Name: Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Keşfedin, boyut dışlama kromatografisi ile Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini nasıl zenginleştirebilirsiniz. Bu yöntem, yüksek verimli ve minimal protein kirliliğiyle tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Veteriner Hekimliği ve Biyomedikal Bilimler Fakültesi Deneyimsel Ödülü ve Üniversite Araştırma Konseyi Ortak Araştırma Programı'nın NKG'ye verdiği desteği ve ATCC'nin (ödül # 2016-0550-0002) KMD'ye sağladığı desteği kabul etmek istiyoruz. Ayrıca teknik destek için Anne Simpson'a ve aşağıdaki reaktifler için BEI Resources, NIAID, NIH'ye teşekkür ederiz: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (in vitro olarak üretilmiştir), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (in vitro olarak üretilmiştir), NR-49223 ve Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (in vitro olarak üretilmiştir), NR-13811.

Colorado Eyalet Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi bu çalışmayı onayladı (19-046B). Mycobacterium tuberculosis yetiştiriciliği ve EV bakımından zengin kültür süpernatantlarının toplanması, yüksek muhafazalı bir laboratuvarda eğitimli personel tarafından gerçekleştirildi. Malzemeler, geçerli bir inaktivasyon yöntemi uygulandıktan sonra, kurumsal biyogüvenlik politikaları tarafından onaylandıktan ve onaylandıktan sonra yüksek muhafazalı alandan çıkarıldı. Protokolün çoğaltılması sırasında, doğrulanmış inaktivasyon veya steril filtrasyon yöntemi mümkün değilse, aşağıdaki prosedürlerin yüksek muhafazalı bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir.
1. Ham Mtb EV konsantresinin hazırlanması
NOT: Mtb yetiştiriciliği ve kültür filtrat proteininin (CFP) hazırlanması ile ilgili ayrıntılı prosedürler için bakınız Referans11,12. Bakteriyel kültür ortamının, Oleik Albümin Dekstroz Katalaz (OADC) gibi EV içeren veya proteinli bileşenlere sahip büyüme takviyelerinden ve Tween gibi deterjanlardan arındırılmış olması önerilir. Ayrıca, sınırlı hücre ölümü ve lizis13,14 sağlamak için bakteri kültürünün kalitesinin ve hasat edilen CFP'nin taranması önerilir.
<ol><li>Fosfat tamponlu salinin (1x PBS) tam hacim kapasitesini ekleyerek 100 kDa moleküler ağırlıklı kesme (MWCO) santrifüj filtre hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 4 °C'de 2.800 x g'de 5 dakika santrifüj. NOT: Ölü durdurma hacmi olmayan bir filtre kullanılıyorsa, numune hacminin filtre seviyesinin altına düşmemesine dikkat edilmelidir, bu da santrifüjleme sırasında filtrenin tamamen kurumasına neden olur.</li>
	<li>Numune haznesini Mtb CFP ile maksimum kapasitesine doldurmadan önce akışı ve kalan PBS'yi atın. 4 °C'de 2.800 x g'de santrifüj, ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar. Gerektiğinde tekrarlayın, numunenin tamamı yeterince azaltılana kadar üniteye daha fazla CFP ekleyin. NOT: İsterseniz aşağı akış kalifikasyonu için 100 kDa akış (100F) malzemesinin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Toplam cihaz kapasitesine kadar konsantreyi içeren filtre ünitesine 1x PBS ekleyin. Ses düzeyini 1.2'de açıklandığı gibi azaltın. Tam yıkama ve tampon değişimini sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın.</li>
	<li>100 kDa konsantre CFP retentatını (100R) ultrafiltrasyon cihazı spesifikasyonlarına göre geri kazanın (bkz. 100R geri kazanıldıktan sonra, filtreyi en az üç kez minimum 1x PBS hacmiyle yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile birleştirin.</li>
	<li>100R malzemeyi, üreticinin talimatlarını izleyerek bikinkoninik bir tahlil (BCA) ile kantitatlandırın (bkz. Testi gerçekleştirmek için, PBS'de 1:2, 1:5 ve 1:10 örneklerinin birkaç seyreltilmesini kullanın. Numuneyi üçlü olarak test edin. NOT: İsterseniz aşağı akış kalifikasyonu için 100R malzemenin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. CFP'den Mtb EV'lerin zenginleştirilmesi için boyut hariç tutma kromatografisi
NOT: Aşağıdaki prosedür, SEC sütunu ve otomatik fraksiyon toplayıcı ile 3 mg 100R Mtb CFP kullanımı için özeldir (AFC , bkz. Üreticinin spesifikasyonlarına uyarak diğer başlangıç konsantrasyonları ve kolon tipleri için uyarlanabilir. Ek olarak, kullanıcıların otomatik kesir toplayıcı kullanım kılavuzunu okumaları ve anlamaları önerilir.
<ol><li>SEC sütununun oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.</li>
	<li>Kule ünitesinin arkasındaki güç düğmesini kullanarak AFC'yi açın ve gerekirse ana menü dokunmatik ekranında AYARLAR düğmesine basarak yük hücresinin ayarlarını yapın. Yük hücresi yalnızca ilk kullanımda, her yazılım güncellemesinden sonra ve kesir toplama hacimlerinde tutarsızlık fark edilirse kalibre edilmelidir.</li>
	<li>KURULUM ekranından, CAROUSEL > CALIBRATE'i seçerek döngüyü hizalayın. Atlıkarınca 13 küçük delik AFC kulesine bakacak şekilde yerleştirin ve - ve/veya + düğmelerine basarak karuseli sıvı nozulu doğrudan yıkama konumunun üzerinde olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Dengelenmiş SEC sütunundan kapakları kaldırın. SEC sütununu uygun sütun yuvasına kaydırın ve AFC kulesine dikkatlice takın. AFC'ye bakan sütundaki radyo frekansı tanımlama (RFID) etiketinin bulunduğundan emin olun ve sütun ile valf arasındaki bağlantının sağlam olup olmadığını kontrol edin. Atık çıkış borusunu bir toplama kabına yerleştirin.</li>
	<li>KURULUM ekranından Koleksiyon Programı'nı seçin ve - ve/veya + düğmelerine basarak sayıyı 13'e, boyutu ise 0,5 mL'ye ayarlayın. "Arabellek Birimi" ayarını varsayılan 2,7 mL olarak bırakın ve ardından X tuşuna basarak "Toplama Programı" penceresini kapatın.</li>
	<li>Giriş ekranından COLLECT'i BAŞLAT'ı seçin ve EVET'i seçerek koleksiyon parametrelerini onaylayın. 13 etiketli 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerini, kapakları açık ve atlıkarınca merkezine doğru işaret edecek şekilde yükleyin.</li>
	<li>Tamam'ı seçerek AFC'yi ilerletin, ardından sütun rezervuarını takın ve Tamam tuşuna basarak tekrar ilerleyin. EVET tuşuna basarak sütunu temizleme seçeneğini belirleyin ve depolama arabelleğini kaldırmak için 0,2 μm filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi ekleyin. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, Tamam düğmesine basarak AFC'yi ilerletin.</li>
	<li>Dönen kapağı AFC'nin üzerine yerleştirin ve Tamam'a basın. 0,2 μm filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi hazırlayın. Sütundaki fazla tamponu çıkarmak için pipet kullanın.</li>
	<li>1x PBS ile adım 1.5 ila 500 μL'de ölçülen 3 mg 100R numune getirin. 3 mg'lık örneği sütunun en üstüne ekleyin. AFC'yi ilerletin ve numunenin frit'e girmesine izin verin. Örnek sütuna tamamen girdikten sonra, adım 2.6'da hazırlanan PBS'yi rezervuara ekleyin.</li>
	<li>AFC'nin çalışmasını izlerken önce boşluk hacmini ve ardından belirtilen kesirleri toplar. Çalıştırma tamamlandıktan ve atlıkarınca atık konumuna döndükten sonra, kapağı çıkarın ve fraksiyon tüplerini döngüden çıkarın. Kesirleri nicelleştirme (adım 3) ve kalifikasyondan (adım 4) önce 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Sütun yeniden kullanılacaksa, EVET tuşuna basarak sütunu temizleme seçeneğini belirleyin; aksi takdirde, HAYIR tuşuna basın. AFC'deki yönergeleri izleyin. NOT: Sütun yıkandıktan ve depolama arabelleği geçtikten sonra, 4 °C'de çıkarılabilir, kapatılabilir ve saklanabilir.</li>
</ol>3. Mtb EV'lerin nicelleştirilmesi
<ol><li>BCA ve mikro BCA12 kullanarak her fraksiyon için protein konsantrasyonunu ölçün.<ol>
<li>3 mg 100R Mtb CFP'den toplanan 0,5 mL fraksiyonlar için, her bir numunenin 1-7'sini üçlü olarak numaralandırılan fraksiyonlar için 1: 3 seyreltme ile mikro BCA'yı kullanın.</li>
		<li>5-13 olarak numaralandırılmış 0,5 mL fraksiyonlar için, üçlü olarak her numune için seyreltme olmadan BCA'yı kullanın. NOT: 5-7 kesirleri için tahlillerin üst üste binmesi, tüm kesirlerin okunabilir bir çıktıya sahip olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak her fraksiyon için partikül konsantrasyonunu sayısallaştırın.<ol>
<li>Aşağıdaki önerilen başlangıç oranlarını kullanarak numuneleri 1 mL 1x PBS içinde seyreltin; 1-3 kesirleri için 1:100 kullanın ve ardından kalan kesirler için 1:10 seyreltme kullanın.</li>
		<li>Seyreltilmiş çözeltileri vorteksleyin ve ardından numuneyi 1 mL'lik tek kullanımlık bir şırıngaya çekin. Şırıngayı varsa otomatik bir şırınga pompasına yerleştirin.</li>
		<li>Şırınga pompasını 30 μL / dak'ya ayarlayın ve video yakalama ayarlarını 10-12 ekran kazancı ve 10-12 kamera seviyesi ile kullanın. Her örnek için odağı ayarlayın.</li>
		<li>Sabit bir akış kullanarak her biri 30 sn'de en az üç video toplayın.</li>
		<li>Yazılım algılama eşiği beş olarak ayarlanmış olarak analizi gerçekleştirin. NOT: Önemli numune hacminden ödün vermeden en son fraksiyonlar (>7) için NTA verileri elde etmek mümkün olmayabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mtb EV'lerin Yeterliliği
<ol><li>Gümüş lekeli bir protein jeli kullanarak her fraksiyonun genel protein profilini görselleştirin. NOT: SDS-PAGE ve gümüş lekesi için ayrıntılı prosedürler Referans15'te bulunabilir.<ol>
<li>SDS numune tamponunu her fraksiyonun 10 μL'sine ve 5 μg CFP, 100R ve 100F'ye ekleyin. 100 °C'de 5 dakika kaynatın, ardından poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) için moleküler ağırlıklı bir merdivenle% 4 -% 12'lik bir Bis-Tris Jeli üzerine yükleyin (bkz.</li>
		<li>Jeli 1x 2-[N-morfolino] etansülfonik asit (MES) çalışan tampon (bkz. Malzeme Tablosu) ve 35 dakika boyunca 200 V akım kullanarak çalıştırın.</li>
		<li>Jeli kasetten çıkarın ve gümüş boyama15 ile devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her fraksiyondaki EV belirteçlerinin varlığını veya yokluğunu Western blot ile değerlendirin. NOT: Batı lekelemesi için ayrıntılı prosedürler Referans15'te bulunabilir.<ol>
<li>4.1.1-4.1.2 adımlarında açıklandığı gibi bir SDS-PAGE jeli çalıştırın.</li>
		<li>Jeli kasetten çıkarın ve çözünmüş proteinleri en az 1 saat boyunca 50 V'luk bir akım uygulayarak 0.2 μm'lik bir nitroselüloz membrana aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>İlgilenilen proteinleri değerlendirmek için Batı leke analizi yapın. LpqH, lipoarabinomannan (LAM) ve GroES'e karşı birincil antikorlar (bakınız Malzeme Tablosu) önerilir.</li>
		<li>Havuz fraksiyonları, aşağı akış uygulaması için geçerli olan işaretleyicilerin varlığına veya yokluğuna dayanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İletim elektron mikroskobu (TEM) ile sağlam veziküllerin varlığını doğrulayın.<ol>
<li>Vezikül numunesinin 15 μL'sini, 15 μL% 4 EM dereceli paraformaldehit ekleyerek sabitleyin ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Yüzeyi temizleyerek ve hidrofilik bir substrat yaparak 200 örgülü formvar-karbon kaplı bakır TEM ızgarası hazırlayın. NOT: 1 dakika boyunca %95 argon, %5 oksijen ve %30 plazma gücü ile plazma temizliği önerilir.</li>
		<li>Sabit numunenin 10 μL'sini ızgaraya bırakın ve numunenin 10 dakika boyunca yapışmasını bekleyin, ardından fazla sıvıyı filtre kağıdıyla temizleyin.</li>
		<li>Izgarayı 30 saniye boyunca bir damla ultra saf su üzerinde yüzdürün, ardından fazla sıvıyı temizleyin.</li>
		<li>Izgarayı 2 dakika boyunca% d% EM dereceli uranil asetat damlası üzerinde yüzdürün, ardından fazla sıvıyı temizleyin.</li>
		<li>Izgaranın tamamen kurumasını bekleyin.</li>
		<li>100 kV veya benzeri bir TEM (bkz. Malzeme Tablosu) kullanan görüntü. NOT: Aşağı akış uygulamalarına dayalı olarak diğer EV kantitasyon ve karakterizasyon yöntemleri kullanılmalıdır. Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi18, tüm EV çalışmalarının titizliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için kılavuzlar için başvurulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921(2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li>
<li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li>
<li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li>
<li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022).</li>
<li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li>
<li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans%3A+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li>
<li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküller, onları tanı araçları ve gelecekteki aşılar geliştirmek için cazip bir yol olarak sunan oldukça antijenik rezervuarlardır 4,19,20. Tarihsel olarak, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme, Mtb EV'leri diğer çözünür, salgılanan malzemelerden ayırmak için kullanılmıştır8. Bu süreç etkili olsa da, aynı zamanda zaman alıcı, teknik olarak zorlayıcıdır ve o...

Patojenler tarafından hücre dışı vezikül (EV) salınımı, bulaşıcı hastalıkları kontrol etmek için yeni teknolojilerin kilidini açmanın anahtarı olabilir1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dünya nüfusunun yaklaşık üçte birini enfekte eden ve her yıl milyonlarca insanın hayatına mal olan yüksek sonuçlu bir patojendir2. Mtb tarafından EV üretimi, enfeksiyonbağlamında bu EV'lerin biyogenezinde ve çeşitli rollerinde (yani, immünostimülatör, immünosüpresif, demir ve besin edinimi) iyi belgelenmiştir, ancak zordur 3,4,5. Mtb EV'lerin bileşimini anlama çabaları, immünolojik öneme sahip lipitler ve proteinler içeren plazma zarından türetilen 50-150 nm lipid membranı ile kaplı küreleri ortaya çıkardı 3,6. Mtb EV'lerin bakteriyel fizyolojideki rolünün araştırılması, hayatta kalma için çevresel strese yanıt olarak bakteriyel EV modülasyonunun önemini ortaya koymuştur5. Konakçı-patojen etkileşim çalışmalarının yorumlanması daha karmaşık olmuştur, ancak kanıtlar Mtb EV'lerin konakçının bağışıklık tepkisini etkileyebileceğini ve potansiyel olarak etkili bir aşılama bileşeniolarak hizmet edebileceğini göstermektedir 3,4,7.
Mtb EV'ler üzerinde şimdiye kadar yapılan çalışmaların çoğu, vezikül zenginleştirme8 için yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemesine dayanmaktadır. Bu, küçük ölçekli çalışmalar için etkili olmuştur; Bununla birlikte, bu tekniğin çeşitli teknik ve lojistik zorlukları vardır. Alternatif iş akışları, tüm hücrelerin ve büyük kalıntıların giderilmesi için çok adımlı santrifüjlemeyi, pelet EV'lere son bir ultrasantrifüjleme adımıyla birleştirir. Bu metodoloji verimlilikte değişebilir ve genellikle düşük verim ve vezikül ile ilişkili olmayan biyomoleküllerin birlikte saflaştırılması ile sonuçlanırken, aynı zamanda vezikül bütünlüğünü de etkiler9. Ek olarak, bu işlem zaman alıcıdır, manuel olarak yoğundur ve ekipman kısıtlamaları nedeniyle verim açısından çok sınırlıdır.
Mevcut protokol, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye alternatif bir teknik tanımlamaktadır: boyut dışlama kromatografisi (SEC). Bu yöntem çevresel mikobakteriler için gösterilmiştir ve mevcut çalışmada Mtb10'a ekstrapolasyon yapılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen bir kolon ve otomatik fraksiyon toplayıcı, vezikal preparatta tutarlılığı artırabilir ve spesifik, pahalı ekipman ihtiyacını azaltabilir. Bu protokolü, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile karşılaştırıldığında zamanın bir kısmında tamamlamak ve verimi artırmak da mümkündür. Bu teknik teknik olarak daha az zordur, ustalaşmayı kolaylaştırır ve laboratuvarlar arası / laboratuvar içi tekrarlanabilirliği artırabilir. Son olarak, SEC yüksek ayırma verimliliğine sahiptir ve veziküllerin bütünlüğünü koruyan naziktir.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS Çalışan Tampon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Fraksiyon Toplayıcı</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Önceden Boyanmış Protein Merdiveni</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 Santrifüj filtre, 100 kDa kesme</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>Adım 1.1'de kullanılan Ultrafiltrasyon cihazı Elektroblotting</td></tr><tr><td>Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>EM Sınıfı Paraformaldehit Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar / Karbon 200 mesh Cu Izgaraları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alkalin Fosfataz), tüm molekül, 1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>JOEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3814c)</td><td>BEI Kaynakları</td><td>NR-49223</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Monoklonal Anti- Mycobacterium tuberculosis LpqH (gen Rv3763)</td><td>BEI Kaynakları</td><td>NR-13792</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Monokolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Klon CS-35</td><td>BEI Kaynakları</td><td>NR-13811</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası ve NanoSight NTA yazılımına sahip bilgisayar ile donatılmış</td> TEM ızgarası Nanosight'ın plazma temizliği için <td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran, Roll, 0.2 & mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, 1X kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Temel Güç Kaynağı</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Orijinal 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC sütunu</td></tr><tr><td>SDS örnek tamponu</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>Bu prosedürde kullanılan şirket içi tarif, ancak bu ürün eşdeğerdir</td></tr><tr><td>SDS-PAGE jel haznesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş Leke Artı Kiti</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>Bu prosedürde kullanılan kurum içi protokoldür, ancak bu kit eşdeğerdir</td></tr><tr><td>Uranil Asetat Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis boyut dışlama kromatografisi ile hücre dışı vezikül zenginleştirme

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Bakteriyel enfeksiyon bağlamında hücre dışı veziküllerin (EV'ler) rolü, mikrobiyal fizyolojiyi anlamak için yeni bir yol olarak ortaya çıkmıştır. Spesifik olarak, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV'leri konakçı-patojen etkileşiminde ve çevresel strese yanıtta rol oynamaktadır. Mtb EV'ler ayrıca oldukça antijeniktir ve aşı bileşenleri olarak potansiyel gösterir. Mtb EV'leri saflaştırmak için en yaygın yöntem yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemedir. Bu işlemin düşük verim, düşük verim, pahalı ekipmanlara bağımlılık, teknik zorluklar gibi çeşitli sınırlamaları vardır ve ortaya çıkan hazırlığı olumsuz yönde etkileyebilir. Boyut dışlama kromatografisi (SEC), ultrasantrifüjlemenin birçok sınırlamasıyla mücadele eden daha yumuşak bir alternatif yöntemdir. Bu protokol, SEC'in Mtb EV zenginleştirmesi için etkili olduğunu ve hızlı ve ölçeklenebilir bir şekilde artan verime sahip yüksek kaliteli Mtb EV preparatları ürettiğini göstermektedir. Ek olarak, niceleme ve kalifikasyon prosedürleri ile yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile yapılan bir karşılaştırma, SEC'in faydalarını göstermektedir. EV miktarının (nanopartikül izleme analizi), fenotipin (transmisyon elektron mikroskobu) ve içeriğinin (Batı lekelenmesi) değerlendirilmesi Mtb EV'lere uyarlanırken, sağlanan iş akışı diğer mikobakterilere uygulanabilir.

Mycobacterium tuberculosis'ten (Mtb) kültür filtrat proteini (CFP) konsantre edildi, nicelleştirildi ve daha sonra bir boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonuna 3 mg materyal uygulandı. Protein ve parçacık konsantrasyonları sırasıyla BCA ve NTA ile numaralandırıldı. Protein ve partikül geri kazanımı için beklenen aralıklar ve bu sonuçlar için elde edilen kesin değerler Tablo 1'de bildirilmiştir. Bu aralıklardan çok daha yüksek değerler kontaminasyon veya kolon bütünlüğü sorunlarını gösterebili...

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV'lerden hücre dışı veziküllerin zenginleştirilmesi için gereken teknik karmaşıklığı ve zamanı azaltır. Geleneksel ultrasantrifüjleme ve yoğunluğa dayalı tekniklere nazik bir alternatif sunar. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin kolay olması ve daha tekrarlanabilir hale getirilmesidir.Minimum EV olmayan protein ortak zenginleştirme ile yüksek verim Mtb EV'ler sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızın eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Joanie Ryan olacak. Başlamak için, PBS'nin tam hacim kapasitesini ekleyerek 100 kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtresi hazırlayın.2'de beş dakika santrifüj, 4 santigrat derecede 800 kez G. Akış akışını ve kalan PBS'yi atın ve numune haznesini maksimum kapasitesine kadar Mtb CFP ile doldurun. 2'de santrifüj, hacim ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar 4 santigrat derecede G'de 800 kez.Tüm numune yeterince azaltılana kadar gerektiği kadar tekrarlayın. Toplam cihaz kapasitesine kadar konsantreyi içeren filtre ünitesine 1X PBS ekleyin. Ses seviyesini daha önce açıklandığı gibi azaltın ve tam yıkama ve tampon değişimi sağlamak için bu adımı beş kez tekrarla

mycobacterium-tuberculosis-extracellular-vesicle-enrichment-through

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, konakçı ortamı taklit eden demir sınırlayıcı koşullar altında kültürlenen Mycobacterium tuberculosis'ten hücre dışı veziküllerin (EV'ler) aşamalı izolasyonunu göstermektedir. EV içeren fraksiyonları zenginleştirmek ve tanımlamak için ultrafiltrasyon, diferansiyel santrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ayırmanın kullanımını...

Mycobacterium tuberculosis'ten Siderofor İçeren Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Watson, D.C., ve diğerleri. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) bir bakteri kültürü filtratından izole etmek için gözenekli reçine boncukları ile boyut dışlama kromatografisinin kullanımını göstermektedir. Daha büyük EV'ler reçine gözeneklerini atlayarak erken ayrışırken, daha küçük proteinler gözeneklere girer ve daha sonra ayrışır.

Boyut Dışlama Kromatografisi Kullanılarak Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu 

Bu videoda, bakterilerden türetilen heterojen bir dış zar vezikülleri veya OMV popülasyonunu ayırmak için bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini gösteriyoruz. Bu veziküller nano boyutlu küresel yapılardır ve Boyut Dışlama Kromatografisi ile boyutlarına göre büyük ve küçük alt popülasyonlara ayrılır.

Bakteri hücre dışı veziküllerin boyut dışlama kromatografisine dayalı ayrılması: Gram negatif bakteriyel dış zar veziküllerinin heterojen popülasyonunu boyutlarına göre ayırmak için bir teknik

Bu video, ultrafiltrasyon kullanılarak bakteriyel hücre dışı vezikülleri içeren bakteri kültürü filtrat proteinlerinin izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. Konsantre hücre dışı veziküller, hastalık tespiti için tanısal belirteçler olarak işlev görür.

Bakteri Kültürü Bir Ultrafiltrasyon Cihazı Kullanarak Protein Konsantrasyonunu Süzün.

Bu video, Mycobacterium tuberculosis'in (Mtb) kültür süzüntüsünden bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) saflaştırmak için boyut dışlama kromatografisi (SEC) tekniğini göstermektedir. Teknik, EV'lerin saflaştırılmış fraksiyonlarını elde etmek için gözenekli reçine dolgulu bir kolon kullanır. Gözenekli parçacıklar seçici olarak daha küçük proteinlerin gözeneklere girmesine izin vererek daha yavaş elüsyona neden olur. Aynı zamanda, EV'lerin daha büyük boyutları nedeniyle gözeneklere girmesi...

Mikobakteriyel hücre dışı vezikülleri saflaştırmak için bir boyut dışlama kromatografisi tekniği

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bakteriyel veziküller patogenezde önemli roller oynar ve umut verici biyoteknolojik uygulamalara sahiptir. Veziküllerin heterojenliği analiz ve kullanımı zorlaştırır; bu nedenle, değişen boyutlarda vesikleleri ayırmak için basit, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Burada, Aggregatibacter actinomycetemcomitanstarafından üretilen heterojen vezikülleri ayırmak için boyut dışlama kromatografisinin kullanımını gösteriyoruz.

Bakteriyel Dış Zar Vezikül Heterojenliğini Analiz Etmek için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Bu protokol, çözünmeyen hücre duvarı ve zar proteinlerini, izoelektrik noktaya dayalı hazırlayıcı izoelektrik odaklama (IEF) kullanarak basit fraksiyonlara (1-5 protein) ayırır ve ardından moleküler ağırlığa göre ayırır. Elde edilen fraksiyonlar, daha fazla saflaştırma olmaksızın doğrudan immünolojik ve proteomik analiz için kullanılabilir.

Hücre Duvarı ve Hücre Zarı Proteinlerinin Aşağı Akış Protein Analizi için Mycobacterium tuberculosis'ten Ayrılması ve Fraksiyonlanması

Keşfedin, boyut dışlama kromatografisi ile Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini nasıl zenginleştirebilirsiniz. Bu yöntem, yüksek verimli ve minimal protein kirliliğiyle tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Daha fazla video keşfet