Name: Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Keşfedin, üç boyutlu organoid kültür yöntemiyle glioblastoma hücresel çeşitliliğini ex vivo koruma tekniğini. Bu model, tümör biyolojisini incelemek ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için araştırmacılara değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Justin Lathia'ya paha biçilmez tavsiyeleri ve sürekli desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca Katrina Fife, Lisa Wallace ve Maya Camhi'ye mükemmel teknik destekleri için teşekkür ederiz.

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells%3A+a+biomaterials+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Materials%22%5BJournal%5D)">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7(2018).</li>
<li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+glioblastoma%3A+is+it+working%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li>
<li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li>
<li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deadly+teamwork%3A+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li>
<li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li>
<li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li>
<li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li>
<li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li>
<li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li>
<li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li>
<li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416(2021).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li>
<li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+what+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).</li>
<li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.

GBM organoidleri, daha büyük hücresel ve mikroçevresel heterojenliği içeren geleneksel kürelere tamamlayıcı bir kültür yöntemidir 4,22,30. Daha fazla zaman ve kaynak yoğun olmasına rağmen, organoid kültür, tümör içi davranış ve ilaç direnci mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunabilir.
GBM, CSC 5,31'lik bir popülasyon tarafından yönlendirilmektedir ve bu yöntemler, buCSC popülasyonunun sürekli büyümesine ve kendini yenilemesine izin vermek için geliştirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörünün (FGF) kök hücre bakımını ve büyümesini arttırdığı ve aktif reseptör tirozin kinaz (RTK) sinyallemesi sağladığı bilinmektedir. GBM tümörleri içinde heterojen hücresel popülasyonların ve farklı tümör mikroortamlarının oluşumu, CSC davranışlarını desteklemeye dayanır. Bir lrECM seçimi, laminin bakımından zengin beyin ortamını taklit eder ve organoid kültürdeki hücrelerin kendi kendini organize etmesini ve istila yoluyla göç etmesini destekler. Her ne kadar bazı gruplar lrECM veya EGF / FGF zenginleştirilmiş medya24,28 kullanmadan organoid kültürü kurmuş olsalar da, bu kültür yönteminin daha zaman verimli bir yolunu ve büyümeyi yönlendirmek için onkojenik sinyallemenin daha güçlü seçimini sunabilir, bu yöntemler organoidlerin hücresel heterojenliğini en iyi şekilde oluşturmak için pro-kök hücre ortamını optimize etmek için seçilmiştir. Hem serebral organoidler hem de GBM organoidleri literatürde daha önce21,32,33 lrECM ile yapılmıştır. Organoidlerde bulunan tümör popülasyonları ve mekansal varyasyon ile ilgili veriler oluşturmamıza rağmen, organoidler içindeki tümör dışı popülasyonlar ve orijinal hasta örneklerinden ne kadar süre hayatta kaldıkları hakkında daha az şey bilinmektedir. Bazı IHC lekeleri (CD45 gibi) bu verileri sağlayabilir ve gelecekte organoidlerle ilgili ilginç bir araştırma noktası olabilir.
Organoid kültürün kullanım amacının bilinmesi, uygun yöntemlerin seçilmesi açısından önemlidir. Belirli deneyler için büyüyen üniform organoidlere karşı birincil örneklerden organoidlerin oluşturulması biraz farklı prosedürlere sahiptir. Organoidlerin lrECM iskelesinde nasıl olgunlaştığını ve görsel olarak nasıl doldurduğunu takdir etmek, organoid kültüre uygun zaman ve kaynakları tahsis edebilmek için önemlidir. Organoidlerdeki hücrelerin seyrek bölgeleri, numunenin davranışına bağlı olarak 2-8 hafta arasında herhangi bir yerde alabilen lrECM'yi doldurmak için yavaşça genişleyecek ve büyüyecektir. Bu büyüme oranı, her bir numuneye biraz özgüdür; farklı organoid grupları arasında korunur ve küre büyümesinin göreceli hızı ile oldukça tutarlıdır. Organoidler 1 yıldan fazla korunabilir ve ksenogreftte farelere tümör oluşum yeteneklerini koruyabilir; ancak, laboratuvar kaynaklarını (hem malzeme hem de zaman) boşa harcamamak için ayrı bir amaçla yetiştirilmeleri önerilir4. Organoid büyümesi birden fazla kuyucuk boyutu ve formatında test edilmiştir ve 10 cm'lik bir plakanın optimal hücre canlılığını korumak için ideal ayar olduğunu, ardından kuyu başına üç organoid içeren 6 delikli bir plakanın34 olduğunu göstermektedir. Organoidler, iki boyutlu kültür muadillerine kıyasla daha fazla ortam tüketir ve daha küçük bir kuyu formatı kullanmak uygun bakıma yol açmaz. Örneğin, 96 delikli formattaki bir plakanın bir kuyusu, organoid büyümeyi sürdürmek için bir organoidin boyutuna göre yeterli alana veya ortam hacmine sahip değildir.
Organoidlerin kurduğu gibi, gözlemci olmak başarıyı arttırmak için önemlidir. Başlangıçta, organoidler medyayı yavaş tüketir, ancak daha yoğun ve daha olgun hale geldikçe, medyayı daha hızlı tüketirler. Medyaya fenol kırmızısı eklemek, medya tüketiminin bir göstergesi olarak hizmet etmeye yardımcı olabilir. Medya daha sarı olduğunda, daha yüksek hacimli bir ortam değişimi, plakadaki toplam ortam miktarını artırmak, organoidleri büyümelerine ayak uydurmak için çoklu hücre kültürü plakaları arasında bölmek veya hatta deneyler için zaman çizelgesini ayarlamak için besleme düzenini ayarlamamızı isteyebilir. 
Birçok yönden, organoidler kanser araştırması yapmanın verimsiz bir yoludur. Uzun zaman ölçekleri içerirler ve GBM küre kültürüne kıyasla pahalı ve kaynak ağırlıklıdırlar. Bununla birlikte, hücresel ve mikro çevresel çeşitliliği yeniden yaratmak için alternatif bir yöntem olan hasta kaynaklı ksenogreftlerle karşılaştırıldığında, daha basit, daha ucuz ve kontrol edilebilirler. Organoidlerin en iyi ne zaman kullanılacağının seçimi kanser araştırmacıları için önemlidir. Geleneksel kürenin veya bağlı kültürün yerini alması ve ksenogreft modellerinin yerini alması amaçlanmamıştır. Organoidler, doğru bilimsel soruya uygulandığında, her iki sistemin faydalarını birleştirebilir ve aksi takdirde gizli kalacak tümör hücresi biyolojisini gözlemlememize izin verebilir. Bilimsel topluluk, organoidlerin hangi öğrenme fırsatlarını sunduğunu anlamaya yeni başlıyor, ancak gelecekte GBM'nin karmaşık biyolojisini anlamak için paha biçilmez bir araç olacakları açık.

Glioblastoma (GBM), tanıdan itibaren yaklaşık 15 aylık korkunç bir prognozu olan en sık görülen primer beyin tümörüdür1. Preklinik çalışmalarda etkili olan tedaviler genellikle hastalarda zayıf etkili olabilir 2,3. Zayıf klinik yanıt, GBM'nin mikroçevresel heterojenliği ve karmaşık tümöral içi etkileşimler de dahil olmak üzere birçok faktöre atfedilir. Bunların, geleneksel yapışkan veya küre kültürü yöntemleriyle laboratuvar ortamında yeniden oluşturulması zor olabilir4. GBM içinde kendi kendini yenileyen kanser kök hücrelerinin (CSC'ler) bir alt kümesinin varlığı da bu karmaşıklığa katkıda bulunabilir 5,6. CSC'ler tümör yayılımı için çok önemlidir ve aktif anjiyogenezi, kanser invazyonunu ve radyasyon dahil tedavilere direnci teşvik ederek tümör büyümesini sürdürür 7,8,9. CSC'ler tümörler boyunca eşit olarak dağılmamıştır, bunun yerine perivasküler niş ve perinekrotik bölgeler de dahil olmak üzere belirli mikro ortamlar içinde zenginleştirilmiştir ve her biri hücresel durumlarının10,11,12,13,14 farklı moleküler düzenlemesini sağlar. CSC'ler mikroçevresel ipuçlarının pasif alıcıları değildir, bunun yerine kendi mikro ortamlarını yeniden şekillendirme yeteneğine sahiptir 7,15,16. Bir CSC'nin mikro ortamı, besin kıtlığı, pH ve hipoksi17,18,19,20 gibi baskılara yanıt olarak kök hücre durumunun korunmasını teşvik edebilir ve bu koşulların model bir sistemde önemini düşündürmektedir. Bu nedenle, tümörlerdeki çeşitli hücresel mikro ortamın özetlenmesi, terapötik direnci anlamak ve yeni tedavileri tanımlamak için kritik öneme sahiptir.
Üç boyutlu kültürün popülaritesi son yıllardaartmıştır 21,22. Organoidler diğer kanser türlerinde kullanılmıştır ve hücreleri organoidler olarak tutmanın birincil amacı, heterojen hücre popülasyonlarının (birçoğu normalde daha homojen küre kültüründe rekabet edebilir) ve genetik özgüllüğe sahip bölgesel tümör mikro ortamları olarak görülen mekansal çeşitliliğin büyümesine izin vermektir 4,23,24,25,26 . Kanser hücrelerinin üç boyutlu kültürü için birçok yöntem vardır, bunların her birinin avantajları ve dezavantajları vardır27,28,29. Organoid kültürün, geleneksel yapışkan veya küre kültürünün yerini alması amaçlanmamıştır. Hücre mikroçevresi ile tümör hücresi yanıtları arasındaki etkileşimin kritik olduğu spesifik sorular olduğunda iki boyutlu yöntemlere tamamlayıcı bir teknik olarak en iyi şekilde kullanılır.
Bu makalede, birincil hasta örneklerinden veya hasta kaynaklı kültürlerden GBM organoidleri oluşturmak için güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemler açıklanmaktadır. Üç boyutlu organoid kültür için iki farklı hedefi ele alıyoruz: (1) birincil hasta dokusundan, tekdüzelikten bağımsız olarak maksimum engraftment potansiyeline sahip organoidlerin oluşturulması veya (2) daha kantitatif deneysel kullanım için üniform organoidlerin yetiştirilmesi. Birincil bir örneği organoidler olarak oluştururken, tek hücreler için filtrelemek veya hücreleri saymak gerekli değildir, çünkü başlangıç kültürünü oluşturmak için maksimum hücre sayılarını ve türlerini korumak bir önceliktir. Bununla birlikte, karşılaştırmalı deneyler için organoidler yetiştirilirken, replikasyon organoidlerinin deneysel tutarlılık için karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için tek hücreli filtrasyon ve hücre sayımı gereklidir. Bu protokol, organoid kültürlerin nasıl oluşturulacağını ve üniform organoidlerin nasıl oluşturulacağını, ayrıca organoidlerin gömülmesi ve korunması için rafine edilmiş yöntemleri ve immünohistokimya, immünofloresan ve GBM organoidlerinde toplam hücre canlılığının değerlendirilmesi dahil olmak üzere standart hücre kültürü deneylerini detaylandırmaktadır.

<table><tbody><tr><td>3,3-Diaminobenzidin (DAB) tabletleri</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>08980681</td><td>3,3-Diaminobenzidin (DAB) tabletleri</td></tr><tr><td>96 oyuklu PCR plakaları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>96 oyuklu PCR plakaları</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>Hücre ayırma solüsyonu</td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Antibiyotik-antimikotik</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi eksi A vitamini</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>B-27 takviyesi eksi A vitamini (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Mavi Leke Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>Bluing reaktifi</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci (70 & mikro; m)</td> <td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>Hücre süzgeci (70 & mikro; m)</td></tr> <tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Lüminesan hücre canlılık deneyi</td></tr><tr><td>Arıtıcı 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>Nükleer hematoksilen arındırıcı reaktif</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>ksilen ikamesi</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hematoksilen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Hematoksilen</td></tr><tr><td>Glutamin %0,85 NaCl içinde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>%0,85 NaCl (200 mM) içinde glutaminMatrigel</td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>Lamininle zenginleştirilmiş hücre dışı matris</td></tr><tr><td>Mini PAP kalemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>Hidrofobik bariyer kalemi</td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>Montaj ortamı</td></tr><tr><td>Neurobazal medya eksi fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Nörobazal medya eksi fenol kırmızısı (500 mL)</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Normal eşek serumu (NDS)</td></tr><tr>PBS <td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2'de</td> <td>paraformaldehit</td> %<td>4 Paraformaldehit PBS Fenol kırmızısında %4</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Fenol kırmızısı (%0,5)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td> ile ProLong Altın Antifade <td>Mountant Sıvı kürleme mountant</td></tr><tr><td>Rekombinant insan EGF proteini</td><td>R& D sistemleri</td><td>236-EG-01M</td><td>Rekombinant insan EGF proteini (250 & mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Rekombinant insan FGF temel</td><td>R& D sistemleri</td><td>4144-TC-01</td><td>Rekombinant insan FGF temel (250 & mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>SignalStain Antikor Seyreltici</td><td>Hücre Sinyali</td><td>8112</td><td>Antikor seyreltici</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC Algılama Reaktifi</td><td>Hücre Sinyali</td><td>8114</td><td>İmmünohistokimya tespit reaktifi</td></tr><tr><td>SignalStain Sitrat Maskeleme</td><td>Çözme Çözeltisi Hücre Sinyali</td><td>14746</td><td>Sitrat maskeleme çözümü</td></tr><tr><td>Tek kenarlı tıraş bıçağı</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>Tek kenar tıraş bıçağı</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Sodyum piruvat (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Tek kullanımlık kriyokalıplar</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Bileşik</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Optimum kesme sıcaklığı bileşiği</td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Hücre geçirimsiz leke (%0,4)</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Ksilen</td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu organoid kültür kullanarak İnsan glioblastoma hücresel Çeşitliliğinin ex vivo korunması

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Glioblastoma (GBM), son derece kötü prognozu ile en sık görülen primer malign beyin kanseridir. İntra-tümöral hücresel ve moleküler çeşitliliğin yanı sıra tümör mikro ortamları arasındaki karmaşık etkileşimler, etkili tedaviler bulmayı zorlaştırabilir. Geleneksel yapışkan veya küre kültürü yöntemleri bu tür karmaşıklıkları maskeleyebilirken, üç boyutlu organoid kültür bölgesel mikro çevresel gradyanları özetleyebilir. Organoidler, hasta tümör mimarisini daha iyi taklit eden, fenotipik olarak çeşitli hücre popülasyonları içeren ve orta verimli deneyler için kullanılabilen üç boyutlu GBM kültürünün bir yöntemidir. Üç boyutlu organoid kültür, geleneksel kültüre kıyasla daha zahmetli ve zaman alıcı olmasına rağmen, benzersiz faydalar sunar ve akım in vitro ve in vivo sistemler arasındaki boşluğu kapatmaya hizmet edebilir. Organoidler, tümör davranışını ve direnç mekanizmalarını daha iyi anlamak için kanser biyologlarının cephaneliğinde paha biçilmez araçlar olarak kendilerini kanıtlamışlardır ve uygulamaları sadece büyümeye devam etmektedir. Burada, GBM organoidlerinin üretilmesi ve bakımı için yöntemler hakkında ayrıntılı bilgi verilmektedir. Hem dondurulmuş hem de parafin gömme teknikleri kullanılarak organoid numune gömme ve bölümlemenin nasıl yapılacağına dair talimatların yanı sıra organoid kesitlerde immünohistokimya ve immünofloresan protokolleri için öneriler ve toplam organoid hücre canlılığının ölçülmesi de açıklanmaktadır.

Şekil 1 , ışık mikroskobu ile 10x büyütmede görülen erken organoid büyümeyi göstermektedir. Şekil 1A, merkez görünümde lrECM aracılığıyla tek hücrelerin göçünü ve istilasını göstermektedir. Hücreler lrECM'yi genişletmeye ve 'kolonize etmeye' devam edecek ve görsel inceleme ile daha yoğun ve sonunda opak görünecekler. Şekil 1B, bir kuruşun boyutuna göre büyütme olmadan birkaç olgun organoid (7 haftada) göstermektedir.
Şekil 2 , aktif proliferasyonun bir belirteci olan fosfo-histon H3 için GBM organoidlerinin immünohistokimyasal boyanmasını göstermektedir. En yüksek proliferatif hücreler, organoid çekirdeğe kıyasla organoid çevrede görülür. Pozitif boyama kahverengi/bakır bir görünüme sahip olacaktır.
Şekil 3, GBM organoidlerindeki toplam hücre sayısını, 3D'ye özgü ışıldayan hücre canlılığı testi kullanarak homojenize etme ve ölçme işlemini açıklamaktadır. GBM organoidlerinde bulunan çok sayıda hücre nedeniyle, daha büyük organoid yapı başlangıçta ışıldayan tahlil reaktifinde tritüre edilerek homojenize edilir. Daha sonra toplam organoid lizatın fraksiyonları ayrı kuyucuklara yüklenir ve inkübasyondan ve uygun bir çok kuyucuklu plaka okuyucuda okunmadan önce ek ışıldayan tahlil reaktifi ile seyreltilir.
Şekil 4 , organoidler için DMSO (ortak araç) kontrol verilerini temsil etmektedir. Çizilen veriler intra-organoid ve inter-organoid tutarlılığı göstermektedir. Işıldayan canlılık verileri tipik olarak deneysel veriler üretilirken her numune için kontrollere normalleştirilecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Şekil 1: Işık mikroskobundan görünüm (10x). (A) Laminin bakımından zengin hücre dışı matriks boyunca GBM hücrelerinin göçünü / istilasını gösteren erken organoid büyüme. (B) Bir kuruşun büyüklüğüne göre olgun organoidler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Şekil 2: GBM organoidlerinin immünohistokimyası. (A, B) Aktif proliferasyon için fosfo-histon H3 boyalı hücreleri gösteren GBM organoidleri. Ölçek çubukları, A ve B için sırasıyla 600 μm ve 300 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Şekil 3: Organoidler için ışıldayan hücre canlılığı protokolü . (A) Tek tek organoidleri küçük santrifüj tüplerine taşıyın ve fazla ortamı çıkarın. (B) Organoidi parçalamak için her tüpe ve pipete agresif bir şekilde 500 μL 1:1 PBS ve ışıldayan hücre canlılığı testi karışımı ekleyin. (C) Bu organoid karışımın 25 μL'sini ve aynı 1: 1 PBS ve ışıldayan hücre canlılığı tahlil karışımının 75 μL'sini 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. (D) 2 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin, ardından RT'de 20 dakika inkübasyon yapın ve ardından bir plaka okuyucuda ışıltıyı okuyun. Şekil BioRender.com kullanılarak yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Şekil 4: Hücre canlılığı. Dört hasta örneği için dört organoidin altı teknik kopyası için% 0.1 dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki organoidler için hücre canlılığı verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr><tr><td>Nörobazal orta eksi fenol kırmızı</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr><tr><td>B-27 takviyesi eksi A vitamini (50x)</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik (100x)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Sodyum piruvat (100 mM)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>%0.85 NaCl (200 mM) cinsinden glutamin</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Rekombinant insan FGF bazik (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Rekombinant insan EFG proteini (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Fenol kırmızısı</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Nörobazal ortam tam (NBMc) formülasyonu
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Saat</td>
		</tr><tr><td>P Etanol</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>u Etanol</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Burada, birincil hasta örneklerinden veya hasta kaynaklı hücre kültürlerinden glioblastoma (GBM) organoidleri üretme ve olgunluğa kadar sürdürme yöntemini açıklıyoruz. Bu GBM organoidleri fenotipik olarak çeşitli hücre popülasyonları içerir ve tümör mikroortamlarını ex vivo olarak yeniden yaratır.

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Glioblastoma için tedavi bulmak, tümörlerde var olan hücresel çeşitlilik ve çeşitli mikro ortamlar arasındaki etkileşimler nedeniyle zordur. Organoidler bu mekansal çeşitliliğin bir kısmını yeniden yaratmaya yardımcı olabilir ve bunu tümörlerin biyolojisini daha iyi anlamak için kullanabiliriz. Geleneksel hücre kültürü yöntemleri homojen tümör hücresi popülasyonları üretme eğilimindeyken, organoidler glioblastomun moleküler ve hücresel çeşitliliğini daha iyi taklit edebilir ve intratümöral etkileşimleri daha iyi modelleyebilir.Organoidler ilaç etkinliğini ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. Klinik tedavilere direnç, bu hastalığın klinik gerçekliğini yansıtan geleneksel küre kültüründe değil, sadece organoidlerde ortaya çıkabilir. Organoidler, kemoterapilerin bölgesel etkilerini göstermeye yardımcı olabilir.Yeni niş spesifik terapileri keşfetmek için kullanılabilirler ve gelecekte kişiselleştirilmiş tıp için öngörücü bir araç olarak da hareket edebilirler. Organoidleri oluşturmak için kullanılan bazı malzemeler sıcaklığa duyarlıdır ve bu malzemeleri uygun sıcaklıklarında tutmayı ihmal etmek, organoidlerin oluşturulmasında veya korunmasında zorluklara yol açabilir. Balmumu kağıdını parafilm tabakasından çıkarıp iki steril 96 delikli polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR plakası arasına yerleştirerek organoid kalıpları bir kültür başlığı altında hazırlamaya başlayın.Parafilmin içinin temiz olduğundan emin olun. Parafilmde delik açmadan iki milimetre derinliğinde küçük çukurlar oluşturmak için üst plakaya eşit basınç uygulayın. Plakaları ayırın.Çukurlu parafilm üst plakaya yapışacaktır. Ardından üst plakayı 30 saniye boyunca kuru buz üzerine yerleştirin. Parafilmi üst plakadan hızlı bir hareketle çekmek için steril forseps kullanın.Dondurulmuş parafilmin çıkarılması daha kolaydır. Tamamlanan parafilm kalıbını kaplı, steril 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Tek hücreli süspansiyonu glioblastoma veya GBM yapışkan kültürden hazırlamak için, kullanılan ortamı plakadan çıkarın.Daha sonra plakaya oda sıcaklığında iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve plakayı üç dakika boyunca 37 derecede inkübe edin. Mikroskop altında plakadan hücre ayrılmasını doğruladıktan sonra, hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için sekiz mililitre Nörobazal Orta tam veya NBMc ortamı ekleyin. Süspansiyonu 70 mikronluk tek bir hücre süzgecinden süzün.Hücreleri beş dakika boyunca 120 kez G'de döndürün. Daha sonra süpernatantı çıkarın ve hücreleri bir mililitre NBMc'de yeniden askıya alın.Tek hücreli bir süspansiyondan organoidler yapmak için, bir buz kovasında veya soğuk blokta küçük bir santrifüj tüpüne uygun miktarda laminin bakımından zengin hücre dışı matris veya lrECM ekleyin. Organoid başına 20.000 hücre içeren bir hücre karışımı hazırlayın. Hücrelerin yerleşmesini önlemek için lrECM hücre süspansiyon karışımını iyice karıştırın, bu da düzgün olmayan organoid oluşumuna neden olur.Daha sonra, inci benzeri bir damlacık oluşturmak için karışımın 20 mikrolitresini bir parafilm kalıbına dikkatlice pipetleyin. LrECM polimerizasyonunu önlemek için pipet ucunu her iki ila üç organoidde bir soğuttuğunuzdan emin olun. İstenilen sayıda organoid, 10 santimetrelik bir kültür plakasında parafilm kalıbına pipetlendikten sonra, organoidleri bir hücre kültürü inkübatöründe bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Organoidler katılaştıktan sonra, organoidleri bir P1000 ucu kullanarak NBMc ortamı ile parafilm kalıbından yavaşça yıkayın ve bunları 20 mililitre NBMc içeren yeni bir 10 santimetrelik kültür plakasına toplayın. Dört gün sonra, plakadaki ortamı değiştirin.Bunu yapmak için, hücre kültürü plakasının altına bir parça koyu renkli kağıt yerleştirin. Plakayı eğin ve 20 saniye bekleyin. Organoidler kabın dibine tamamen yerleştikçe, ortamı büyük açılı bir cam pipetle yavaşça çıkarın.Yeni medya ekledikten sonra, plakayı inkübatöre 80 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve bundan sonra her iki ila üç günde bir ortam alışverişinde bulunun. Organoidin büyümesi ışık mikroskobu kullanılarak gözlendi. Merkez görünümde, erken organoid büyümesi lrECM yoluyla göç ve tek hücreli invazyon gösterdi.Yedi haftadaki olgun organoidler bir kuruşun büyüklüğüne göreydi. GBM organoidlerinin fosfo-histon H3 ile immünohistokimyasal boyanması, organoid çevrede çekirdeğe kıyasla kahverengi veya mor görünümlü oldukça proliferatif hücreler ortaya çıkardı. %0.1 DMSO'daki organoidler için hücre canlılığı verileri, intraorganoid ve interorganoid tutarlılık göstermiştir.Organoid biyokütle ve medya asitlenmesine dikkat edin. Organoidler ortamdan çok hızlı geçiyorsa, medyayı daha sık değiştirdiğinizden veya organoidleri ek plakalar arasında böldüğünüzden emin olun. Olgun organoidler, terapilerle yapılan deneyler için kullanılabilir veya immünohistokimya veya immünofloresan ile kullanım için gömülü ve kesitli olarak kullanılabilir.Ayrışmış organoidler FACS analizi için kullanılabilir. Bu organoidler son zamanlarda mekansal olarak farklı kanser kök hücre nişlerinde gerekli olan hedefleri keşfetmek için üç boyutlu fonksiyonel taramada kullanılmıştır. Bu modelleri, in vivo testlerden önce farklı ilaçlara ve tedavilere öncelik vermek için de kullanıyoruz.

maintaining-human-glioblastoma-cellular-diversity-ex-vivo-using-three

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Video, glioblastoma dokusundan organotipik dilim kültürlerinin oluşturulmasını ve sürdürülmesini göstermektedir. İzole edilen doku bir agaroz matrisine gömülür ve bir vibratom kullanılarak ince kesitler elde edilir. Bu bölümler daha sonra bir mikroplaka içindeki geçirgen membran eklerine yerleştirilir ve uzun süreli bakım için bir dilim kültür bakım ortamında kültürlenir.

İnsan Glioblastoma Dokusundan Dilim Kültürlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi

Bu videoda, tek hücreli süspansiyondan beyin tümörü organoidlerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi anlatılmaktadır. Besinler için bir iskele ve kültür ortamı olarak laminin açısından zengin bir hücre dışı matris kullanılarak, hücrelerin organoid içinde çoğalması ve kendi kendini organize etmesi kolaylaştırılır. Sonuç olarak, hücresel çeşitliliği ve beyin tümörlerinin mikro çevresini taklit eden ex vivo organoidler üretilir.

Beyin Tümörü Hücre Süspansiyonundan Organoid Kültür Oluşturma

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Glioblastoma multiforme'nin hasta kaynaklı ksenogreftleri, 3D insan biyojel kültür sistemi kullanılarak canlı mikrotümörlere minyatürleştirilebilir. Bu in vivo benzeri 3D tümör testi, kinom analizi de dahil olmak üzere ilaç yanıt testi ve moleküler profilleme için uygundur.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Bu çalışma, bir doku kıyıcı kullanarak hasta kaynaklı glioblastoma 3 boyutlu organoidler oluşturmak için otomatik bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, terapötik testler için bu tür organoidleri elde etmek için uygun ve etkili bir yaklaşım sağlar.

Ex Vivo Hastadan Elde Edilen Glioma Organoidlerinin Bir Doku Kıyıcı Kullanılarak Yetiştirilmesi

IDH1-mutant diffüz düşük dereceli gliomlar kültüre edilmesi zor olan nadir tümörlerdir. IDH1 mutant protein ekspresyonunu koruyan ve kültürleri aylarca sürdüren basit, enzimatik olmayan bir eksplant yöntemi sunuyoruz. Daha da önemlisi, bu teknik dondurularak saklanmış tümörlerle çalışır ve glioma araştırmaları için değerli bir kaynak sunar.

IDH1-mutant Diffüz Düşük Dereceli Gliomların Eksplant Kültürleri için Bir Protokol

Burada, genotip-fenotip bağımlılıklarını araştırmak ve glioblastoma tedavisi için potansiyel ilaçları taramak için laboratuvar mühendisliği glioblastoma organoidleri (LEGO) üretmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.

Laboratuvar Mühendisliği: Glioblastoma Organoid Kültürü ve İlaç Taraması

Keşfedin, üç boyutlu organoid kültür yöntemiyle glioblastoma hücresel çeşitliliğini ex vivo koruma tekniğini. Bu model, tümör biyolojisini incelemek ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için araştırmacılara değerli bir araç sunar.

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Daha fazla video keşfet