Gastrointestinal Stromal Tümörün Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Moleküler ve İmmünolojik Teknikler

Protokolümüz, şu anda kullanımda olan tek immünokompetan fare modeli olan GIST'in ıslahını, bakımını, diseksiyonunu ve numune işlemesini açıklamaktadır. Gelecekteki araştırmacıların GİST'te daha fazla çeviri araştırması yapmak için bu fare modelini kullanabileceklerini umuyoruz. GİST'te geleneksel tedaviler tirozin kinaz inhibitörleri ile hedefe yönelik moleküler tedaviyi içerir.

Bu model, araştırmacıların GİST'te immünoterapileri test etmelerini sağlar. Başlamak için, tüm aletleri sterilize edin, prosedür boyunca eldiven giyin ve steril bir alanı koruyun. Kesi alanını% 70 etanol ile hazırlayın.

Makas kullanarak, iki santimetrelik bir orta hat dikey kesi yapın ve karın boşluğuna girin. Karın içi yapışıklıkları keskin bir şekilde lize edin. Drenaj mezenterik lenf nodunu çıkarmak için, çekumu tanımlayın ve mezenterini üstün bir şekilde kaldırın.

Kolonik mezenterin tabanının yaklaşık ortasında, mezenterik lenf nodunu tanımlayın ve keskin bir şekilde diseke edin. Gerektiğinde, lenf nodu dokusunu protein izolasyonu, histoloji ve tek hücre süspansiyonu için üçe bölün. Tek hücreli süspansiyonlar için lenf nodu dokusunu 20 mililitre RPMI ortamına yerleştirin ve buz üzerinde tutun.

Çekum çoğunlukla Kit558 farelerinde bir GIST ile değiştirilir. GIST ve çekumun izolasyonu için, ileokolik kavşağı tümörün tabanından dikkatlice bölün. Ardından, çekumu tekrar bölün, tümörün tabanına iki santimetre distal.

Kit558 farelerinin% 50 ila% 60'ında, tümörün başı, tipik olarak seröz sıvı içeren, ancak nadiren irin içerebilen bir çekal doku kapağı içerir. Kapak dokusunu tümör dokusundan keskin bir şekilde diseke edin. Tümör dokusunu ve çekumu protein izolasyonu, histoloji ve tek hücreli süspansiyon için üçe bölün.

Tek hücreli süspansiyonlar için, tümör dokusunu veya çekumu HBSS'ye% 2 FCS ile, numuneyi örtecek kadar% 2 FCS ile yerleştirin ve buz üzerinde tutun. RPMI ortamını lenf nodu örneği ile 100 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün. Filtreyi yeni bir 50 mililitrelik koniğe taşıyın ve lenf düğümünü üç mililitrelik plastik bir şırınganın yumuşak ucuyla ezin.

Filtreyi 20 mililitre RPMI ortamı ile yıkayın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin. Peleti 20 mililitre boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün.

Hücre filtrasyonunu toplayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatanı atın.

Ardından, akış sitometrisi için boncuk tamponunda yeniden askıya alın. Kollajenaz tamponunu metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. GIST'i steril bir kaba koyun ve 2,5 mililitre kollajenaz tamponu ekleyin.

Steril bir neşter ve makas kullanarak, tümörü ince parçalar halinde olana kadar kesin. Tümörü ve kollajenazı 50 mililitrelik bir tüpe aspire etmek için büyük delikli bir pipet kullanın. Dakikada 100 dönüşte 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, ardından reaksiyonu iki mililitre FBS ile söndürün.

100 mikrometrelik bir filtrenin üzerine GIST örneği ile kollajenaz dökün ve tümörü üç mililitrelik plastik bir şırınganın yumuşak ucuyla ezin ve 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Filtreyi 20 mililitre HBSS ile yıkayın. Filtratı 450 RCF'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin, ardından süpernatanı atın.

Peleti 20 mililitre boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün Bir hemositometre kullanarak filtrat toplayın ve hücreleri sayın. Süper natantı santrifüj edin ve aspire edin, daha sonra akış sitometrisi için boncuk tamponunda yeniden askıya alın. Makas kullanarak, iç mukozayı açığa çıkarmak için çekumu uzunlamasına bölün.

0,5 santimetrelik bölümlere ayırın ve beş mililitre HBSS ve% 2 FBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın ve 20 saniye boyunca 450 RCF'de santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı atın.

İki milimolar EDTA ile beş ila 20 mililitre HBSS ekleyin. 15 dakika boyunca dakikada 100 dönüşte 37 santigrat derecede inkübe edin. Süper natantı santrifüj yapın ve atın, ardından peleti beş ila 20 mililitre HBSS'de yeniden askıya alın.

Karışımı 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın, ardından 20 saniye boyunca 450 RCF'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Peleti beş mililitre kollajenaz tamponunda yeniden askıya alın, ardından dakikada 100 rotasyonda 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her 10 dakikada bir kuvvetlice çalkalayın ve reaksiyonu iki mililitre FBS ile söndürün. Kollajenazı çekum örneği ile 100 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün ve üç mililitrelik plastik şırınganın yumuşak ucuyla ezin. Filtreyi 20 mililitre HBSS ile yıkayın ve filtrat toplayın.

Süpernatanı santrifüj yapın ve atın. Peleti 20 mililitre boncuk tamponunda yeniden askıya alın ve 40 mikrometrelik bir filtrenin üzerine dökün. Bir hemositometre kullanarak filtrat toplayın ve hücreleri sayın.

Santrifüjleme işlemini bir kez daha tekrarlayın ve akış sitometrisi için pelet tamponunda peleti yeniden askıya alın. Kit558 fareleri, ilerleyici bağırsak tıkanıklığı nedeniyle ortalama sekiz aylık bir ömre sahipti. Kit558 farelerinden gelen tümörler, tirozin kinaz KIT, transmembran kanalı Dog1 ve transkripsiyon faktörü ETV1 dahil olmak üzere GIST'in kanonik belirteçlerini eksprese etti.

Tümörler, insan GIST'ini yakından taklit eden aşağı akış belirteçleri ERK ve AKT veya immün mikro çevre gibi KIT sinyal yolundaki değişiklikler için incelenmiştir. MRG veya BT, tümör yanıtının doğru bir ölçümü olarak tümör hacmini izlemek için kullanıldı. Tümörün ileokolik bileştikten ve çekal kapaktan uzağa diseke edilmesi, gerçek tümör ağırlığını ve immün ve moleküler analizi yakalamak için önemlidir.

GİST içinde, bu model tümör mikroçevresinin ve immünoterapilerin araştırılmasına izin vermiştir.