Dondurarak Isı Lizisi ve İzobarik Taşıyıcı Kullanarak Kütle Spektrometresi Analizi için Tek Hücreli Proteomik Hazırlık

SCoPE2, antikorlar olmadan binlerce tek memeli hücresinden binlerce proteini ölçebilir. Bu protokol, aksi takdirde toplu analizler için görünmez olacak proteom heterojenliğini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. SCoPE2 yaklaşımını kullanan tek hücreli proteomikler, sadece bir pipetten sıvı işleme robotiğine kadar çeşitli kaynaklara sahip araştırmacılar tarafından erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır.

SCoPE2, proteinlerin aynı popülasyondan tek hücreler arasında bolca nasıl farklılaştığına dair fikir vererek, kanser ve immünoloji de dahil olmak üzere birçok araştırma alanına geniş çapta uygulanabilir. Başlamak için, termal döngüye sıralanmış tek hücreli 384 delikli bir plaka yerleştirerek, 90 santigrat derecede 10 dakika ısıtarak ve ardından 12 santigrat derecede soğutarak hücre lizis prosedürüne başlayın. Plakayı 18 ila 22 santigrat derecede bir tezgah üstü plaka eğirici içinde kısaca döndürün.

Plakayı 18 ila 22 santigrat derecede bir su banyosu sonicator'da beş dakika boyunca sonikleştirin. Ardından, buzun üzerine yerleştirin. Tripsin sindirimine devam etmek için, 100 mikrolitre ana karışım hazırlayın ve bir sıvı işleyici kullanarak 384 delikli plakanın her bir oluğuna 0.2 mikrolitre ana karışım ekleyin.

Plakayı kapatın, beş saniye boyunca vorteks yapın ve 18 ila 22 santigrat derecede bir tezgah üstü plaka döndürücüsünde döndürün. 384 delikli plakayı 37 santigrat derecede üç saat ısıtın, kapak sıcaklığı 52 santigrat dereceye ayarlayın. Bir tandem kütle etiketleme reaksiyonu ayarlamak için, 85 milimolar tandem kütle etiketi stoklarını eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın.

Açmadan önce, tüpleri oda sıcaklığına ısıtın ve etiketleri susuz asetonitrilde 22 milimol'e kadar seyreltin. Bu etiketleme stratejisini kullanarak, bir sıvı dağıtım robotu veya manuel pipet kullanarak 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 0,5 mikrolitre seyreltilmiş tandem kütle etiketi ekleyin. Plakayı kapatın, beş saniye boyunca vorteks yapın ve 18 ila 22 santigrat derecede bir tezgah üstü plaka döndürücüsünde döndürün.

Etiketleme reaksiyonunun bir saat boyunca 18 ila 22 santigrat derecede ilerlemesine izin verin. Tandem kütle etiketleme reaksiyonunun söndürülmesi için, bir sıvı işleyici kullanarak 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna, HPLC sınıfı suda seyreltilmiş 0,2 mikrolitre% 0,5 hidroksilamin ekleyin. Plakayı kapatın, beş saniye boyunca girdap yapın ve plakayı 30 dakika boyunca 18 ila 22 santigrat derecede tutmadan önce bir tezgah üstü plaka eğirici içinde döndürün.

LC-MS analiz hazırlığına, kombine taşıyıcı veya referans malzemenin eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarılmasıyla başlanır. Her set için, ilk kuyucuğa bir mikrolitre taşıyıcı ve referans malzeme pipetin, tek bir setin parçası olacaktır. İlk kuyudan sonraki kuyucuğa kadar tüm hacmi pipetleyin.

Tek bir sette bulunan tüm kuyular son kuyuda birleştirilene kadar tüm ses seviyesini bir kuyudan diğerine pipetlemeye devam edin. Her set için, her sete dahil edilecek ilk tek hücreli kuyu için HPLC sınıfı suda seyreltilmiş beş mikrolitre% 50 asetonitril ekleyin. İlk kuyudan sonraki kuyucuğa kadar tüm hacmi pipetleyin.

Tek bir sette bulunan tüm kuyucuklar son kuyuda birleştirilene kadar tüm hacmi bir hücreden diğerine pipetlemeye devam edin. Şimdi her seti otomatik numune alma cihazı cam eklerine aktarın. Tüm setler birleştirildikten ve cam eklere yerleştirildikten sonra numuneleri kurulayın.

LC-MS-MS analizinden önce, etiketli peptitleri yeniden askıya almak için her sete 1.2 mikrolitre% 0.1 formik asit ekleyin. Otomatik numune alma eki parçalarını cam otomatik numune alma şişelerine yerleştirin ve her numuneyi bir kapakla kapatın. Yeniden süspansiyonun tamamlandığından emin olmak için her şişeyi beş saniye boyunca vorteks yapın ve ardından 18 ila 22 santigrat derecede bir şişe eğiricide döndürün.

Her numunenin yanlara sıçramak yerine kesici ucun altında olduğundan emin olun. Şişeleri otomatik numune alma tepsisine yerleştirin ve her set için LC-MS-MS analizi için bir mikrolitrelik bir numune enjekte edin. Tek hücrelerin sindirim ve etiketleme verimliliği, taşıyıcıda olduğu gibi doğrudan test edilmeyebilir, ancak DO-MS yazılımı, sindirim ve etiketleme verimliliğini tahmin eden grafikler sağlar.

Kötü sindirim, parçalanmış peptitlerin yoğunluğunun tamamen parçalanmış meslektaşlarına yüksek bir oranı ile gösterilir. Kümelerde göz önünde bulundurulması gereken bir diğer faktör, her tandem kütle etiketleme kanalındaki medyan muhabir iyon yoğunluğundaki eksik verilerin oranıdır. Tek hücreler başarıyla hazırlandığında, hücre başına eksik veri ve pozitif kontrol, negatif kontrol örneklerinden çok daha düşüktür.

LC-MS-MS numune hazırlama sırasında dikkatli sıvı kullanımı, peptitlerin maksimum geri kazanımı için kritik öneme sahiptir. Kuyu başına yaklaşık 100 pikogram ila 100 nanogramlık küçük numuneler, izobarik bir taşıyıcı kullanılarak proteomik analiz için hazırlanabilir. SCoPE2, tek hücreli proteomik ölçümleri yalnızca ortak reaktifler ve ticari olarak temin edilebilen ekipman kullanarak dünya çapındaki araştırmacılar için erişilebilir hale getirir.

Robotik sıvı elleçleme ile manuel işleme veya yüksek verimli otomasyona uygundur.