Name: Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarıyla mesane kanseri organoidleri oluşturmayı. Bu yöntem, geleneksel üreme yöntemlerine göre haftalar içinde sonuç verir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma çalışması kısmen NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ve R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibesi), Roswell Park Alliance Vakfı ve Üroloji Dostları Vakfı tarafından desteklenmiştir. Marisa Blask ve Mila Pakhomova'ya makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan prosedürleri, Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (1395M, Biyogüvenlik 180501 ve 180502). NOT: Adım 1-3'ü aynı gün gerçekleştirin.
1. Fare mesanesinin diseksiyonu
<ol><li>Diseksiyon için hazırlık<ol>
<li>Makas, forseps, steril DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri 35 mm kültür tabaklarda, %70 etanol, steril gazlı bez ve temiz kağıt havlularda hazırlayın. Diseksiyon alanının tüm yüzeylerini temizleyin. Erkek üçlü flokslu fareler üretin Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f (4 fare, 10 haftalık), daha önce Dr. Goodrich'in laboratuvarında açıklandığı gibi 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ötenazi ve kesi<ol>
<li>Fareleri 2.0 L / dak akış hızı kullanarak CO2 boğulması ile ötenazileştirin, ardından servikal çıkık gelir. Diseksiyon alanını% 70 etanol ile temizleyin ve temiz bir kağıt havlu ile örtün.</li>
		<li>Fareyi diseksiyon alanındaki gazlı bezin üzerine yerleştirin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün ve mesaneye maruz kalan daha düşük bir orta hat karın kesisi yapmak için steril diseksiyon makası kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesanenin diseksiyonu<ol>
<li>Mesaneyi kavramak için forseps kullanın ve bilateral üreterovezik kavşakların tanımlanması için yavaşça yukarı çekin. İki üreter açıklığı arasındaki sınır çizgisini takip ederek mesane fundusunu çıkarmak için makas kullanın.</li>
		<li>Mesaneyi, 2 mL DPBS içeren steril bir kaba aktarın. Yağ ve bağ dokusunu çıkarın ve mesaneyi steril 2 mL DPBS içeren yeni bir kaba koyun. Bu zamanda, adenovirüsü -80 ° C depodan çıkarın ve buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ürotelyal hücrelerin ayrışması
<ol><li>Hücre ayrışması için hazırlık<ol>
<li>Forseps, cerrahi neşterler (saplı 10 boyutlu bıçak), 35 mm kültür tabaklarında steril DPBS, CCM(-) olarak tanımlanan kömürden arındırılmış FBS içermeyen komple kültür ortamı, kollajenaz/hyaluronidaz karışımı, tripsin yerine geçen rekombinant enzim, DPBS'de 10 μM taze Y-27632 ile %10 odun kömürü soyulmuş FBS, 100 μm steril hücre süzgeci ve 15 mL santrifüj tüpü dahil olmak üzere tüm steril aletleri hazırlayın. NOT: Tam kültür ortamı (CCM), sağlanan büyüme faktörleri ve% 5 odun kömürü soyulmuş FBS,% 1 L-glutamin ikamesi, 100 μg / mL primosin ve 10 μM taze Y-27632 ile desteklenmiş meme epitel hücresi büyüme ortamını içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesanenin kıyılması ve sindirilmesi<ol>
<li>Mesanenin 2 mL steril DPBS ile biyogüvenlik kabininde 35 mm'lik bir tabakta tekrar nakledilmesi ve yıkanması.</li>
		<li>Mesane dokularını dört fareden 1 mL CCM (-) içeren bir kaba toplayın ve cerrahi bir bıçak kullanarak her mesaneyi dört eşit parçaya bölün. Ürotelyum yüzeyini ortama maruz bırakmak için mesaneyi açmak için forseps kullanın.</li>
		<li>Mesane parçalarını ve ortamını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bulaşı 2 mL CCM (-) 2x ile yıkayın ve toplam 5 mL hacme kadar bir santrifüj tüpünde toplayın.</li>
		<li>Kollajenaz / hyaluronidaz karışımını 300 U / mL kollajenaz ve 100 U / mL hyaluronidaz nihai konsantrasyonuna ekleyin ve tüpü yatay olarak 37 ° C orbital inkübasyon çalkalayıcısına 200 rpm'de 30 dakika boyunca yerleştirin.</li>
		<li>Doku sindiriminden sonra, tüpe DPBS'de% 10 odun kömürü soyulmuş FBS'nin eşit hacmini (5 mL) ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süper natantı çıkarın ve atın. Hücre peletine 2 mL tripsin ikamesi ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpü 37 ° C'de bir hücre inkübatörüne ve% 5 CO2'ye 4 dakika boyunca koyun.</li>
		<li>Kuluçkadan sonra, standart bir P1000 ucu ile 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. DPBS'ye 5 mL'lik %10 odun kömürü soyulmuş FBS ekleyin.</li>
		<li>İlişkisiz hücreleri 100 μm steril hücre süzgeci ile süzün. Hücre süspansiyonunu ve santrifüjünü 5 dakika boyunca 200 x g'de toplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri sayma ve yeniden başlatma<ol>
<li>Süper natantı çıkarın ve atın. Hücre peletini 1 mL CCM ile yeniden askıya alın.</li>
		<li>Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve 0.5 mL taze CCM ile 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna sadece 0.5 x 106 hücre plakası yerleştirin. Bu zamanda, Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinin matris özlerini ( bakınız Malzeme Tablosu) -20 °C depolamadan çıkarın ve buz üzerinde çözün. 6 delikli bir plakayı 37 °C hücre inkübatöründe önceden ısıtın. NOT: Kalan hücreler, virüs dışı iletim kontrolü için hücre peletleri olarak santrifüj edilebilir ve dondurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Adenoviral transdüksiyon ve kaplama organoidleri
DİKKAT: Adenovirüsü işlerken lütfen dikkatli olun. Laboratuvar personeli biyogüvenlik seviye 2 uygulamalarını takip etmeli ve adenovirüsü %10 çamaşır suyu ile dezenfekte etmelidir.
<ol><li>24 delikli plakaya 2 μL adenovirüs (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU / μL) ekleyin. İlişkisiz ürotelyal hücrelerle iyice karıştırın.</li>
	<li>Transdüksiyon etkinliğini artırmak için, 24 delikli plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ederek spinokülasyon gerçekleştirin. 24 delikli plakayı 37 ° C'de bir hücre inkübatörüne ve% 5 CO2'ye 1 saat boyunca yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri ve ortamı kuyudan 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Süper nantantı çıkarın ve atın, 50 μL CCM ekleyin ve alttaki hücrelerle iyice karıştırın.</li>
	<li>140 μL matris özü ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için hafifçe karıştırın. Çözeltiyi, organoidler için kubbeler oluşturmak üzere 50 μL/kubbede önceden ısıtılmış 6 delikli plakaya hızlı bir şekilde ekleyin.</li>
	<li>Plakayı% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatöre yavaşça aktarın ve kubbelerin 5 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. 6 delikli plakayı baş aşağı çevirin ve 25 dakika daha katılaşmaya devam edin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa 2,5 mL CCM ekleyin ve plakayı organoid kültür için bir inkübatöre yerleştirin.</li>
</ol>4. Organoid kültürleme ve pasaj
<ol><li>Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Lee ve ark.9'da bildirildiği gibi organoid kültürleme, pasaj ve dondurma işlemlerini gerçekleştirin. Fujii ve ark.10'da açıklandığı gibi numune işleme jeli kullanarak organoidlerin gömülmesini gerçekleştirin.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 1 mL dispase ekleyin. Kubbeyi yavaşça kırın ve P1000 pipet ucuyla iyice karıştırın.</li>
	<li>Plakayı 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, tüm hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve kuyuyu DPBS'de 4 mL% 10 odun kömürü soyulmuş FBS ile yıkayın. Organoid hücreler büyük kümeler halinde görünüyorsa, Adım 2.2.6'yı gerçekleştirin. ve Adım 2.2.7. ilişkisiz hücreler almak için.</li>
	<li>Tüpü 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1 mL CCM ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri% 70 matris ekstraktında yeniden askıya alın ve Adım 3.4.-3.6'yı izleyin. kültürleme için. Alternatif olarak, hücreleri %90 odun kömürü soyulmuş FBS ve %10 DMSO'da 10 μM taze Y-27632 ile takviye ederek kriyoprotekte edin.</li>
</ol>5. Organoid hücrelerin deri altından C57BL / 6J fareye implantasyonu
<ol><li>İmplantasyon için hazırlık<ol>
<li>İğnelerde 25G 1.5, 1 mL şırınga, 1 mg / mL dispaz, matris ekstresi, DPBS'de% 10 odun kömürü soyulmuş FBS'yi 10 μM taze Y-27632 ve 15 mL santrifüj tüpü ile hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organoid hücre toplama<ol>
<li>En az 5 pasaj için stabil bir kültür elde ettikten sonra, in vivo enjeksiyon için genişletilmiş organoid hücreleri toplayın. 4.2.-4.4 Adımlarını izleyin. ve 1 mL CCM'deki hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücrelerin sayımı ve deri altı enjeksiyonu<ol>
<li>Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjlemeden sonra, DPBS'de% 50 matris ekstraktının 100 μL'sinde 2 x 106 hücreyi yeniden askıya alın. Süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve bir hayvan prosedür odasındaki bir biyogüvenlik kabinine alın.</li>
		<li>İki erkek C57BL/6J fareyi (10 haftalık) %4 izofluran ve 1 L/dkO2 akışı ile bir odada yaklaşık 4 dakika boyunca anestezi altına alın. Fareler sağ reflekslerini kaybettikten ve solunum şekilleri daha derin ve daha yavaş hale geldiğinde, fareleri% 2 izofluran ve 1 L / dakO2 akışı ile yeniden solunmayan bir devreye aktarın. Hayvanların gözlerini travmatik yaralanmalardan korumak için veteriner merhem uygulayın.</li>
		<li>Farenin sağ kanadındaki enjeksiyon bölgesinin etrafındaki bir alanı tıraş edin ve% 70 etanol kullanın ve ardından 100 μL hücre süspansiyonunu anestezi altında sağ kanada doğrudan enjekte etmek için 25 G'lik bir iğne kullanın.</li>
		<li>Enjeksiyondan sonra, inhalasyonel anesteziyi çıkarın ve fareleri tamamen iyileşene ve harekete geçene kadar bir ısı lambasının altındaki bir kafese yerleştirin. Fareleri barınma için iade edin ve tümör oluşumunu izleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Tümör toplanması ve in vivo yayılımı
<ol><li>Hazırlık Adım 2.1.1'i izleyin. 2.0 L / dak akış hızı kullanılarak CO 2 boğulması ile fareleri ötenazileştirin ve ardından ~ 2.0 cm çapında (yaklaşık2-3 hafta) bir tümör oluştuktan sonra servikal çıkık izler. Fareleri temiz bir diseksiyon alanına aktarın, fare yan tümör alanına% 70 etanol püskürtün ve tümörü ayırmak için bir kesi yapmak için steril diseksiyon makası ve forseps kullanın.</li>
	<li>Tümörü 5 mL DPBS ile 60 mm'lik bir tabakta yıkayın ve bağ dokusunu çıkarmak için makas kullanın. Taze tümörün bir parçasını kesin ve DPBS'de% 4 paraformaldehit ile 48 saat boyunca batırın ve histoloji analizi için parafin gömme ve bölümleme için gönderin.</li>
	<li>Hücre ayrışması için taze tümörün diğer yarısını işleyin. Kısaca, taze tümörü 5 mL CCM (-) ile 60 mm'lik bir tabakta ayrışma için 1mm3 parçaya bölün. Ardından, Adım 2.2.4.-2.2.8.'i izledikten sonra, Adım 5.3'ü takiben in vivo geçiş için ilişkisiz hücreleri yeni C57BL / 6J farelere enjekte edin. veya Adım 3.4.-3.6.'yı izleyerek in vitro organoid kültürü gibi tutun veya 10 μM taze Y-27632 ile% 90 odun kömürü soyulmuş FBS ve% 10 DMSO kullanarak% 90 odun kömürü soyulmuş FBS ve% 10 DMSO kullanarak doğrudan sıvı azotta dondurun.</li>
	<li>Gerekirse, donmuş hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözerek ve CCM (-) ile yıkayarak geri kazanın. Bundan sonra, in vivo tümör oluşumu için farelere doğrudan enjeksiyon için DPBS'de% 50 matris ekstraktının 100 μL'sinde onları askıya alın. Bir in vivo enjeksiyon için en az 2 x 106 çözülmüş hücre kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li>
<li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li>
<li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li>
<li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids%3A+A+tool+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li>
<li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+bladder+cancer+in+mice%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li>
<li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li>
<li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li>
<li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f%28high%29+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407(2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li>
<li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li>
<li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160(2010).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118(2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

GEMM'ler, normal hücrelerden başlatılan kanser modellemesi için altın standartlar olmuştur ve potansiyel onkojenik pertürbasyonların (onkogen aktivasyonu ve / veya tümör baskılayıcıların kaybı) sonuçlarının titizlikle test edilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidlerinin üretilmesi için hızlı ve etkili bir protokol sağlanmaktadır. H&E ve IHC boyaması, TKO organoidlerinin yüksek dereceli ürotel...

Mesane kanseri erkeklerde dördüncü en sık görülen kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 80.000'den fazla insanı etkilemektedir1. Platin bazlı kemoterapi, otuz yıldan fazla bir süredir ilerlemiş mesane kanseri olan hastalar için standart bakım olmuştur. Mesane kanseri tedavisinin manzarası, immünoterapi (anti-PD-1 ve anti-PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri), erdafitinib (bir fibroblast büyüme faktörü reseptör inhibitörü) ve enfortumab vedotin (bir antikor-ilaç konjugat) 2,3,4'ün son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onayı ile devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, kemoterapi veya immünoterapiye yanıtları tahmin etmek için klinik olarak onaylanmış biyobelirteçler mevcut değildir. Mesane kanseri progresyonunu yönlendiren mekanizmaların anlaşılmasını geliştirebilecek ve farklı tedavi modaliteleri için prediktif biyobelirteçler geliştirebilecek bilgilendirici preklinik modeller üretmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Mesane translasyonel araştırmalarında önemli bir engel, insan mesane kanseri patogenezini ve tedavi yanıtlarını özetleyen preklinik modellerin bulunmamasıdır 5,6. İn vitro 2D modeller (hücre hatları veya şartlı olarak yeniden programlanmış hücreler), in vitro 3D modeller (organoidler, 3D baskı) ve in vivo modeller (ksenogreft, kanserojen kaynaklı, genetik olarak tasarlanmış modeller ve hasta kaynaklı ksenograft) dahil olmak üzere çoklu klinik öncesi modeller geliştirilmiştir2,6. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM'ler), tümör fenotiplerinin analizleri, aday genlerin ve / veya sinyal yolaklarının mekanik araştırmaları ve terapötik yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi dahil olmak üzere mesane kanseri biyolojisindeki birçok uygulama için yararlıdır 6,7. GEMM'ler, bir veya daha fazla tümör baskılayıcı gendeki genetik delesyonları kontrol etmek için bölgeye özgü rekombinazları (Cre-loxP) kullanabilir. Çoklu gen delesyonları ile istenen GEM'leri üretme süreci zaman alıcı, zahmetli ve pahalıdır5. Bu yöntemin genel amacı, üçlü flokslu aleller (Trp53, Pten ve Rb1)8 taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinden mesane üçlü nakavt (TKO) modellerinin oluşturulması için hızlı ve etkili bir ex vivo Cre dağıtım yöntemi geliştirmektir. Exvivo yönteminin en büyük avantajı hızlı iş akışıdır (yıllarca fare yetiştiriciliği yerine 1-2 hafta). Bu makalede, immünkompetan C57 BL/6J farelerde floksed aleller, ex vivo adenovirüs transdüksiyonu, organoid kültürler ve in vitro ve in vivo karakterizasyon ile normal ürotelyal hücrelerin toplanması için protokol anlatılmaktadır. Bu yöntem, floksed alellerin herhangi bir kombinasyonunu barındıran immünkompetan farelerde klinik olarak ilgili mesane kanseri organoidleri üretmek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>100 ve mu; m steril hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>25G 1.5 inç iğne</td><td>EXELINT International</td><td>26406</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirüs (Ad5CMVCre Yüksek Titre, 1E11 pfu/ml)</td><td>UI Viral Vektör Çekirdeği</td><td>VVC-U Iowa-5-HT</td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Kömürle soyulmuş FBS</td><td>Gibco</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz / hyaluronidaz</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07912</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin ikamesi (GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Meme Epitel Hücresi Büyüme ortamı</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth'ten matris alıntıları&ndash; Merhaba; Sürü fare sarkomları (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-CK20</td><td>DAKO</td><td>M7019</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-CK7</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-23876</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab735</td><td>IHC 1:100, IF 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-Upk3</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-U103A</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-Vimentin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-6260</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonal sıçan anti-CK8</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>TROMA-I-s</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i CO2 kuluçka makinesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal tavuk anti-CK5</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin ikamesinin rekombinant enzimi (TrypLE Express Enzimi)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Signature tezgah üstü sallama inkübatörü Model 1575</td><td>VWR</td><td>35962-091</td><td></td></tr><tr><td>Numune İşleme Jeli (HistoGel)</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi bıçak boyutu 10</td><td>Integra Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T1 santrifüj</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002383</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

eski vivo fare Ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-cre aracılı gen delesyonlarının organoid modeli

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Mesane kanseri, özellikle genetiği değiştirilmiş fare modellerinde (GEMM'ler) az çalışılmış bir alandır. Dokuya özgü Cre ve loxP bölgelerine sahip inbred GEMM'ler, koşullu veya indüklenebilir gen hedeflemesi için altın standartlar olmuştur. Daha hızlı ve daha verimli deneysel modeller sağlamak için, adenovirüs Cre ve tümör baskılayıcıları Trp53, Pten ve Rb1'in çoklu loxP alellerini taşıyan normal ürotelyal hücreler kullanılarak bir ex vivo organoid kültür sistemi geliştirilmiştir. Normal ürotelyal hücreler, üçlü flokslu farelerin dört mesanesinden enzimatik olarak ayrılır (Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f). Ürotelyal hücreler, bir CMV promotörü (Ad5CMVCre) tarafından tahrik edilen adenovirüs-Cre ile ex vivo olarak dönüştürülür. Transdüke mesane organoidleri kültürlenir, yayılır ve in vitro ve in vivo olarak karakterize edilir. PCR, Trp53, Pten ve Rb1'deki gen delesyonlarını doğrulamak için kullanılır. Organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması, ürotelyal soy belirteçlerinin (CK5 ve p63) pozitif ekspresyonunu gösterir. Organoidler, tümör genişlemesi ve seri pasajlar için konakçı farelere deri altından enjekte edilir. Ksenogreftlerin immünohistokimyası (IHC), CK7, CK5 ve p63'ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3'ün negatif ekspresyonunu sergiler. Özetle, loxP bölgeleri ile tasarlanmış fare ürotelyal hücrelerinden adenovirüs aracılı gen delesyonu, tanımlanmış genetik değişikliklerin tümörojenik potansiyelini hızlı bir şekilde test etmek için etkili bir yöntemdir.

Fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarının iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Eşlik eden video, ürotelyal hücrelerin mesanenin fundusundan nasıl ayrıldığını ve üçlü floksed hücrelerin Ad5CMVCre ile ex vivo olarak nasıl dönüştürüldüğünü göstermektedir. Şekil 1A , minimal submukoza ve kas hücrelerinin enzim sindiriminden sonra ilişkisinin kesildiğini göstermiştir. Adenovirüs-Cre dağıtımının etkinliğini doğrulamak için, membra...

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

İlgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidleri üretmek için hızlı ve etkili bir protokol geliştirdik. Bu ex vivo yöntem, yıllarca fare yetiştiriciliği yerine bir ila iki haftalık bir iş akışına sahiptir ve Cre-mediated gen delesyonlarında adenovirüs transdüksiyonunda oldukça etkilidir. Başlamak için, makas, forseps, DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri ve reaktifleri 35 mililitrelik kültür tabaklarında,% 70 etanol, gazlı bez ve temiz kağıt havlularda hazırlayın.Ardından, diseksiyon alanının tüm yüzeylerini temizleyin ve diseksiyon alanını temiz bir kağıt havlu ile örtün. Ötenazi fareyi diseksiyon bölgesindeki gazlı bezin üzerine yerleştirin ve farenin karnına% 70 etanol püskürtün, ardından steril diseksiyon makası kullanarak, mesaneyi açığa çıkarmak için daha düşük bir orta hat karın kesisi yapın. Şimdi, forsepsleri kullanarak iki taraflı üreterovezik kavşağı tanımlamak için mesaneyi yavaşça yukarı çekin.Makas kullanarak, iki üreter açıklığı arasındaki sınır çizgisini izleyerek mesane fundusunu çıkarın ve mesaneyi 2 mililitre DPBS içeren steril bir kaba aktarın, ardından yağ ve bağ do

ex-vivo-organoid-model-adenovirus-cre-mediated-gene-deletions-mouse

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Mechanosensory saç hücreleri iç kulak reseptör hücrelerdir.

Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu

Bu videoda, segmental adeno-cre enfeksiyonu ile kolorektal fare modelinin oluşturulması anlatılmaktadır. Enfekte kolon segmenti, mukozanın bu segmentinde tümörigeneze yol açar ve sonuçta adenomların invaziv ve metastatik karsinoma ilerlemesine neden olur. Bu model, kanser biyolojisi çalışmaları ve klinik öncesi terapötik çalışmalar için çekici bir platformdur.

Segmental Adeno-Cre Enfeksiyonu: Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modelleri Kullanılarak İzole Kolorektal Kanser Oluşturma Tekniği

Bu videoda, adenovirüs tabanlı bir dağıtım sistemi kullanarak prostat bezi hücrelerindeki belirli genleri düzenlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım, prostat kanseri için yeni fare modelleri geliştirmek için CRISPR teknolojisini kullanarak gen ekspresyonunun ortotopik ve lokalize değiştirilmesine izin verir.

Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modellerinde Prostat Kanserinin Modellenmesi: Fare Ön Prostat Lob Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Aracılı Lokalize Gen Düzenleme Tekniği

Bu video, üretral kateterizasyon ve elektroporasyon tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak DNA plazmidinin fare mesanesinin ürotelyumuna verilmesini göstermektedir. Açıklanan prosedür, fare mesane kanseri modellerinin oluşturulmasına izin verir.

DNA Plazmitlerinin Fare Mesanesinin Urothelium'una Verilmesi: Genetik Olarak Tasarlanmış Modeller Oluşturmak için DNA Plazmitlerini Murin Mesanesinin Ürotelyal Hücrelerine Verimli Bir Şekilde Vermek İçin Elektroporasyon Tabanlı Bir Prosedür

Kaynaklı organ içine kanser hücrelerinin implantasyonu yeni tedaviler değerlendirmek için yararlı bir ön-klinik modeli olarak hizmet edebilir. MB49 mesane karsinom hücreleri intravezikal Damla damla akıtma sonrası mesane içinde yetiştirilebilir. Bu protokol, tümör implantasyonu ve adenoviral teslimat amacıyla fare mesane kateterizasyon gösterir.

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Segmental adeno-cre enfeksiyonu ile genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kurulması ve yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile gözlemlenmesi için bir protokol sunulmuştur.

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

Bu protokol, 2D olarak yetiştirilen bir mare prostat organoidi tabanlı modelin oluşturulmasını tanımlar. Organoid ayrıştırma, hücre tohumlama, farklılaşma, epitel bütünlüğü değerlendirmesi ve üropatogenik Escherichia coli ile in vitro enfeksiyonu içerir. Model, apikal erişilebilirlik sağlar ve geleneksel 3B organoid sistemlerin sınırlamalarını aşarak konak-patojen etkileşimlerini incelemek için uygundur.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek İçin Fare Prostat Organoid-Tabanlı Modelin Oluşturulması

Öğrenin, fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarıyla mesane kanseri organoidleri oluşturmayı. Bu yöntem, geleneksel üreme yöntemlerine göre haftalar içinde sonuç verir.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Daha fazla video keşfet