yüzeyinde olduğundan emin olmak için homojenizatörün ve haznenin dikey konumunu birlikte ayarlayın. Ardından, algılama alanının (görüş alanı) rotor ve stator arasında ayarlandığından emin olmak için dağılım ucunun yatay konumunu ayarlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Deneyde kullanılan floresan boyaya göre floresan kanallarını açın.</li>
	<li>Yüksek hızlı kesme deneyinden önce, dispersiyon ucunun reaksiyon odasına dokunmadan düzgün çalışabilmesini sağlamak için kesmeyi düşük kesme hızıyla (örneğin, 2.000 rpm) test etmek için deiyonize (DI) su kullanın.</li>
</ol>2. Ligandlı ve ligandsız i-motiflerin açılması
<ol><li>Hu ve ark.11'de açıklandığı gibi, DI suyunda sırasıyla iki ucunda bir boya ve bir söndürücü ile etiketlenmiş bir insan telomerik i-motif DNA'sı (Malzeme Tablosu) hazırlayın. NOT: Dizi içeren i-motif: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.</li>
	<li>DNA'yı pH 5.5 veya pH 7.4'te 30 mM MES tamponunda 5 μM'ye kadar seyreltin. DNA çözeltisine, Abraham Punnoose ve ark.13'e göre sentezlenen ligand L2H2-4OTD'yi 0-60 μM'lik bir konsantrasyon aralığında ekleyin.</li>
	<li>Floresan mikroskobu kullanarak deiyonize DI suyuyla doldurulan reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kesmeden kontrol edin ve en aza indirin. Arka plan floresansını en aza indirmenin kolay bir yolu, reaksiyon odasını DI suyuyla yıkamaktır. Arka plan floresan değerinin daha sonra veri analizlerinde çıkarılması gerekir. NOT: Bu adımdan itibaren başıboş ışıktan kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Yazılımı kullanarak CCD kameranın parametrelerini ayarlayın. Önerilen parametreler aşağıdaki gibidir: pozlama süresi = 0,5 sn, CCD duyarlılığı = 1600 ve kayıt süresi = 20 dakika.</li>
	<li>Uzun bir pipet kullanarak, DNA çözeltisini boş ve temiz reaksiyon odasına ekleyin. Reaksiyon odasını kara bir kutu ile örtün. Ardından, verileri kaydetmek için CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca 9.724 s−1 ila 97.245 s−1 (homojenizatörle ilişkili yazılım kullanılarak seçilmiştir) arasında değişen seçilmiş bir kesme hızında kesme gerçekleştirmek için homojenizatörü çalıştırın.</li>
	<li>Deneyden sonra, odayı çıkarın ve DI suyuyla yıkayın.</li>
</ol>3. Kesme kuvveti ile çalıştırılan tıklama reaksiyonu
<ol><li>DI suyunda i-motif DNA'sı hazırlayın. 10 μM CuCl ve 300 μM askorbik asit ile desteklenmiş 300 μM Tris tamponunda (pH 7.4) 10 μM i-motif DNA'sını 10 dakika boyunca inkübe edin (tüm konsantrasyonlar çözeltideki son konsantrasyonlardır). NOT: CuCl, tıklama reaksiyonunun katalizörüdür. Askorbik asit, bakır (I) oksidasyonunu önleyecektir.</li>
	<li>Çözeltiyi, 14.300 x g'lık bir santrifüj kuvvetinde bir ultrafiltrasyon cihazı ile ultra filtreleyin. Her filtrasyondan sonra çözeltiyi ~500 μL'ye kadar 300 μM askorbik asit ile desteklenmiş 30 mM Tris tamponu (pH 7.4) ile doldurun.</li>
	<li>Filtrelemeyi 3x tekrarlayın.</li>
	<li>Artık çözeltiyi toplayın ve 20 μM Calfluor 488 azid, 20 μM HPG ve 10 μM TBTA ile birlikte 300 μM askorbik asit ile desteklenmiş 30 mM Tris (pH 7.4) ekleyerek 300 μL'lik bir son hacim oluşturun. Reaktifler eklendikten sonra, çözeltiyi karanlık odaya taşıyın. NOT: Bu adımdan sonra ışıktan kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Kesme deneylerinden önce mikroskop kullanarak DI suyuyla doldurulmuş reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kontrol edin ve en aza indirin. Arka plan floresansını en aza indirmenin kolay bir yolu, reaksiyon odasını DI suyuyla yıkamaktır.</li>
	<li>DNA çözeltisini uzun bir pipetle boş reaksiyon odasına ekleyin ve ardından homojenizatör kesmeyi CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca 63.209 s−1 kesme hızında başlatın.</li>
	<li>Deneyden sonra, odayı çıkarın ve DI suyuyla yıkayın.</li>
</ol>

<ol><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+Optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li>
<li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+a+covalent+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li>
<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li>
<li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026(2016).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li>
<li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility%3A+Force-induced+collagen+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li>
<li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li>
<li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells%3A+go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li>
<li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li>
<li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li>
<li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li>
<li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li>
<li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Bu makalede açıklanan protokol, bir grup biyomoleküler yapının kesme kuvveti ile açılmasının gerçek zamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Burada sunulan sonuçlar, DNA i-motif yapılarının kesme kuvveti ile açılabileceğinin altını çizmektedir. Ligand'a bağlı i-motifin açılması ve kesme kuvveti ile harekete geçirilmiş tıklama reaksiyonları, bu topluluk kuvveti spektroskopisi yöntemi için kavram kanıtı uygulamalarıydı.
Şekil 1'de cihaz kurulumu gösterilmektedir. ...

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi1'de (SMFS), bireysel moleküler yapıların mekanik özellikleri, atomik kuvvet mikroskobu, optik cımbız ve manyetik cımbız 2,3,4 gibi sofistike aletlerle incelenmiştir. Kuvvet üreten/algılayan kurulumlardaki moleküllerin aynı yönlülük gereksinimi veya manyetik cımbızdaki küçük görüş alanı ve minyatür santrifüj kuvvet mikroskobu (MCF)5,6,7,8 ile sınırlı olarak, SMFS kullanılarak aynı anda yalnızca sınırlı sayıda molekül araştırılabilir. SMFS'nin düşük verimi, büyük bir molekül kümesinin katılımını gerektiren moleküler tanıma alanındaki geniş uygulamasını önler.
Kesme akışı, büyük bir molekül kümesine kuvvet uygulamak için potansiyel bir çözüm sağlar9. Bir kanalın içindeki sıvı akışında, kanal yüzeyine ne kadar yakın olursa, akış hızı10 o kadar yavaş olur. Böyle bir akış hızı gradyanı, sınır yüzeyine paralel kesme gerilimine neden olur. Bir molekül bu kesme akışına yerleştirildiğinde, molekül kendisini yeniden yönlendirir, böylece kesme kuvveti uzun eksen11'e uygulandığında, uzun ekseni akış yönüyle hizalanır. Bu yeniden yönlendirmenin bir sonucu olarak, aynı tipteki tüm moleküllerin (sapların boyutu ve uzunluğu) aynı kesme kuvvetini yaşarken aynı yönde hizalanması beklenir.
Bu çalışma, DNA i-motifi tarafından örneklendiği gibi, büyük bir moleküler yapı kümesine kesme kuvveti uygulamak için böyle bir kesme akışını kullanmak için bir protokolü tanımlamaktadır. Bu protokolde, homojenizatör ucundaki rotor ve stator arasında bir kesme akışı oluşturulur. Bu çalışma, katlanmış DNA i-motif yapısının 9724-97245 s-1 kesme oranlarıyla açılabileceğini buldu. Ayrıca, L2H2-4OTD ligand ile i-motif arasında 36 μM'lik bir ayrışma sabiti bulundu. Bu değer, jel kayma testi 12 ile ölçülen 31 μM iletutarlıdır. Ayrıca, mevcut teknik, bir tıklama reaksiyonunu katalize etmek için şelatlı bakırı (I) açığa çıkarabilen i-motifi açmak için kullanılır. Bu protokol böylece, makul bir sürede (30 dakikadan daha kısa) düşük maliyetli aletlerle büyük bir dizi i-motif yapısının ortaya çıkmasına izin verir. Kesme kuvveti tekniğinin kuvvet spektroskopisinin verimini büyük ölçüde arttırdığı göz önüne alındığında, bu tekniğe topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS) diyoruz. Bu protokol, bu kesme kuvvetine dayalı EFS'nin uygulanmasını kolaylaştırmak için deneysel kılavuzlar sağlamayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>3K MWCO Amicon</td><td>Millipore Sigma</td><td>ufc900324</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>VWR</td><td>VWRC0143-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calfluor 488 azid</td><td>Click Kimya Araçları</td><td>1369-1</td><td></td></tr><tr><td>CuCl</td><td>Thermo&nbsp;</td><td></td><td></td>ACRO270525000</tr><tr><td>Dispersiyon ucu</td><td>İsviçre</td><td>PT-DA07/2EC-B101</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boya</td><td>IDT/</td><td>5Cy5/</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Janpan</td><td>Nikon TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör</td><td>İsviçre</td><td>PT 3100D</td><td></td></tr><tr><td>HPG</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>cs-295271</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26760.295</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>VWR</td><td>VWRCE169-500G</td><td></td></tr><tr><td>Söndürücü</td><td>IDT</td> <td>/ 3IAbRQSp /</td><td></td></tr> <tr><td>TBTA</td><td>Tokyo Kimya Endüstrisi</td><td>T2993</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>VWRCE133-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

kesme kuvvetleri ile topluluk kuvveti spektroskopisi

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Floresan ve mekanokimyasal prensiplere dayanan tek moleküllü teknikler biyolojik algılamada üstün duyarlılık sağlar. Bununla birlikte, yüksek verim yeteneklerinin eksikliği nedeniyle, bu tekniklerin uygulanması biyofizikte sınırlıdır. Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), bireysel moleküllerin mekanokimyasal çalışmalarını moleküler toplulukların çalışmalarına dönüştürerek büyük bir moleküler yapı kümesinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bu protokolde, DNA ikincil yapıları (i-motifler), bir homojenizatör ucunun rotoru ile statoru arasındaki kesme akışında 77796 / s'ye kadar kesme hızlarında açılmıştır. Akış hızlarının ve moleküler boyutların i-motifin yaşadığı kesme kuvvetleri üzerindeki etkileri gösterilmiştir. EFS tekniği ayrıca DNA i-motifleri ve ligandlar arasındaki bağlanma afinitesini de ortaya çıkardı. Ayrıca, kesme kuvveti (yani, mekano-tıklama kimyası) ile harekete geçirilebilen bir tıklama kimyası reaksiyonu gösterdik. Bu sonuçlar, moleküler yapıların konformasyonunu kontrol etmek için kesme kuvveti kullanmanın etkinliğini ortaya koymaktadır.

Şekil 1, EFS'deki topluluk moleküllerinin mekanik açılımını ve gerçek zamanlı algılanmasını özetlemektedir. Şekil 1B'de, i-motif DNA'nın floresan yoğunluğunun, pH 5.5 MES tamponunda 9.724 s-1 ila 97.245 s-1 arasında değişen kesme hızı ile arttığı gözlenmiştir. Bir kontrol olarak, aynı i-motif DNA'sı pH 7.4 MES tamponunda 63.209 s-1 oranında kesildiğinde floresan yoğunluğu artmadı. Bunun nedeni, i-motifin pH 7.4<s...

Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Bu protokol, DNA ve ligandlar arasındaki moleküller arası bağlanmayı incelemek için yüksek verimli bir teknik sağlar. Bu teknik, büyük biyomoleküler yapı setinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bunu, bireysel moleküllerin mekanik kimyasal özelliklerini moleküler toplulukların özelliklerine dönüştürerek yapar.Bunun çok ileri bir adım olduğunu düşünüyorum, ancak kritik olarak birkaç adım var. Örneğin, mikroskop, homojenizatör ve reaksiyon tüpünün hizalanması. Floresandaki değişimi doğru bir şekilde izlemek için bu üç şey mükemmel bir şekilde hizalanmalıdır.Homojenizatörü ve mikroskobu bir montaj tablasına monte ederek başlayın. Gözlük taktıktan sonra, floresan mikroskobu açın ve ardından uyarma ışık demetinin homojenizatörün dağılma ucunun merkezinden geçtiğinden emin olmak için homojenizatörü ayarlayın. Ardından, beş santimetre yüksekliğinde ve enine kesitte 1,5 x 1,5 santimetrekare olan düz tabanlı bir reaksiyon odası hazırlayın ve seçilen oda malzemesinin arka planı azaltmak için floresan yapmamasını sağlayın.Daha sonra, reaksiyon odasını floresan mikroskobun numune aşamasında kelepçeleyin ve ardından hazneyi homojenizatörün dispersiyon ucunu tutacak şekilde ayarlayarak ucun reaksiyon odasının alt yüzeyinin biraz üzerinde olmasını sağlayın. Daha sonra, mikroskopun odağının dispersiyon ucunun yüzeyinde olduğundan emin olmak için homojenizatörün ve haznenin dikey konumunu birlikte ayarlayın. Ardından, algılama alanının rotor ve stater arasında ayarlandığından emin olmak için dağılım ucunun yatay konumunu ayarlayın.Deneyde kullanılan floresan boyaya göre floresan kanallarını açın. Yüksek hızlı kesme deneyinden önce, kesmeyi düşük kesme hızıyla test etmek için deiyonize su kullanıldı. İlk olarak, el yazmasında açıklandığı gibi deiyonize suda sırasıyla iki ucunda bir boya ve bir söndürücü ile etiketlenmiş bir insan telomerik i-motif DNA'sı hazırlayın.Daha sonra, DNA'yı pH 5.5 veya pH 7.4'te 30 milimolar MES tamponunda beş mikromolara seyreltin. DNA çözeltisine, sıfır ila 60 mikromolar konsantrasyon aralığında ligand L2H24OTD" ekleyin ve i-motif yapılarını ışıksız katlamak için çözeltiyi 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Floresan mikroskobu kullanarak deiyonize suyla doldurulan reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kesmeden kontrol edin ve en aza indirin.Ardından, yazılımı kullanarak CCD kameranın parametrelerini pozlama süresi 0,5 saniye, CCD hassasiyeti 1.600 ve kayıt süresi 20 dakikaya eşit olacak şekilde ayarlayın. Uzun bir pipet kullanarak, DNA çözeltisini boş ve temiz reaksiyon odasına ekleyin ve reaksiyon odasını kara bir kutu ile örtün. Ardından, verileri kaydetmek için CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca saniyede 9.724 ila 97.245 arasında değişen seçilmiş bir kesme hızında kesme gerçekleştirmek için homojenizatörü çalıştırın.Deneyden sonra, odayı çıkarın ve deiyonize suyla yıkayın. İ-motif DNA ve deiyonize su hazırlayın. Daha sonra, i-motif yapılarını katlamak için 10 dakika boyunca 10 mikromolar i-motif DNA'sını ve 150 mikromolar cupric klorür ve 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 300 mikrolitre 30 milimolar tris tamponunu inkübe edin.Daha sonra çözeltiyi 14.300 kat santrifüj kuvvetinde bir ultra filtreleme cihazı ile ultra filtreleyin G.Her filtrasyondan sonra 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 30 milimolar tris tamponu ile çözeltiyi yaklaşık 500 mikrolitreye doldurun. Artık çözeltiyi topladıktan sonra, 20 mikromolar CalFluor 488 Azide, 20 mikromolar HPG ve 10 mikromolar TBTA ile birlikte 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 30 milimolar tris ekleyerek 300 mikrolitrelik son bir hacim oluşturun. Reaktifler eklendikten sonra, çözeltiyi karanlık odaya taşıyın.Ardından, kesme deneylerinden önce mikroskop kullanarak deiyonize suyla dolu reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kontrol edin ve en aza indirin. Daha sonra, DNA çözeltisini uzun bir pipetle boş reaksiyon odasına ekleyin ve ardından homojenizatörün CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca saniyede 63.209 kesme hızında kesilmesini başlatın. Deneyden sonra, odayı çıkarın ve deiyonize suyla yıkayın.i-motif DNA'nın floresan yoğunluğunun, pH 5.5 MES tamponunda saniyede 9.724 ila saniyede 97.245 arasında değişen saf bir hızla arttığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, aynı i-motif DNA'sı saniyede 63.209 oranında kesildiğinde floresan yoğunluğu artmamıştır, çünkü MES tamponunda pH 7.4'te katlanmaz. Saf akışa maruz kalan DNA i-motif moleküllerine ligand bağlanması değerlendirildi, bu da floresan yoğunluğunun artışının artan ligand konsantrasyonu ile daha az belirgin hale geldiğini gösterdi.Ligand ve i-motif arasındaki etkileşim için ayrışma sabiti belirlendi ve 34 mikromol olduğu bulundu. Bakır olan şelatlı i-motif, saniyede 63.209 kesme hızında açıldı ve serbest bırakılan bakır, florjenik tıklama reaksiyonunu tetikledi ve zamanla floresan yoğunluğunun artmasına neden oldu. İlk olarak, algılama alanının rotor ve stater arasında ayarlandığından emin olun.İkincisi, floresan arka planını kontrol edin ve en aza indirin. Son olarak, tıklama reaksiyonu gerçekleştirmeden önce reaksiyonu filtrelediğinizden emin olun. Bu yöntem, mekanik mukavemeti keşfetmek, her türlü polimeri katlamak ve açmak için bir ağ geçidi açar.Diğer DNA yapıları, proteinler veya diğer polimerler ve bunların diğer molekül türleriyle etkileşimleri olabilir. Söylendiği gibi, bu yaklaşım kullanılarak birkaç başka makromolekül incelenebilir.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu amaç, işletme ve roman yerçekimi kuvveti spektrometresi temsilcisi sonuçları gösteren bir adım adım kılavuz.

Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Burada bir atomik kuvvet mikroskopu (AFM) ile tek bir molekül kuvveti spektroskopi ölçümleri ile iyi tanımlanmış bir inorganik yüzey ve ya peptitler veya amino asitler arasındaki etkileşimlerin kuvvetini ölçmek için bir protokol mevcut. ölçümü ile elde edilen bilgiler, daha peptid inorganik madde interfazda anlamak önemlidir.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Öğrenin, DNA ve ligandlar arasındaki bağlanma etkileşimlerini yüksek verimli topluluk kuvveti spektroskopisi ile biyofiziksel çalışmalarda gerçek zamanlı algılama için nasıl incelenir.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Daha fazla video keşfet