Name: Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Keşfedin pankreas kanserinden zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreft modeli kurma yöntemini. Bu teknik, tümör mikroçevresini koruyarak kemoterapi duyarlılığını bir haftada değerlendirir ve kişiselleştirilmiş tıp için hasta yanıtını öngörür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Fondazione Pisa tarafından finanse edildi (proje 114/16). Yazarlar, hasta örneklem seçimi ve patoloji desteği için Azienda Ospedaliera Pisana Histopatoloji Birimi'nden Raffaele Gaeta'ya teşekkür eder. Ayrıca Alessia Galante'ye deneylerdeki teknik desteği için teşekkür ederiz. Bu makale, COST (European Cooperation in Science and Technology) tarafından desteklenen COST Action TRANSPAN, CA21116'in çalışmalarına dayanmaktadır.

İtalya Halk Sağlığı Bakanlığı, hayvanların kullanımı ve bakımına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktife uygun olarak açıklanan tüm hayvan deneylerini onayladı. Yerel Etik Kurul, çalışmayı 70213 kayıt numarası altında onayladı. İlgili tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Başlamadan önce, tüm çözeltiler ve ekipmanlar hazırlanmalı (bölüm 1) ve balıklar çaprazlanmalıdır (bölüm 2).
1. Çözeltilerin ve ekipmanların hazırlanması
NOT: Hazırlanacak çözümler ve ortamlar için Tablo 1'e bakınız.
<ol><li>Agarose jel desteği<ol><li>Agaroz tozunu mikrodalga fırınlanabilir bir şişede tartın ve% 1'lik bir jel yapmak için belirli bir hacimde E3 zebra balığı ortamında çözün. Agaroz tamamen çözünene kadar mikrodalgada ısıtın. NOT: Çözeltiyi fazla kaynatmayın.</li>
		<li>Erimiş agarozu bir Petri kabına dökün ve jel tamamen katılaşana kadar bekleyin.</li>
		<li>Ucu kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti kullanarak küçük agaroz silindirleri (~ 5 mm yüksekliğinde) yapın. Hazırlandıktan sonra, alüminyum folyoya sarılmış 4 ° C'de bir Petri kabında saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Cam mikro iğneler<ol><li>İnce iğneler elde etmek için borosilikat cam kılcal damarları bir çektirme ile çekin (ayarlar: HEAT 990, PULL 550). NOT: Bir kılcal damardan, uç çapı 10 μm olan iki ince iğne elde etmek mümkündür.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Balık geçişi ve yumurta toplama
<ol><li>Avdesh ve ark.17 tarafından tarif edildiği gibi, yetişkin balıkları doku implantasyonundan 3 gün önce üreme tanklarına aktarın.</li>
	<li>NOT: 1: 1 veya 2: 3 erkeklerin kadınlara oranı önerilir. Balık yoğunluğu, litre su başına maksimum beş balık olmalıdır. Erkekleri ve dişileri gece boyunca bir bariyerle ayrı tutun.</li>
	<li>Ertesi gün, bariyeri kaldırın ve balığın çiftleşmesine izin verin.</li>
	<li>Balıkları üreme tanklarından çıkarın ve onları muhafaza tanklarına geri koyun.</li>
	<li>Suyu üreme tankından ince bir ağ üzerinden dökün. Döllenmiş yumurtaları E3 zebra balığı ortamına sahip bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Petri kabını stereomikroskopla kontrol edin ve bulutlu yumurtaları atın. Döllenmiş yumurtaları taze E3 zebra balığı ortamında 28 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. Örnek toplama
NOT: Otoklav forseps ve neşter sapı.
<ol><li>Anında işleme<ol><li>Tümörün cerrahi örneğini 4 ° C'de 10 mL tümör ortamında toplayın (çapı 5 mm ila 10 mm arasında değişen tümör örneği). Numuneyi anında işleme için istenen yerden 4 °C'de aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Gece boyunca depolama (isteğe bağlı)<ol><li>Cerrahi tümör örneğini 10 mL tümör ortamında toplayın ve numuneyi gece boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>-80 °C'de depolama (isteğe bağlı, en az önerilen)<ol><li>Numuneyi -80 ° C'de,% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tümör ortamına sahip kriyojenik bir şişede saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Numune işleme
NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altındaki adımları uygulayın.
<ol><li>Tüm tümör dokusunu 5 mL taze tümör ortamı ile yıkayın, plastik bir Pasteur pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Yıkama ortamını aspire edin ve atın. Bu adımı 3x tekrarlayın. NOT: Plastik Pasteur pipete bağlı kalabileceğinden tümör dokusunun aspirasyonundan kaçının.</li>
	<li>Numuneyi bir Petri kabına aktarın ve 1-2 mL taze tümör ortamına batırın. Tümör örneğini bir neşter bıçağı kullanarak küçük parçalara (1-2 mm3) kesin ve tümör ortamına sahip steril 5 mL'lik plastik bir tüpe yerleştirin.</li>
	<li>McIlwain doku doğrayıcıyı 100 μm kalınlığa ayarlayın. Örnek parçalarını doğrayıcının dairesel plastik masasına yerleştirin ve doğrayın. Masayı 90° döndürün ve doğrama işlemini tekrarlayın.</li>
	<li>Parçaları 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.</li>
	<li>Parçaları floresan hücre izleyici, CM-DiI (Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde [DPBS]'de 10 μg / mL'lik son konsantrasyon), Koyu Kırmızı (DPBS'de 1 μL / mL'lik son konsantrasyon) veya CellTrace (DPBS'de 5 μM'lik son konsantrasyon) ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve tüpü 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Her 10 dakikada bir yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek parçaları yeniden askıya alın. NOT: CellTrace durumunda, üreticinin talimatlarına göre, inkübasyonun sonuna en az% 1 protein içeren ortam ekleyin.</li>
	<li>3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Dahil edilmemiş boyayı çıkarmak için bu adımı 3 kez 1 mL DPBS ile tekrarlayın.</li>
	<li>Parçaları 60 mm'lik bir Petri kabında 5 mL DPBS'de askıya alın. NOT: Dokunun kurumadığından emin olun.</li>
</ol>5. zPDX'in kurulması
NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altındaki adımları uygulayın.
<ol><li>Döllenmeden sonraki 2 gün (dpf) embriyoları E3 zebra balığı besiyerinde 0.16 mg/mL trikain ile uyuşturun.</li>
	<li>Bir Petri kabına üç agaroz silindiri (adım 1.1.3) koyun ve bir tarafı açığa çıkaracak şekilde bir silindir üzerine bir zebra balığı embriyosu koyun. Embriyoyu sadece ince bir filmde tutmak için fazla çözeltiyi çıkarın.</li>
	<li>Steril forsepsli lekeli doku parçasını Petri kabından embriyonun yattığı %1 agaroz desteğine aktarın. Dokuyu alın, embriyo sarısının üzerine koyun ve ardından ısıl olarak çekilen cam mikroiğneyi kullanarak perivitelin boşluğuna itin (adım 1.2.1).</li>
	<li>Sıvıya geri getirmek için embriyoya nazikçe birkaç damla E3% 1 penisilin-streptomisin (Pen-Strep) ekleyin.</li>
	<li>Tüm embriyolar için 5.2-5.4 adımlarını tekrarlayın ve son olarak, agaroz desteklerini Petri kabından çıkarın ve embriyoları 35 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Bir floresan stereomikroskop kullanarak implantasyondan 2 saat sonra embriyoları doğru ksenogreftler (pozitif boyama) için kontrol edin. Tamamen perivitelin boşluğunun içinde olmayan tümör fragmanlarına sahip embriyoları ve ölü embriyoları atın. Embriyoları, deneysel plana göre eşit olarak gruplara ayrılmış altı çok kuyucuklu plakaya (maksimum n = 20 embriyo / kuyu) rastgele dağıtın (örneğin, kontrol ve FOLFOXIRI).</li>
</ol>6. Tedavi
<ol><li>İlacı (örneğin, 5-florourasil, oksaliplatin, irinotekan) E3 %1 Pen-Strep'e seyreltin, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Usai ve ark.12 tarafından önerildiği gibi, eşdeğer plazma konsantrasyonuna (EPC) göre ilacın balık suyunda beş kat seyreltilmesini kullanın.</li>
	<li>Kokteyli hazırlamak için ilaçları karıştırın (örneğin, FOLFOXIRI).</li>
	<li>Medyayı her bir kuyucuktan çıkarın ve implantasyondan 2 saat sonra ilaç kokteylini ekleyin.</li>
	<li>Embriyoları 3 gün boyunca tedavi edin. İlaç kokteylini her gün yenileyin.</li>
</ol>7. Tam montajlı immünofloresan boyama
NOT: Başlamadan önce, -20 ° C'ye aseton yerleştirin ve Tablo 1'de listelenen çözeltileri hazırlayın.
<ol><li>1. Gün:<ol><li>Larvaları bir gecede 4 ° C'de cam şişelerde 1 mL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün:<ol><li>Larvaları 3 x 5 dakika 1 mL PBS ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>Gece boyunca -20 ° C'de 1 mL% 100 metanol içinde saklayın (veya uzun süreli depolama için).</li>
		<li>1 mL PTw (PBS'de %0,1 ara) ile 3 x 10 dakika rehidrasyon yapın, laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca pH 8.8'de 1 mL 150 mM Tris-HCl ile geçirgenleştirin, ardından 70 ° C'de 15 dakika ısıtın.</li>
		<li>2 x 10 dakikayı 1 mL PTw ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>2 x 5 dakikayı 1 mL dH2O ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>-20 ° C'de 20 dakika boyunca 1 mL buz gibi soğuk aseton ile geçirgenleştirin.</li>
		<li>2 x 5 dakikayı 1 mL dH2O ile yıkayın, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>2 x 5 dakikayı 1 mL PTw ile yıkayın, laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>Larvaları 1 mL blokaj tamponunda 4 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin, bir laboratuvar platformu rocker'ında (400 rpm) hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>Larvaları grup başına aşağıdaki gibi bölünmüş kuyu plakalarına yerleştirin: 96 delikli bir plakada 50 μL hacim / kuyucukta 10 larva veya 48 delikli bir plakada 100 μL hacim / kuyuda 20 larva.</li>
		<li>Bloke edici tamponu atın, larvaları karanlıkta 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon tamponunda seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi (örneğin, tavşan anti-insan parçalanmış kaspaz-3, 1:250) ile inkübe edin ve bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde hafifçe sallayın. Önerilen birimler için adım 7.2.11'e bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün:<ol><li>Larvaları sırayla 3 x 1 saat 1 mL PBS-TS (% 10 keçi serumu, PBS'de% 1 Triton X-100) ve daha sonra 1 mL PBS-T (PBS'de% 1 Triton X-100) ile 2 x 10 dakika ve 1 mL PBS-TS ile 2 x 1 saat yıkayın. Her yıkamada, larvaları içeren plakaları bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>Larvaları floresan boya konjuge ikincil antikorlarla (örneğin, Goat anti-Rabbit IgG [H + L] Çapraz Adsorbe Sekonder Antikor, Alexa Fluor 647, 1:500) ve 100 μg / mL Hoechst 33258 ile inkübasyon tamponunda seyreltilmiş olarak inkübasyon tamponunda gece boyunca 4 ° C'de, bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde nazik ajitasyonla inkübe edin. Sekonder antikor çözeltisinin önerilen hacimleri için adım 7.2.11'e bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün:<ol><li>3 x 1 saatini 1 mL PBS-TS ile ve 2 x 1 saatini 1 mL PTw ile, bir çalkalayıcı plaka (400 rpm) üzerinde hafif çalkalama ile yıkayın.</li>
		<li>Mikroskop slaytlarında emaye (~ 0.5-1 mm kalınlığında) ile dairesel bir tabaka oluşturun. Emayenin kurumasına izin verin ve larvaları dairesel tabakanın ortasına yerleştirerek ksenogreftin tarafını açığa çıkarın.</li>
		<li>Fazla çözeltiyi kurutun ve cam kapak kapağını suda çözünür, floresan olmayan bir montaj ortamı ile monte edin.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Görüntüleme
<ol><li>Konfokal mikroskopi altında 40x hedefle görüntü yakalayın. Aşağıdaki alma parametrelerini kullanın: 5 μm Z aralığına sahip 1024 x 512 piksel çözünürlük.</li>
</ol>9. ImageJ ile apoptozun analizi
<ol><li>ImageJ yazılımını yükleyin (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) ve Z-stack dosya görüntüsünü açın ( Dosya | Açık). Açılır pencerede, Yığın görüntüleme/Hyperstack'i seçin ve Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>Görüntü | Renk | Kompozit yapın.</li>
	<li>Z yığını görüntüsüne göz atmak ve ksenograft alanını (floresan hücre izleyici pozitif olan hücreler. Bkz. adım 4.5) zebra balığı perivitelin uzayında.</li>
	<li>Nokta Aracı'nı seçin ve Ek Video S1'de gösterildiği gibi apoptotik insan hücrelerinin sayısını (floresan hücre izleyici ve parçalanmış kaspaz-3'e pozitif) sayın.</li>
	<li>Nokta Aracı simgesine çift tıklayın, sayacı değiştirin ve toplam insan hücresi çekirdeği sayısını (CM-DiI pozitif hücrelerin çekirdekleri) sayın.</li>
</ol>

<ol><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li>
<li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2022%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li>
<li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer-A+disease+in+need%3A+Optimizing+and+integrating+supportive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li>
<li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Treatment+hurdles%2C+tumor+microenvironment+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li>
<li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+vs.+organoids%3A+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output%2C+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923(2020).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+models%3A+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677(2020).</li>
<li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551(2021).</li>
<li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229(2017).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%3A+interplay+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077(2021).</li>
<li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+patient-derived+xenografts%3A+the+best+laid+plans+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li>
<li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+%28CAFs%29+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li>
<li>Strähle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Kanser araştırmalarındaki in vivo modeller, kanser biyolojisini anlamak ve kanser tedavisi yanıtını tahmin etmek için paha biçilmez araçlar sağlar. Şu anda, farklı in vivo modeller mevcuttur, örneğin, genetiği değiştirilmiş hayvanlar (transgenik ve nakavt fareler) veya insan birincil hücrelerinden hasta kaynaklı ksenogreftler. Birçok optimum özelliğe rağmen, her birinin çeşitli sınırlamaları vardır. Özellikle, yukarıda belirtilen modeller, hastanın tümör dokusu mikroçevresini taklit etmek için güvenilir...

Klinik kanser araştırmalarının sorunlarından biri, kanserin tek bir hastalık değil, zamanla gelişebilen, tümörün kendisinin ve hastanın özelliklerine bağlı olarak spesifik tedaviler gerektiren çeşitli farklı hastalıklar olmasıdır1. Sonuç olarak, zorluk, kanser tedavisi sonuçlarının erken tahmini için yeni kişiselleştirilmiş stratejiler belirlemek amacıyla hasta odaklı kanser araştırmalarına doğru ilerlemektir2. Bu özellikle pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) ile ilgilidir, çünkü 5 yıllık sağkalım oranı% 11 olan tedavisi zor bir kanser olarak kabul edilir3.
Geç tanı, hızlı ilerleme ve etkili tedavilerin eksikliği PDAK'nın en acil klinik sorunları olmaya devam etmektedir. Bu nedenle asıl zorluk, hastayı modellemek ve kişiselleştirilmiştıp 4,5,6 doğrultusunda en etkili tedaviyi seçmek için klinikte uygulanabilecek biyobelirteçleri tanımlamaktır. Zamanla, kanser hastalıklarını modellemek için yeni yaklaşımlar önerilmiştir: hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) ve fare hasta kaynaklı ksenogreftler (mPDX'ler) bir insan tümör dokusu kaynağından kaynaklanmaktadır. Hastalığın nüksünün yanı sıra tedaviye yanıtı ve direnci incelemek için hastalığı çoğaltmak için kullanılmıştır 7,8,9.
Benzer şekilde, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreft (zPDX) modellerine olan ilgi, kanser araştırmaları için hızlı ve düşük maliyetli bir aracı temsil eden benzersiz ve umut verici özelliklerisayesinde artmıştır10 11,12. zPDX modelleri sadece küçük bir tümör numune boyutu gerektirir, bu da kemoterapinin yüksek verimli taramasını mümkün kılar13. zPDX modelleri için kullanılan en yaygın teknik, tümörü kısmen yeniden üreten, ancak tümör mikroçevresi eksikliği ve malign ve sağlıklı hücreler arasındaki çapraz iletişimin dezavantajlarına sahip olan birincil hücre popülasyonlarının tam numune sindirimine ve implantasyonuna dayanır14.
Bu çalışma, zPDX'lerin pankreas kanseri hastalarının kemosensitivite profilini tanımlamak için klinik öncesi bir model olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Değerli strateji, ksenograft işlemini kolaylaştırır, çünkü hücre genişlemesine gerek yoktur, bu da kemoterapi taramasının hızlanmasına izin verir. Modelin gücü, tüm mikro çevre bileşenlerinin hasta kanser dokusunda olduğu gibi korunmasıdır, çünkü iyi bilindiği gibi, tümörün davranışı etkileşimlerine bağlıdır15,16. Bu, literatürdeki alternatif yöntemlere göre oldukça elverişlidir, çünkü tümör heterojenliğini korumak ve tedavi sonucunun ve nüksün hastaya özgü bir şekilde öngörülebilirliğinin iyileştirilmesine katkıda bulunmak mümkündür, böylece zPDX modelinin koklinik çalışmalarda kullanılmasını sağlar. Bu makalede, bir parça hasta tümör rezeksiyonu ile başlayarak ve kemoterapiye yanıtı analiz etmek için tedavi edilerek zPDX modelinin yapımında yer alan adımlar açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>5-florourasil</td><td>Teva Pharma AG</td><td>SMP 1532755</td><td></td></tr><tr><td>48 çok kuyulu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>83 3923</td><td></td></tr><tr><td>96 çok kuyulu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz tozu&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Çekirdek Antikoru, klon 235-1</td><td>Merck</td><td>MAB1281&nbsp;</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Akvaryum ağı QN6</td><td>Penn-plax</td><td>0-30172-23006-6</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34567</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Koyu Kırmızı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>Bölünmüş Kaspaz-3 (Asp175) (5A1E) Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9661S</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem ITW Reaktifleri</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td>Dünya Hassas Aletleri</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit -&nbsp; Lederfolin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar, 3.5"</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Dış çap = 1.14 mm. İç çap = 0.53 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam şişeler ve nbsp;</td><td>VWR International</td><td>WHEAW224581</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan&nbsp; IgG&nbsp; (H+Lü) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21244&nbsp; &nbsp;</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Irinotecan</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük Sıcaklık Dondurucu Şişeleri</td><td>VWR International</td><td>479-1220</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Doku Doğrayıcı</td><td>Dünya Hassas Aletler Mikroplaka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karıştırıcı</td><td>SCILOGEX</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Oksaliplatin</td><td>Teva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3902500</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3901</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Pastör pipeti</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Mount</td><td>Tebu-bio</td><td>18606-5</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Merck</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı No 10 Steril Paslanmaz Çelik</td><td>VWR Uluslararası</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Neşter kolu #3</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Merck</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Dikey Mikropipet Çektirme Deklanşör</td><td>aleti</td><td>P-30&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

kemosensitivite testi için pankreas kanserinden zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreftlerin kurulması

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Kanser, dünya çapında başlıca ölüm nedenlerinden biridir ve birçok kanser türünün görülme sıklığı artmaya devam etmektedir. Tarama, önleme ve tedavi açısından çok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, kanser hastalarının kemosensitivite profilini öngören preklinik modeller hala eksiktir. Bu boşluğu doldurmak için, in vivo hasta kaynaklı bir ksenogreft modeli geliştirildi ve doğrulandı. Model, döllenmeden 2 gün sonra zebra balığı (Danio rerio) embriyolarına dayanıyordu ve bunlar bir hastanın cerrahi örneğinden alınan tümör dokusunun ksenogreft parçalarının alıcıları olarak kullanıldı. 
Ayrıca, tümör davranışını ve tedaviye yanıtı analiz etmek açısından çok önemli olan tümör mikroçevresini korumak için bioptik örneklerin sindirilmediğini veya ayrıştırılmadığını da belirtmek gerekir. Protokol, primer solid tümör cerrahi rezeksiyonundan zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftler (zPDX'ler) oluşturmak için bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bir anatomopatolog tarafından tarandıktan sonra, örnek bir neşter bıçağı kullanılarak diseke edilir. Nekrotik doku, damarlar veya yağ dokusu çıkarılır ve daha sonra 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm parçalar halinde doğranır. 
Parçalar daha sonra floresan olarak etiketlenir ve zebra balığı embriyolarının perivitelin boşluğuna ksenotransplante edilir. Çok sayıda embriyo düşük maliyetle işlenebilir, bu da zPDX'lerin çoklu antikanser ilaçlarına karşı kemosensitivitesinin yüksek verimli in vivo analizlerini sağlar. Konfokal görüntüler, kontrol grubuna kıyasla kemoterapi tedavisinin neden olduğu apoptotik seviyeleri tespit etmek ve ölçmek için rutin olarak edinilir. Ksenograft prosedürü önemli bir zaman avantajına sahiptir, çünkü tek bir günde tamamlanabilir ve ortak klinik çalışmalar için terapötik bir tarama yapmak için makul bir zaman aralığı sağlar.

Bu protokol, primer insan pankreas adenokarsinomundan zPDX'lerin oluşturulması için deneysel yaklaşımı açıklamaktadır. Bir tümör örneği, protokol bölüm 4'te açıklandığı gibi floresan boya kullanılarak toplandı, kıyıldı ve boyandı. zPDX'ler daha sonra, protokol bölüm 5'te açıklandığı gibi, 2 dpf zebra balığı embriyosunun perivitelin boşluğuna bir tümör parçasının implantasyonu ile başarılı bir şekilde kurulmuştur. Protokol bölüm 6'da açıklandığı gibi, zPDX'ler hasta kaynaklı kanser hücrelerinin kemoterapi duyarlılık profi...

Preklinik modeller, kanser biyolojisi bilgisini ilerletmeyi ve tedavi etkinliğini öngörmeyi amaçlamaktadır. Bu yazıda, zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftlerin (zPDX'ler) tümör doku fragmanları ile üretilmesi açıklanmaktadır. zPDX'ler, terapötik etkisi nakledilen dokunun hücre apoptozu açısından değerlendirilen kemoterapi ile tedavi edildi.

Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Zebra balığı hasta kaynaklı ksenogref, kanser hastası kemosensitivite profilini in vivo olarak tahmin etmek için güçlü bir klinik öncesi modeldir. Protokol, bir hastanın cerrahi örneğinden başlayarak modelin oluşturulmasını tanımlar. Hücreleri zebra balığı embriyolarına izole etmek yerine küçük bir doku parçasını ksenografize ederek, tümör ilerlemesi ve kemoterapiye yanıt için çok önemli bir adım olan tümör mikro ortamını korumak mümkündür.Modelin en büyük avantajı, hastanın prognozunu kişiselleştirilmiş tıp için bir araç olarak hareket eden sadece bir haftalık klinik ilgili bir zaman diliminde tahmin etme potansiyeli ile verilmektedir. Hastadan toplanan tüm tümör dokusunu beş mililitre taze tümör ortamı ile yıkayarak numune işlemeye başlayın. Plastik bir Pasteur pipet kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı pipet yapın.Yıkamayı üç kez tekrarlamadan önce yıkama ortamını dikkatlice aspire edin ve atın. Numuneyi bir ila iki mililitre taze tümör ortamına daldırın. Tümör örneğini bir neşter bıçağı kullanarak bir ila iki milimetrelik küp parçalarına bölün ve ardından tümör ortamına sahip steril beş mililitrelik plastik bir tüpe yerleştirin.McIlwain Doku Doğrayıcıyı 100 mikrometre kalınlığa ay

establishment-zebrafish-patient-derived-xenografts-from-pancreatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, zebra balığı hastasından türetilmiş bir ksenogreft modeli oluşturma tekniği açıklanmaktadır. Örnek protokolünde, Gemsitabin ve Navitoclax ilaçlarının pankreas tümörü ksenogreft modeli üzerindeki etkinliğini değerlendiriyoruz.

Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreft (zPDX): Bir Kanser Modeli

Bu videoda, in vivo tümör oluşumunu değerlendirmek ve terapötik ajanların etkisini incelemek için zebra balığı ksenogreft testi açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Ksenogreft Testi: Zebra Balığı İn Vivo Tedavisinde Terapötiklerin Tümörojenite Üzerine Anti-kanser Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, tümör hücrelerinin melanom taşıyan donör zebra balığı modelinden bağışıklığı baskılanmış bir alıcı Casper zebra balığına nakli yöntemi açıklanmaktadır. Alıcı balıklarda tümör aşılamasını ve proliferasyonunu görselleştirmeye yardımcı olur.

Subkutan Transplantasyon Testi: Melanom Hücrelerini Bir Donörden Bir Alıcıya Nakletmek İçin Bir Yöntem Zebra Balığı Modeli

Kanser hücrelerinin transplantasyonu, kanser mekanizmalarının ve terapötik tepkilerin tanımlanması için önemli bir araçtır. Mevcut teknikler, bağışıklık yetersiz hayvanlara bağımlıdır. Burada, tümör hücresi davranışının ve in vivo ilaç yanıtlarının uzun vadeli analizi için immün yetkin embriyolara zebra balığı tümör hücrelerini nakletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Bu protokol, ev sahibi olarak larva zebra balığı kullanarak virüs tabanlı çift floresan etiketli tümör xenograft modelinde optimizasyon prosedürlerini açıklar. Bu heterojen xenograft modeli Pankreatik kanser mikroçevre in vivo doku bileşimi taklit ve kişiselleştirilmiş zPDX içinde ilaç yanıtlarını değerlendirmek için daha hassas bir araç olarak hizmet vermektedir (zebrafish hasta tarafından türetilen xenograft) modelleri.

Karşılaştırmalı Ilaç değerlendirmesi için ev sahipleri olarak zebrafish larvaları kullanarak pankreas kanserinin hasta türevi heterojen xenograft modeli

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Bu protokol, geçici olarak bağışıklığı baskılanmış zebra balığı embriyolarında hücre hatlarından ve taze hasta materyalinden insan akut lenfoblastik lösemi (ALL) ksenogreftlerinin oluşturulması ve sorun giderilmesi için adım adım talimatların yanı sıra akış sitometrisi kullanılarak ilaç yanıtı değerlendirmesi için kılavuzlar sağlar. Deneysel boru hattı katı tümörler için de uyarlanabilir.

Zebra Balığı Embriyolarında Lösemi Hücre Greftleri Kullanılarak Hızlı İn Vivo İlaç Yanıtı Tahmini

Yeşil floresan protein ve lusiferaz muhabir ifade lentiviral parçacıklar ile hasta edilen ksenograftlan (PDXs) sabit etiketlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, birinci bölgede PDXs büyümesini izlemek, hem de in vivo görüntüleme sistemleri kullanarak kendiliğinden ve deney metastazları sağlar.

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

Keşfedin pankreas kanserinden zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreft modeli kurma yöntemini. Bu teknik, tümör mikroçevresini koruyarak kemoterapi duyarlılığını bir haftada değerlendirir ve kişiselleştirilmiş tıp için hasta yanıtını öngörür.

Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması

Daha fazla video keşfet