Name: Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Keşfedin, gastrointestinal stromal tümör araştırmalarında Kit V558Δ/+ fare modelinin yetiştirilmesi, diseksiyonu ve örnek işleme tekniklerini. Bu immünokompetent model, immünoterapi testleri için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KitV558Δ/+ fareler genetik olarak tasarlanmış ve Dr. Peter Besmer10 tarafından paylaşılmıştır. Bu çalışma NIH hibeleri R01 CA102613 ve T32 CA251063 tarafından desteklenmiştir.

Tüm fareler, NIH kılavuzlarına göre ve Pennsylvania Üniversitesi IACUC'un onayı ile Pennsylvania Üniversitesi'nde patojensiz koşullar altında barındırıldı. Ötenazi, Pennsylvania Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları standart çalışma prosedürlerini izleyerek gerçekleştirildi.
1. KitV558Δ/+ fare ıslahı
<ol><li> KitV558Δ/+ farelerini C57BL/6J farelerini kullanarak C57BL/6J arka plana 10 defadan fazla geri geçirin. Bunu yapmak için, erkek KitV558Δ / + farelerini dişi C57BL / 6J farelerle 1: 2 oranında üretin. NOT: Homozigot Kit V558 Δ/V558Δ genotipi uteroda öldürücüdür. Dişi KitV558Δ / + farelerini erkek C57BL / 6J farelerle yetiştirmek mümkündür, ancak çöp boyutu dişi vahşi tip C57BL / 6J farelerden görülenin yaklaşık yarısı kadardır. Ayrıca, dişi KitV558Δ / + fareleri 4 aylıktan sonra sınırlı litre üretir.</li>
	<li>KitV558Δ/+ genotipinin varlığını doğrulamak için yavruları 7-14 günlükken ayak parmağı kırpma ile genotiplendirin. İleri astarı kullanın: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; muhabir 1: CCTCGACAACCTTCCA; ters astar: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; ve muhabir 2: Genotipleme için TCTCCTCGACCTTCCA.</li>
</ol>2. KitV558Δ/+ fare tedavisi
<ol><li>Yaş ve cinsiyet, tedaviden önce KitV558Δ / + farelerle eşleşir. Kohortlarda yaş ve cinsiyet uyumlu fareleri kullanın, çünkü dişi KitV558Δ / + farelerinden gelen tümörler erkek farelerdekilerden daha büyüktür. Fareleri 8-12 haftalıkken tedavi edin, bu sırada tümörler kurulur (Şekil 1).</li>
	<li>Tirozin kinaz inhibitörlerini oral yoldan veya intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonla verin; KitV558Δ/+ tümörleri tirozin kinaz inhibitörlerine duyarlıdır. İçme suyunda 600 mg / L'lik bir dozda imatinib veya günde iki kez 45 mg / kg'lık enjeksiyonlar sağlayın. Adım 3'te gösterildiği gibi tümörün diseksiyonundan sonra dijital ölçekler kullanarak tümör ağırlığının azaltılmasını ölçün, bu da imatinib ile tedaviyi takiben 1 haftada yaklaşık% 50 ve 4 haftada% 80'dir (Şekil 2).</li>
</ol>3. KitV558Δ/+ fare organ hasadı
<ol><li>Fareleri CO2 narkozu ile dak.% 60 oda hacmi akış hızında ötenazileştirin. Solunum durduktan sonra fareleri odada en az 2 dakika bırakın, ardından ölümü doğrulamak için servikal çıkık yapın.</li>
	<li>Tüm aletleri sterilize edin, prosedür boyunca eldiven giyin ve steril bir alan koruyun. Cildi% 70 etanol ile hazırlayın. Makas kullanarak 2 cm'lik orta hat dikey kesi yapın ve karın boşluğuna girin. Karın içi yapışıklıkları keskin bir şekilde lize edin.</li>
	<li>Drenaj mezenterik lenf nodunu çıkarmak için, aşağıda açıklanan adımları izleyin.<ol>
<li>Çekumu tanımlayın ve mezenterini üstün bir şekilde kaldırın. Kolonik mezenterin tabanının yaklaşık ortasında, mezenterik lenf nodunu tanımlayın ve keskin bir şekilde diseke edin. Lenf nodu kirli beyaz ve yaklaşık 0,5 cm x 0,5 cm boyutlarındadır.</li>
		<li>Gerektiğinde protein izolasyonu, histoloji ve tek hücre süspansiyonu için lenf nodu dokusunu üçe bölün. Tek hücreli süspansiyonlar için, lenf nodu dokusunu 20 mL serum serbest ortamına (RPMI) yerleştirin ve buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GİST ve çekumun izolasyonu için aşağıda açıklanan adımları izleyin.<ol>
<li>KitV558Δ / + farelerdeki çekum çoğunlukla bir GIST ile değiştirilir. İleokolik kavşağı tümörün tabanından dikkatlice bölün. Çekumu toplamak için, kolonu tekrar bölün, tümörün tabanına 2 cm proksimal olarak.</li>
		<li>KitV558Δ / + farelerin% 50-60'ında, tümörün başı, tipik olarak seröz sıvı içeren ancak nadiren irin içerebilen bir çekal doku kapağı içerir (Şekil 3). Kapak dokusunu tümör dokusundan keskin bir şekilde diseke edin.</li>
		<li>Gerektiğinde protein izolasyonu, histoloji ve tek hücre süspansiyonu için tümör dokusunu ve / veya çekumu üçte birine bölün. Tek hücreli süspansiyonlar için, tümör dokusunu veya çekumu HBSS'ye% 2 FCS ile yerleştirin, numuneyi örtmek ve buz üzerinde tutmak için yeterli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. GİST dokusunun batı leke analizi
<ol><li>50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 denatüre olmayan deterjan, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF ve 20 μl/ml proteinaz inhibitörü karışımı içeren doku lizis tamponu hazırlayın.</li>
	<li>1800 mL deiyonize su, 2 mL Ara 20 ve 200 mL 10x Tris tamponlu salin (TBS) birleştirerek %1 Ara 20 (TBST) içeren 1x Tris tamponlu tuzlu su çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>5mL/g doku lizis tamponunda bir FACS tüpünde 3.4.3 adımından itibaren dokuyu askıya alın ve buz üzerinde 15 s boyunca 15.000 rpm'de mekanik homojenizatör ile iki kez homojenize edin. Buz üzerinde 30 dakika boyunca lizatı inkübe edin.</li>
	<li>Lisatı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpe aktarın. 4 °C'de 20 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Lisatları% 4 ila% 15'lik bir gradyan jel üzerinde çalıştırın, ardından14'te açıklandığı gibi bir nitroselüloz membrana aktarın.</li>
	<li>Membranı 5 dakika boyunca 1x TBS'de bir kez yıkayın ve ardından membranı 1 saat boyunca% 5 sütte bloke edin. Yine, membranı 10 dakika boyunca 1x TBS'de bir kez yıkayın.</li>
	<li>Primer antikordaki inkübe membran, gece boyunca 4 °C'de% 5 BSA'da 1:1000 oranında seyreltilir. Membranı her biri 10 dakika boyunca 1x TBST'de 3x yıkayın. Sekonder antikoru olan pıhtıyı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 2.5 sütte 1:2500 oranında seyreltilmiş olarak inkübe edin.</li>
	<li>Membranı 5 dakika boyunca 1x TBS'de bir kez yıkayın. Membranı, tipik olarak 200-500 μL'yi örtmek için yeterli HRP substratı ekleyin ve kemilüminesansı tespit etmek ve ölçmek için dijital bir görüntüleyici kullanın.</li>
</ol>5. GİST dokusunun immünohistokimyası
<ol><li>3.3.2 veya 3.4.3 adımındaki dokuyu gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehitte sabitleyin. Dokuyu işlenmeye hazır olana kadar %70 EtOH'de saklayın. 15,16'da açıklandığı gibi cam slaytlar üzerine 5 μm kalınlığında gömme ve kesit blokları.</li>
	<li>Daha önce tarif edildiği gibi temel bir immüno-tespit kiti kullanarak immünohistokimyasal tespiti tamamlayın17.</li>
</ol>6. Mezenterik lenf nodunun tek hücreli süspansiyonu
<ol><li>RPMI ortamını 3.3.2. adımdan itibaren lenf nodu örneği ile 100 μm'lik bir filtre üzerine dökün. Filtreyi, 3 mL plastik şırınganın yumuşak ucuyla yeni 50 mL konik ve püre lenf noduna taşıyın. Filtreyi 20 mL RPMI ortam ile yıkayın.</li>
	<li>Filtratın 4 °C'de 450 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edilmesi. Süper natantı aspire edin.</li>
	<li>Peleti PBS'de (boncuk tamponu) %1 FBS'lik 20 mL'de yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtrenin üzerine dökün. Hücre filtrasyonunu toplayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Filtratın 4 °C'de 450 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edilmesi. Süper natantı aspire edin. Akış sitometrisi için boncuk tamponunda 6 x 107 hücre/mL'de yeniden askıya alın.</li>
</ol>7. GİST'in tek hücreli süspansiyonu
<ol><li>50 mL HBSS'ye 250 mg kollajenaz IV, bir tablet EDTA içermeyen proteaz inhibitörü ve 100 μL DNaz I ekleyerek kollajenaz tamponu hazırlayın. Çözülene kadar oda sıcaklığında 10 dakika döndürün.</li>
	<li>GIST'i steril bir kaba koyun ve 2,5 mL kollajenaz tamponu ekleyin. Tümör ince parçalar halinde olana kadar steril bir neşter ve makas kullanarak tümörü kesin. Tümörü ve kollajenazı 50 mL'lik bir tüpe aspire etmek için büyük bir delik pipeti kullanın.</li>
	<li>30 dakika boyunca 37 ° C'de 100 rpm'de sallanan bir inkübatörde inkübe edin. 2 mL FBS ile reaksiyonu söndürün.</li>
	<li>GIST örneği ile kollajenazı 100 μm'lik bir filtrenin üzerine dökün ve tümörü 3 mL'lik plastik bir şırınganın yumuşak ucuyla püre haline getirin ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Filtreyi 20 mL HBSS ile yıkayın. Filtratı 5 dakika boyunca 450 x g, 4 °C'de santrifüj edin. Süper natantı aspire edin.</li>
	<li>Peleti 20 mL boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtrenin üzerine dökün. Filtrat toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Filtratı 5 dakika boyunca 450 x g, 4 °C'de santrifüj edin. Süper natantı aspire edin. Akış sitometrisi için boncuk tamponunda 6 x 107 hücre/mL'de yeniden askıya alın.</li>
</ol>8. Çekumun tek hücreli süspansiyonu
<ol><li>Kollajenaz tamponunu adım 7.1'deki gibi hazırlayın. Makas kullanarak, iç mukozayı açığa çıkarmak için çekumu uzunlamasına bölün. 0,5 cm'lik kesitler halinde kesin ve% 2 FBS ile 5 mL HBSS içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. 30 s boyunca kuvvetlice çalkalayın, 20 s için 450 x g'de santrifüj yapın, ardından süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>2 mM EDTA ile 5 mL HBSS ekleyin. 15 dakika boyunca 100 rpm'de 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde inkübe edin. 20 s için 450 x g'de santrifüj. Süper natantı aspire edin.</li>
	<li>5 mL HBSS ekleyin. 30 s boyunca kuvvetlice çalkalayın, 20 s için 450 x g'de santrifüj yapın, ardından süpernatanı aspire edin. Bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>5 mL kollajenaz tamponu ekleyin. 37 °C'de sallanan bir inkübatörde 100 rpm'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Her 10 dakikada bir kuvvetlice çalkalayın. 2 mL FBS ile reaksiyonu söndürün.</li>
	<li>Kollajenazı çekum örneği ile 100 μm'lik bir filtrenin üzerine dökün ve 3 mL'lik plastik şırınganın yumuşak ucuyla ezin. Filtreyi 20 mL HBSS ile yıkayın. Filtrat toplayın.</li>
	<li>Filtratın 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj edilmesi. Süper natantı aspire edin. Peleti 20 mL boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtrenin üzerine dökün. Bir hemositometre kullanarak filtrat toplayın ve hücreleri sayın.</li>
	<li>Filtratın 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj edilmesi. Süper natantı aspire edin. Akış sitometrisi için boncuk tamponunda 6 x 107 hücre/mL'de yeniden askıya alın.</li>
</ol>

<ol><li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond%3A+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li>
<li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li>
<li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li>
<li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+%28GRID%29%3A+an+international%2C+multicentre%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li>
<li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li>
<li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li>
<li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).</li>
<li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li>
<li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li>
<li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li>
<li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li>
<li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li>
<li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CD8%28%2B%29+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li>
<li>General Protocol for Western Blotting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022).</li>
<li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSadeghipour%2C+A+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 253-268 (2019).</li>
<li>Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSy%2C+J+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 269-278 (2019).</li>
<li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1%2FPD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

KitV558Δ/+ fare modeli, GİST'in moleküler ve immünolojik analizinde güçlü bir araştırma aracıdır. Üreme stratejisi tek bir haç gerektirse de, tümör yanıtını analiz eden deneylerde KitV558Δ / + fare kohortlarının kullanılması kapsamlı bir üreme gerektirir. Benzer tümör ağırlıklarını sağlamak için fareler yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır ve farelerin% 10'u tümörler kurulduğunda 8 haftalıktan önce ölür. Bireysel farelerde tümör hacmini izlemek için BT veya MRI gibi gelişmiş görüntülem...

GİST, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 6.000 vaka insidansı olan insanlarda en yaygın sarkomdur1. GIST, Cajal'ın interstisyel hücreleri olarak adlandırılan gastrointestinal kalp pili hücrelerinden kaynaklanıyor gibi görünmektedir ve tipik olarak tirozin kinaz kiti veya PDGFRA2'deki tek bir mutasyon tarafından tahrik edilmektedir. Cerrahi, GİST tedavisinin temelini oluşturur ve iyileştirici olabilir, ancak ilerlemiş hastalığı olan hastalar tirozin kinaz inhibitörü (TKI), imatinib ile tedavi edilebilir. İmatinib, 20 yılı aşkın bir süre önce kullanılmaya başlanmasından bu yana, GİST'teki tedavi paradigmasını dönüştürmüş ve ileri evre hastalıklarda sağkalımı 1 yıldan 5 yıla çıkararak 3,4,5 yıl aralamıştır. Ne yazık ki, imatinib edinilmiş KIT mutasyonları nedeniyle nadiren küratiftir, bu nedenle bu tümör için yeni tedavilere ihtiyaç vardır.
Fare modelleri, kanserde yeni tedavilerin araştırılmasında önemli bir araştırma aracıdır. GİST 6,7'de multipl subkutan ksenogreft ve hasta kaynaklı ksenogreft modelleri geliştirilmiş ve araştırılmıştır. Bununla birlikte, immün yetmezlikli fareler insan GİST'ini tam olarak temsil etmemektedir, çünkü GİST'ler onkojenik mutasyonlarına bağlı olarak farklı bağışıklık profilleri barındırmaktadır ve gastrointestinal tümör mikroçevresinin değiştirilmesi TKİ tedavisinin etkilerini iyileştirmektedir 8,9. KitV558Δ/+ fare, Kit ekzon 11'de, insan GIST10'da en sık mutasyona uğramış bölge olan yan yana membran alanını kodlayan heterozigot bir germline delesyonuna sahiptir. KitV558Δ / + fareleri% 100 penetranslı tek bir çekal GİST geliştirir ve tümörler insan GIST 8,11,12,13 ile benzer histoloji, moleküler sinyalizasyon, immün infiltrasyon ve tedaviye yanıta sahiptir. Burada, GİST'te moleküler ve immünolojik araştırmalarda kullanılmak üzere KitV558Δ/+ farelerde üreme, tedavi ve numune izolasyonu ve işlenmesini açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>100 mikron filtre</td><td>EMSCO</td><td>1194-2360</td><td></td></tr><tr><td>1x RBC lizis tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>3mL şırınga</td><td>Thermo Fisher Scientific / BD Biosciences</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; %15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri, 10 kuyulu, 30 & l</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldehit Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>40 mikron filtre</td><td>EMSCO</td><td>1194-2340</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>70 mikron filtre</td><td>EMSCO</td><td>1194-2350</td><td></td></tr><tr><td>AKT antikoru (C67E7)</td> <td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>4691</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Komple mini edta içermeyen proteaz inhibitörü</td><td>Thomas Scientific</td><td>C852A34</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Neşterler</td><td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td><td>14-840-00</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thomas Scientific</td><td>C756V81</td><td></td></tr><tr><td>Dog1 antikoru</td><td>abcam</td><td>ab64085</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ERK antikoru (p44/42)</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thomas Scientific</td><td>C788U23</td><td></td></tr><tr><td>FIJI yazılımı</td><td>FIJI</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji</td></tr><tr><td>Fisherbrand 850 Homojenizatör</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-340-169</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Pennsylvania Üniversitesi Hücre Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imatinib mesilat</td><td>Selleck Kimyasalları</td><td>S1026</td><td></td></tr><tr><td>KIT antikoru (D13A2)</td> <td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>3074</td><td></td></tr><tr><td>KitV558&Delta;/+ Genotipleme</td><td>Transnetyx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (1.5mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Fare İmmünotespit Kiti Üzerinde Fare, Temel</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz Membran, Önceden Kesilmiş, 0.45 & m</td><td>Rio-Rad</td><td>1620145</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız Kuru Süt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9121673</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substitute</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT antikoru (S473)</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>p-ERK antikoru (p44/42)</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>p-KIT antikoru (Y719)</td><td>Hücre Sinyali</td><td>3391</td><td></td></tr><tr><td>PMSF Proteaz İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proeinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP170050</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Tabanlı Polistiren Testi (FACS) Tüpleri</td><td>Falcon / Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Pennsylvania Üniversitesi Hücre Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum florür (NaF)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>201154</tr><tr><td>Sodyum ortovanadat (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34076</td><td></td></tr><tr><td>TBS tamponu (10x)</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı (100mm2)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>TrisHCL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1757500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Rio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; vivaCT 80 platformu</td><td>Scanco medikal</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gastrointestinal stromal tümörün genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde moleküler ve İmmünolojik teknikler

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tümör (GİST) en sık görülen insan sarkomudur ve tipik olarak KIT reseptöründeki tek bir mutasyon tarafından yönlendirilir. Tümör tipleri arasında, yeni nesil kanser tedavilerini araştırmak için çok sayıda fare modeli geliştirilmiştir. Bununla birlikte, GİST'te, çoğu in vivo çalışma, doğal sınırlamaları olan ksenograft fare modellerini kullanır. Burada, bir KitV558Δ / + mutasyonu barındıran gastrointestinal stromal tümörün immün yetkinliği, genetiği değiştirilmiş bir fare modelini tanımladık. Bu modelde, çoğu GİST'den sorumlu onkogen olan mutant KIT, insan GIST'lerinde görülen histolojik görünümü ve immün infiltrasyonu taklit eden bir GIST'e yol açan endojen promotörü tarafından yönlendirilir. Ayrıca, bu model hem hedefe yönelik moleküler hem de immün tedavileri araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Burada, bir KitV558Δ/+ fare kolonisinin ıslahını ve bakımını açıklıyoruz. Ek olarak, bu yazıda GİST'in tedavisi ve tedariki, KitV558Δ/+ farelerde mezenterik lenf nodu drenajı ve bitişik çekumun yanı sıra moleküler ve immünolojik analizler için numune hazırlama ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

KitV558Δ/+ fare modeli, immün yetkin bir fare modelinde terapötiklerin araştırılmasına izin verir. KitV558Δ/+ fareler, ilerleyici bağırsak tıkanıklığı nedeniyle ortalama 8 aylık bir ömre sahiptir (Şekil 4). KitV558Δ / + farelerden elde edilen tümörler, tirozin kinaz Kiti ve transmembran kanalı DOG1 (Şekil 5) ve transkripsiyon faktörü ET...

Bu makalenin amacı, KitV558Δ/+ fare modelini ve fare örneklerinin başarılı diseksiyonu ve işlenmesi için teknikleri tanımlamaktır.

Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Protokolümüz, şu anda kullanımda olan tek immünokompetan fare modeli olan GIST'in ıslahını, bakımını, diseksiyonunu ve numune işlemesini açıklamaktadır. Gelecekteki araştırmacıların GİST'te daha fazla çeviri araştırması yapmak için bu fare modelini kullanabileceklerini umuyoruz. GİST'te geleneksel tedaviler tirozin kinaz inhibitörleri ile hedefe yönelik moleküler tedaviyi içerir.Bu model, araştırmacıların GİST'te immünoterapileri test etmelerini sağlar. Başlamak için, tüm aletleri sterilize edin, prosedür boyunca eldiven giyin ve steril bir alanı koruyun. Kesi alanını% 70 etanol ile hazırlayın.Makas kullanarak, iki santimetrelik bir orta hat dikey kesi yapın ve karın boşluğuna girin. Karın içi yapışıklıkları keskin bir şekilde lize edin. Drenaj mezenterik lenf nodunu çıkarmak için, çekumu tanımlayın ve mezenterini üstün bir şekilde kaldırın.Kolonik mezenterin tabanının yaklaşık ortasında, mezenterik lenf nodunu tanımlayın ve keskin bir şekilde diseke edin. Gerektiğinde, lenf nodu dokusunu protein izolasyonu, histoloji ve tek hücre süspansiyonu için üçe bölün. Tek hücreli süspansiyonlar için lenf nodu dokusunu 20 mililitre RPMI ortamına yerleştirin ve buz üzerinde tutun.Çekum çoğunlukla Kit558 farelerinde bir GIST ile değiştirilir. GIST ve çekumun izolasyonu için, ileokolik kavşağı tümörün tabanından dikkatlice bölün. Ardından, çekumu tekrar bölün, tümörün tabanına iki santimetre distal.Kit558 farelerinin% 50 ila% 60'ında, tümörün başı, tipik olarak seröz sıvı içeren, ancak nadiren irin içerebilen bir çekal doku kapağı içerir. Kapak dokusunu tümör dokusundan keskin bir şekilde diseke edin. Tümör dokusunu ve çekumu protein izolasyonu, histoloji ve tek hücreli süspansiyon için üçe bölün.Tek hücreli süspansiyonlar için, tümör dokusunu veya çekumu HBSS'ye% 2 FCS ile, numuneyi örtecek kadar% 2 FCS ile yerleştirin ve buz üzerinde tutun. RPMI ortamını lenf nodu örneği ile 100 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün. Filtreyi yeni bir 50 mililitrelik koniğe taşıyın ve lenf düğümünü üç mililitrelik plastik bir şırınganın yumuşak ucuyla ezin.Filtreyi 20 mililitre RPMI ortamı ile yıkayın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin. Peleti 20 mililitre boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün.Hücre filtrasyonunu toplayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatanı atın.Ardından, akış sitometrisi için boncuk tamponunda yeniden askıya alın. Kollajenaz tamponunu metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. GIST'i steril bir kaba koyun ve 2,5 mililitre kollajenaz tamponu ekleyin.Steril bir neşter ve makas kullanarak, tümörü ince parçalar halinde olana kadar kesin. Tümörü ve kollajenazı 50 mililitrelik bir tüpe aspire etmek için büyük delikli bir pipet kullanın. Dakikada 100 dönüşte 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, ardından reaksiyonu iki mililitre FBS ile söndürün.100 mikrometrelik bir filtrenin üzerine GIST örneği ile kollajenaz dökün ve tümörü üç mililitrelik plastik bir şırınganın yumuşak ucuyla ezin ve 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Filtreyi 20 mililitre HBSS ile yıkayın. Filtratı 450 RCF'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin, ardından süpernatanı atın.Peleti 20 mililitre boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün Bir hemositometre kullanarak filtrat toplayın ve hücreleri sayın. Süper natantı santrifüj edin ve aspire edin, daha sonra akış sitometrisi için boncuk tamponunda yeniden askıya alın. Makas kullanarak, iç mukozayı açığa çıkarmak için çekumu uzunlamasına bölün.0,5 santimetrelik bölümlere ayırın ve beş mililitre HBSS ve% 2 FBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın ve 20 saniye boyunca 450 RCF'de santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı atın.İki milimolar EDTA ile beş ila 20 mililitre HBSS ekleyin. 15 dakika boyunca dakikada 100 dönüşte 37 santigrat derecede inkübe edin. Süper natantı santrifüj yapın ve atın, ardından peleti beş ila 20 mililitre HBSS'de yeniden askıya alın.Karışımı 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın, ardından 20 saniye boyunca 450 RCF'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Peleti beş mililitre kollajenaz tamponunda yeniden askıya alın, ardından dakikada 100 rotasyonda 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Her 10 dakikada bir kuvvetlice çalkalayın ve reaksiyonu iki mililitre FBS ile söndürün. Kollajenazı çekum örneği ile 100 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün ve üç mililitrelik plastik şırınganın yumuşak ucuyla ezin. Filtreyi 20 mililitre HBSS ile yıkayın ve filtrat toplayın.Süpernatanı santrifüj yapın ve atın. Peleti 20 mililitre boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün. Bir hemositometre kullanarak filtrat toplayın ve hücreleri sayın.Santrifüjleme işlemini bir kez daha tekrarlayın ve akış sitometrisi için pelet tamponunda peleti yeniden askıya alın. Kit558 fareleri, ilerleyici bağırsak tıkanıklığı nedeniyle ortalama sekiz aylık bir ömre sahipti. Kit558 farelerinden gelen tümörler, tirozin kinaz KIT, transmembran kanalı Dog1 ve transkripsiyon faktörü ETV1 dahil olmak üzere GIST'in kanonik belirteçlerini eksprese etti.Tümörler, insan GIST'ini yakından taklit eden aşağı akış belirteçleri ERK ve AKT veya immün mikro çevre gibi KIT sinyal yolundaki değişiklikler için incelenmiştir. MRG veya BT, tümör yanıtının doğru bir ölçümü olarak tümör hacmini izlemek için kullanıldı. Tümörün ileokolik bileştikten ve çekal kapaktan uzağa diseke edilmesi, gerçek tümör ağırlığını ve immün ve moleküler analizi yakalamak için önemlidir.GİST içinde, bu model tümör mikroçevresinin ve immünoterapilerin araştırılmasına izin vermiştir.

molecular-immunologic-techniques-genetically-engineered-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Burada, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak yeni glioblastomları (GBM) indüklemek, izlemek ve analiz etmek için verimli ve çok yönlü bir protokolü açıklıyoruz. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histo-patolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma&#39;nın Roman modelleri oluşturmak için

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder.

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

Segmental adeno-cre enfeksiyonu ile genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kurulması ve yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile gözlemlenmesi için bir protokol sunulmuştur.

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Genetiği değiştirilmiş farelerdeki sinir sistemi neoplazmlarının insan meslektaşlarının patolojisini doğru bir şekilde özetleyip özetlemediğini değerlendirmek için bir metodoloji geliştirdik. Burada, bu histolojik teknikleri, tanımlanmış patolojik kriterleri ve kültür metodolojilerini P 0-GGFβ3 fare modelinde ortaya çıkan nörofibromlara ve malign periferik sinir kılıfı tümörlerine uyguluyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Fare Modellerinde Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörlerinin Tanımlanması, Teşhis Edilmesi ve Derecelendirilmesi

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Keşfedin, gastrointestinal stromal tümör araştırmalarında Kit V558Δ/+ fare modelinin yetiştirilmesi, diseksiyonu ve örnek işleme tekniklerini. Bu immünokompetent model, immünoterapi testleri için değerli bir araçtır.

Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler

Daha fazla video keşfet