Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Merhaba, benim adım Matt Lui. Rockefeller Üniversitesi'nde Leslie Sal'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Ve bugün size larva kemotaksisini incelemek için yaptığımız deneylerden bahsetmek istiyorum.

İlgilendiğimiz sorun, oldukça basit. Aslında bu kurulumda burada temsil edilmektedir. Az önce bir grup Joseph Larvasını bu agros yüzeyine transfer ettim.

Bu ortam oldukça düşmanca ve açlıktan ölmek üzereler. Her nasılsa, bu hayvanların en yakın besin kaynağına giden yolu bulmaları gerekecek ve burada larvaları çekecek muz yayan bir koku var. Bu ortam, kemotaksis davranışını incelemek için ideal değildir, bu nedenle ilk gelişme, muzu bir kimyasalla değiştirmek olacaktır.

Bu kimyasal izo asetattır ve muzda baskın olan aromalardan biridir. Yani bu bizim yapay lezzetimiz ve bunu kullanarak koku alma uyaranını çok daha iyi kontrol edebiliyoruz. Bir sonraki iyileştirme, kapalı bir ortam kullanmak ve diğer dağılımdaki dalgalanmayı bu şekilde önlemeye çalışmaktır.

İşte uzun zamandır laboratuvarda kullandığımız tahlil. Bu, dibinde agarro yüzeyi olan bir Petri kabıdır. Agarro, larvaların kemoterapi atakları için idealdir çünkü onları nemli tutar.

Plakanın iki tarafında, Teflon'dan yapılmış başka bir kapak buluyorsunuz ve şimdi yapacağımız şey, bir tarafta asetat veya isam asetat tanıtmak ve diğer tarafta sipariş yok. Bu yapıldıktan sonra, fikir petro kabını kapatmak, kokunun yayılması için biraz zaman beklemek ve ardından kabı açmaktır. Burada bir hayvanı tanıtın ve hayvanın belirli bir süre hareket etmesine izin verelim.

Bu tahlil, tabağın bir tarafına koku ekleyerek, oldukça hızlı bir şekilde kurulan ve test süresi boyunca sabit kalacak bir gradyana sahip olduğumuz varsayımına dayanmaktadır. Şimdi asıl sorun, hiç kimsenin gradyanın plakada var olduğunu göstermemiş olmasıdır. Eklenmesinden çok hızlı bir şekilde sonra olabilir mi?koku, plaka içinde homojen bir dağılıma sahip olabilirsiniz.koku gradyan çok sığ olacak şekilde veya gradyanın oluşturulması için birkaç dakika gerekebilir.

Bu elbette esas olarak buhar basıncına bağlı olacaktır.koku kullanılmakta olan. İkinci konu, deney sırasında neyin ölçüldüğü ile ilgilidir. Bir hayvanın buradan başladığını hayal edin, X ve üç dakika sonra bu uç plakada, kırmızı X'te bulunur.

Yapabileceğiniz bir şey, hayvanın son pozisyonunu yalnızca belirli bir süre sonra, üç veya beş dakika sonra kaydetmektir. O zaman yakalayacağınız tek bilgi başlangıcın konumudur ve hayvanın zaman içindeki davranışı hakkında iyi bir çözünürlüğe sahip olmanın önemli olduğuna inanıyoruz. Örneğin, bir hayvan buradaki gibi başlangıç pozisyonundan bitiş pozisyonuna zorlukla hareket etmiş olabilir ya da theodor'u çevreleyen bölgeyi önemli bir süre boyunca çok iyi bir şekilde ziyaret etmiş ve deneme bitmeden geri vermiş olabilir.

Bu iki durumdan çıkaracağımız sonuç çok farklıdır. Bir durumda, hayvan uyarana cevap vermemiş olabilirken, diğer durumda kesinlikle cevap vermiştir. Elde etmeye çalıştığımız iki iyileştirme, birincisi, arenadaki diğer gradyanın şeklini ve stabilitesini kontrol etmek.

İkincisi, hayvanın davranışını gerçek zamanlı olarak takip edin ve tüm bu bilgileri saklayın. Bir sonraki bölümde, Sylvia size sipariş seyreltmesini nasıl hazırladığımızı sunacak. Benim adım S ti.

VAs laboratuvarında malzeme lui için çalışan bir araştırma görevlisiyim. Bugün size hayvanları izlemek için kullandığımız oda sistemi için malzemeleri nasıl hazırlayacağınızı göstereceğim. Hazne sistemimizle ilgili temel sorun, havada dağılmış koku kullanmamızdır.

Bu, örneğin, kullandığımız agros plakaları düz değilse, deneyler arasında dalgalanmalar ve konsantrasyon elde edebileceğiniz ve bu da sisteme gürültü sokacağı anlamına gelir. Bu yüzden size göstereceğim ve sistemdeki gürültüyü azaltmaya çalışmak için size küçük ipuçları vereceğim. Bu nedenle, koku seyreltmenizi hazırlamak için kullanılan malzemeler bir cam kavanozdur, ilgilendiğiniz kokunun bir kısmı ile hafif reaktif kokular kullanıyorsanız, tercihen karartılmış camdır.

Bu alikotu hazırlamak için cam pipetler ve yeterli bir mekanik pipet yardımcısı. Daha sonra parafin yağı pipet uçları, standart pipet adamınız ve seyreltme için küçük şişeler. Bir kez daha, bunların cam olması ve tercihen karartılması ve ardından doğru ölçümler yapmak ve deneyler arasındaki gürültüyü azaltmak için bir tartı olması gerekir.

Kokular oldukça uçucu olduğundan ve bazıları toksik olduğundan, bir başlık içinde yapılırlar. Bir koku seyreltmesini onarmanın ilk adımı, seyrelteceğiniz kokuyu ortadan kaldırmaktır. Doğru seyreltmeler hazırlamak ve deneyler arasındaki değişimi en aza indirmek için her şeyi tartmak gerekir.

Bu nedenle, bir molar etil bütirat konsantrasyonu yapacak şekilde etiketleme ile başlayın. İlk önce parafin yağını hazırlarsınız. Parafin yağı çok viskozdur, bu nedenle pipet ucunu parafin yağına mümkün olduğunca az daldırmaya çalışmak önemlidir, sadece parafin yağını herhangi bir kabarcık oluşturmadan emebilecek kadar.

O zaman şişenin yan tarafındaki fazla paren yağını silmek iyidir. Bir kez daha, paren yağı viskoz olduğu için, yavaşça şişeye bırakmak çok önemlidir. Para yağını şişenize pipetledikten sonra ucunu hemen atmayın çünkü ucun dibinde daha fazlası toplanacaktır.

Seyreltmeye başlamadan önce, ekleyeceğiniz paren yağının hacmini ve aynı zamanda ağırlığını zaten ölçtüğünüz yerlerde bir hesaplama sayfası hazırlamak ve ardından kokunuz için de ağırlıkla aynı şeyi yapmak iyidir. Bu şekilde sahip olduğunuz tartıyı, ihtiyacınız olan tüm parafin yağını ve tüm kokuyu kontrol edebilirsiniz. Gerekirse, daha fazla paren yağı dökün ve doğru ağırlığa ulaşana kadar yeniden ölçün.

Doğru paren yağı ağırlığına sahip olduğunuzda, yapmanız gereken tek şey aynı prensipleri kullanarak koku verici eklemektir. Anlaşıldı. Burada larvaların izleme için nasıl hazırlanacağını göstereceğim.

Genellikle altı günlük larvaları kullanırız. Bunu yapıyoruz çünkü yazılımımız tarafından kolayca alınabilecek kadar büyükler ve ayrıca larvalarınızın izlemede kullanılamayacak kadar yaşlı olup olmadığını söylemek için hala çok aktifler, sadece duvarlara tırmanan larva olup olmadığını kontrol etmeniz gerekiyor. Duvara tırmanan larvalar varsa, o zaman çok yaşlıdırlar ve özellikle aktif olmayacaklardır.

Larvalarınızı hazırlamanın ilk adımı, onları% 15 sakarozun içine batırmaktır. % 15 sakkaroz kullanmamızın nedeni, larvaların bu çözeltide Boyd olması ve bunun yerine yiyeceğin ya kısmen çözünmesi ya da dibe düşmesidir. Yeterince sakaroz döküyorsunuz, öyle ki, şişenizin veya şişenizin üstünden bir inçten biraz daha az olduğunu biliyorum.

Sonra bir spatula alırsın. Larvaların yüzdüğünü zaten görebiliyorsunuz ve yiyeceği kazan hayvanları çıkarmak için yiyeceği nazikçe kazıyorsunuz, onları yiyeceklerden ayırmak için biraz döndürüyorsunuz ve sonra birkaç dakika oturtuyorsunuz. Yiyecek ve larvalar yeterince ayrıldıktan sonra, önceden etiketlenmiş bir Petri kabı alın ve bunları bip sesi kısmına dökün.

Petri kabının üst kısmını suyla dolduracağınız için saklayın ve izlenen larvalar için bir kap olarak kullanın, böylece hangilerini takip ettiğinizi ve hangilerini izlemediğinizi ayırabilirsiniz. Artık larvaları petri kabına döktüğünüze göre, sakaroza adapte olmaları ve açlık durumuna gelmeleri için 30 dakika beklemeniz gerekir. Bu, larvaların adapte olduğu 30 dakika boyunca izleme kurulumunda daha iyi davranacakları anlamına gelir.

Sükroz, plakaları izlemeye hazırlamak için iyi bir andır. Yani bunlar 96 kuyu plakasının üst kısımları. Bunları ayrı olarak satın alabilirsiniz ve bu, zaten ısıtılmış olan %3'lük bir aros çözeltisidir.

% 3 kullanıyoruz çünkü larvaların kazmasını engelliyor, ama aynı zamanda üzerinde yürüyebilmeleri ve her tabak üstünde nemli kalabilmeleri için yeterince yoğun. 25 mil agros pipetlemek istiyorsunuz. Jelde büyük kabarcıklar oluşmasını önlemeye çalışmak önemlidir.

Plakaları düz bir yüzeye yerleştirmek de önemlidir, aksi takdirde eğimli olan ve larvaların davranışını etkileyebilecek jelleri artırabilirsiniz. Aros sertleştikten sonra üst kısımları üst üste koyup kurumasını önlemek için soran sargıya sarıyoruz. Bu, onları birkaç gün boyunca izlemek için iyi bir durumda tutmalıdır.

Bu sırayla, size daha önce bahsettiğim benzin tabağı testinden biraz farklı olan davranışsal testimizi sunacağım. İhtiyacınız olan şey, 96 kuyulu plakanın yanı sıra agro tabakasını içerenlerdir. Tahliller, üst üste yığılmış üç kapaktan oluşur.

İlk dudak şunları içerir: boş değildir ve sadece sistemi bulunduğu yüzeyden izole etmek için kullanılır. İkinci katman Diego agro yüzeyi içerir. Burada hayvanlar yüzeye yerleştirilecek ve şimdi size daha sonra göstereceğim gibi,koku tabakta.

Her yüklediğinizde taze ve yeni bir kapak kullanmak önemlidir.koku. Bu, bir deneyden diğerine herhangi bir kontaminasyonu önlemek içindir. Ayrıca başka seyreltmeye de ihtiyacınız olacak.

Normalde koku yüklemek için bir boya kullanmayız, ama burada örnekleme uğruna onu kullanacağım. Bu yüksek konsantrasyonda theodor. Bu çok seyreltilmiş olsa da, amacım bir çizgi boyunca bir gradyan oluşturmak olacak.

Bu çizgiyi söyleyin ve konsantrasyonun soldan sağa doğru artmasını istiyoruz. Bunu başarmak için, artan konsantrasyonla yoğuşma halkasına yerleştirilmiş birkaç sipariş damlası kullanacağım. Ekstremitede yerleştirilecek olan en yüksek konsantrasyonla başlıyorum.

Onu halkaya dağıtmak önemlidir. Şimdi birincisine göre iki kez seyreltilmiş olan bir sonraki konsantrasyona geçiyorum ve onu bu halkaya yerleştiriyorum. Yani orada Hayır, altı damlacığım var.

İlki, diyelim ki bir konsantrasyon içerir. İkincisi, 0.5'lik bir konsantrasyon, birincinin iki katı daha az. Üçüncüsü konsantrasyon, 0.25 vb.

Yani çizgi boyunca geometrik bir serimiz var. Bir sonraki adım, bu kapağın AAL yüzeyinde ters çevrilmesinden oluşur ve şimdi yüzey gerilimi ile tüm damlacıklar kapağın üstünden asılı kalır. Plakadaki tüm konsantrasyonu ölçmek için kızılötesi spektroskopiye dayalı bir teknik geliştiriyoruz.

Bu tekniği uygulayarak, burada deodorant çizgisi boyunca geometrik bir seriniz varsa, burada gösterildiği gibi ve plakanın genişliği boyunca katlanarak artan uzunluk boyunca bir koku konsantrasyonu elde ettiğinizi gösterebildik. Koku çizgisinin hemen altında zirve yapan bir profilimiz var. Degradenin gerçek geometrisi şu şekilde görünür.

konsantrasyonunu düşünürsenizkoku havada, iyi olan şey, gradyanın geometrisinin en az 15 dakika boyunca stabil olduğunu gösterebilmemizdir. Üst kapağın takılmasının ardından, gradyanın oluşması için 30 saniye bekleriz. Sonra hayvanı arenada tanıtıyoruz.

Hayvan, üçüncü ve dördüncü pozisyon arasındaki diğer uç çizginin altına sokulur, larvaları sakaroz çözeltisinden agro yüzeye aktarmak için küçük bir pim kullanırız. Transfer, çivi başının etrafında bir larva avlanarak yapılır. Kapağı hızlı bir şekilde açıyoruz, larva agarro yüzeyinde birikiyor.

Sonra kapağı kapatıyoruz. Kapağın açık kalma süresini en aza indirmek önemlidir. Ardından, hayvanın hareketini üç veya beş dakika boyunca kaydedersiniz.

Asıl kayıt yapılır. Bu izleme kurulumu ile bilgisayara bağlı bir kameramız var. Kullandığımız görüntü izleme yazılımı, hayvan hareketiyle ilgili bilgileri toplamak ve dijital bir dosya olarak saklamak için Nordis'ten Aton vision'dır.

Şimdi davranışsal deneye başlamak üzereyiz. Aro tabakası olan kapağımız var. Seyreltmelerimiz var.

Diego ilk kapağa takılıp kaldı. Yüklemeden öncekoku, her bir şişeyi vortekslemek önemlidir. En küçüğü solda ve en yükseği sağda olacak şekilde seyreltmemizi kullanıyoruz.

Altı damlacığın tümü aynı anda plakaya yüklenecektir. Koku kaybını önlemek için burada çok kanallı bir Pipetleyici altı daldırma kullanıyoruz, her seyreltme örneğinden 10 mikrolitre koku alınıyor ve aynı anda koku yükleniyor. Yükleme üzerine, kapak artık agros yüzeyinde ters çevrilir.

Gradyan, size daha önce gösterdiğim gibi son 30 saniye içinde plakada oluşturuldu. Şimdi Diego yüzeyindeki bir hayvanı tanıtacağım. Hayvan tanıtılır tanıtılmaz kayda başlıyorum.

Hayvan burada ve hareketi şimdi izleniyor. Gördüğünüz gibi, hayvan koku çizgisini takip ediyor ve gradyanın en yüksek konsantrasyon noktasına doğru ilerliyor. Konsantrasyonun üstel bir şekil ile soldan sağa doğru arttığını unutmayın.

Gördüğünüz gibi, hareket yönü sürekli olarak düzeltilir. Uyaranla ilgili olarak, hayvan şimdi gradyanın en yüksek konsantrasyon noktasına ulaştı ve onu plakadan çıkardık. Aynı bireyi iki kez doğrudan takip etmediğimizden emin olmak için hayvan başka bir plakaya atılır.

Yeni bir larva tanıttıktan ve yeni bir kayıt başlattıktan sonra, izleme için izlediğimiz kurallar şunlardır. Hayvan plakanın en yüksek konsantrasyon sırasına ulaşır ulaşmaz izlemeyi durduruyoruz, bu da şuna karşılık geliyor, bu burada. Ayrıca, bir hayvan duvara çarparsa, herhangi bir müdahaleden kaçınmak istediğimiz için izleme kesintiye uğrar.

Ele aldığımız ilk soru oldukça olabilirdi. Bilmek istediğimiz şey, bir hayvanın belirli bir konsantrasyonda kokuyu alıp alamayacağıydı. Böyle bir test yapmak için tipik olarak yaptığımız şey, birkaç koku kaynağına sahip olmak yerine tek bir koku kaynağına sahip olmaktır.

Bu, koku uç damlacıkındaki konsantrasyonu değiştirmede bir dereceye kadar özgürlüğe sahip olmanızı sağlar. Örneğin burada, yüksek konsantrasyonlu bir damlacığınız var ve burada düşük konsantrasyonlu bir damlacığınız var. Tipik olarak yaptığımız şey, hayvanı Diego yüzeyine Theodor damlacığının hemen altına sokmak ve hayvanın varlığını algılayıp algılayamayacağını ve mahallesinde kalıp kalamayacağını görmektir.

Şimdi tahlilimizi daha gelişmiş bir şekilde kullanmak istiyorum. Bir sipariş damlacığınız olduğunu ve burada süper empoze edilen birkaç yörünge kaydettiğinizi ve bunlardan üçüne sahip olduğunuzu hayal edin. Bu yeşil parçayı oluşturan bir bireyiniz var.

Daha az merkezde olan bu turuncu iziniz var ve sonra kaynağın etrafında dönen bir hayvanı temsil eden bu pembe yörüngeye sahipsiniz. Yörüngelerle ilgili ayrıntılar hakkında başlamak için çok fazla bilgi olduğuna inanıyoruz. Bu nedenle yörüngeyi sahiplik serisi olarak matlab'a aktarıyoruz ve matlab ile yapılan analizden sonra analizi gerçekleştiriyoruz.

İşte kaynağa olan mesafe, muhtemelen zamanın bir fonksiyonu olarak. Daha önce görüntülenen üç yörünge için, kaynaktan çok yakın kalan yeşil yörüngeye sahipsiniz. Önemli ölçüde daha fazla gürültü gösteren turuncu yörüngeye sahipsiniz.

Ve sonra bu mor yörüngeye sahipsiniz, bu ilginç bir şekilde hayvanın belli bir mesafede kalmak için kaynağı terk ettiğini gösterdi, bu da muhtemelen optimal olan bir konsantrasyona karşılık geliyordu. Burada 10 yörüngenin, koku alamayan hayvanların resmini görüyorsunuz. Bunlar mutantlar veya eller olmayan üç B mutantıdır.

Ve gördüğünüz gibi, tüm bu yörünge, hayvanların kokunun kaynağını tespit edemediğini ve onu öylece bıraktığını gösteriyor. Şimdi yıldız kontrastında, burada beyaz musluk hayvanları için 10 ardışık yörünge kaydettik. Bu hayvanlar elbette koku alabiliyorlar ve gördüğünüz gibi hepsi deodorant kaynağının altında birikiyor.

Az önce sunulan 20 yörüngeleri aslında hayvanların kimliği bilinmeden elde edildi. Bu, tahlilimizin verimliliğini ve güvenilirliğini göstermektedir. Bazı Mutantların burada Üstel bir gradyan kullanarak koku alıp alamayacaklarını belirlerken, birkaç iz oluşturuyoruz ve hayvanların diğer uç uyaranı ne kadar iyi takip edebildiklerini anlamak istiyoruz.

Şimdi size ayrı ayrı kaydedilmiş 15 yörünge göstereceğim, ve gördüğünüz gibi, hayvanlar diğer uç çizginin altındaki uyaranı takip etmede mükemmel bir iş çıkarıyorlar. Şimdi basit bir kontrol ile ilerlemek istiyoruz. Üstel gradyandaki hayvanların, konsantrasyonundan bağımsız olarak bazı uyaranlar olduğu için çizgiyi takip etmiş olmaları çok iyi olabilir, sadece hayvanlar düz gitti.

Yani aslında konsantrasyonu veya konsantrasyonla ilgili bir şeyi hesapladıklarını ve hareketlerini yönlendirmek için bunu kullandıklarını göstermek için, şimdi bir çatıya yakın olan bu geometriye sahibiz. Larva her zamanki gibi buraya getirilir ve beklediğimiz şey, çizgi boyunca hareket etmeleri ve daha sonra bu noktadan sonra konsantrasyonun düştüğünü tespit etmeleri ve ona geri dönmeleridir. Bu yüzden testi beş hayvanla gerçekleştirdik.

Yörüngeleri topladık ve şimdi onları bu slaytta üst üste bindirilmiş olarak temsil ediyoruz. Ve gördüğünüz gibi, hayvanlar buradan başladı, çizgi boyunca hareket etti, sonra en yüksek konsantrasyona karşılık gelen bölgeyi keşfetti ve çoğunlukla orada kaldı. Bu, tek kaynak tahlilini kullanarak diğer konsantrasyonları gerçek zamanlı olarak hesaplayabileceklerini kuvvetle göstermektedir.

Esas olarak büyük bir soru sorabildik. Bir hayvan kokusu, çok kaynaklı bir cihaz kullanarak belirli bir konsantrasyondaki bir kokuyu algılayabilir mi? Biz, gradyanın şeklini değiştirme ve bir hayvanın bu bilgiyi kullanıp kullanamayacağını belirleme konusunda daha fazla esnekliğe sahibiz.

Bu fikri basit bir deney yaparak açıklamak istiyorum. Şimdiye kadar kurduğumuz gradyanlarda, lens boyunca üstel bir şekle sahiptik. Şimdi soru şu, eğer lens boyunca doğrusal olarak artan konsantrasyonu sağlayarak al'ı daha fazla zorlarsak, yine de diğer uç çizginin altında yollarını bulabilirler mi?

Bu grafik iki tür gradyanı temsil eder. Üstel olanı mor renkte ve doğrusal gradyanı yeşil renkte test ettik. Bu doğrusal gradyandır ve ben isam asetat seyreltici paren yağının farklı konsantrasyonlarını yazacağım.

Bu aritmetik bir seridir. Kurulacak doğrusal bir gradyanımız var ve gördüğünüz gibi, eğim, ekstremitelerin konsantrasyonunun da 0.5, ancak 0.03'e kadar çıktığı buradaki üstel gradyana kıyasla oldukça sığ. Soru şu ki, navi bu kadar sığ bir gradyanla karşı karşıya kaldıklarında kemoterapi saldırıları yapabiliyor mu?

Burada, üstel gradyan ve doğrusal gradyan için altı damlacıkta kullanılan gerçek asetat konsantrasyonu. Gördüğünüz gibi, doğrusal gradyan için her iki durumda da en yüksek konsantrasyon aynı olsa da, buradaki en düşük konsantrasyon oldukça yüksektir. Deneyi doğrusal gradyan ile gerçekleştiriyoruz ve burada vahşi hayvan türü için 15 yörünge temsil ediliyor ve bu hayvanların lineer gradyanı tespit edebildiklerinin ve bu sinyali deodorant çizgisi boyunca takip edebildiklerinin oldukça açık olduğuna inanıyoruz.

Bu yüzden amacımızın açık olduğunu düşünüyorum. Burayı bitirmeden önce, bu izleme kurulumu için gelecekteki talimatlardan kısaca bahsetmek istiyorum. Bu izleme kurulumu, örneğin larvalarda daha büyük, daha uzun bir süre boyunca karmaşık davranışları görmek gibi birçok ilginç şey yapmanıza izin verse de, bazı sınırlamaları vardır.

Örneğin, plakanızın boyutuyla sınırlısınız, böylece ne kadar süreyle takip edebileceğinizi ve bakabileceğiniz karmaşık davranışları sınırlar. Bu yüzden, plakanın daha büyük olduğu ya da bir plakanın sınırlarıyla sınırlı olmadığınız bir sistem geliştirebilseydik iyi olurdu. Diğer bir sorun ise şu anda sahip olduğumuz yazılımla aynı anda birden fazla hayvanı takip etmenin zor olması, bu nedenle popülasyon davranışlarını gerçek zamanlı olarak gözlemlemenin mümkün olmamasıdır.

Bu kurulumla test edemediğimiz davranışın bir başka ilginç yönü, larvaların uzaydaki gerçek üç boyutlu hareketleridir. Hayvanları takip ederken, örneğin, bir koku damlacıkına ulaştıklarında başlarını kaldırabileceklerini veya konsantrasyondaki değişiklikleri tespit etmeye çalışırken başlarını etrafa süpürebileceklerini göreceksiniz. Muhtemelen bu, şu anda bizim özel kurulumumuzla mümkün değil, bu yüzden bunu yapmamıza izin verecek bir şey geliştirmek güzel olurdu.