Name: Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, ışık sayfası floresan mikroskobisi ve otomatik yazılım destekli yöntemlerle Trypanosoma cruzi parazitlerinin ve T hücrelerinin berraklaştırılmış organlarda 3D görüntülenmesini. Chagas hastalığı tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Etsuo Susaki'ye doku temizleme ve immün boyama protokolleri ile ilgili değerli yardımları ve önerileri için teşekkür ederiz. Ayrıca, LSFM ve konfokal görüntüleme kullanarak teknik destek için CTEGD Biyomedikal Mikroskopi Çekirdeğinden M. Kandasamy'ye minnettarız. Ayrıca Tarleton Araştırma Grubu'nun tüm üyelerine bu çalışma boyunca yararlı öneriler için teşekkür ederiz.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Parazitlerin ve immün yanıtın yaygın, tüm organ görüntülemesinin olmaması, konakçı-parazit etkileşimlerinin karmaşıklığının anlaşılmasını sınırlar ve Chagas hastalığı için tedavilerin değerlendirilmesini engeller. Bu çalışma, T. cruzi ile enfekte olmuş farelerin bozulmamış organlarını ve dokularını açıklığa kavuşturmak ve boyamak için CUBIC boru hattını benimsemiştir.
Bu çalışmada çoklu doku temizleme protokolleri test edilmiştir (PACT32, ECi 33, FLASH<sup clas...

Protozoan parazit T. cruzi'nin neden olduğu Chagas hastalığı, dünyanın en çok ihmal edilen tropikal hastalıkları arasındadır ve yılda yaklaşık 13.000 ölüme neden olmaktadır. Enfeksiyon sıklıkla akuttan kronik bir aşamaya ilerleyerek hastaların %30'unda kardiyak patoloji oluşturur ve buna aritmiler, kalp yetmezliği ve ani ölüm 1,2. Akut fazda parazite karşı ortaya çıkan güçlü konakçı bağışıklık tepkisine rağmen, konakçının yaşamı boyunca kalp ve iskelet kası gibi dokularda kronik olarak düşük sayıda parazit devam eder. Adaptif immün yanıtların gecikmiş başlangıcı ve parazitin replikasyon yapmayan formlarının varlığı da dahil olmak üzere çeşitli faktörler, T. cruzi'nin bağışıklık sistemi tarafından tamamen ortadan kaldırılmasını önleme kapasitesine katkıda bulunabilir 3,4,5,6. Ayrıca, parazitin replikasyon yapmayan uykudaki formları, tripanosidal ilaçlara karşı düşük bir duyarlılık gösterir ve kısmen birçok durumda gözlenen tedavi başarısızlığından sorumlu olabilir 7,8.
Yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi, enfekte dokulardaki parazitlerin mekansal dağılımı ve kontrollerinde yer alan bağışıklık hücreleri ile ilişkileri hakkında fikir edinme fırsatı sunmaktadır. Bu özellikler, bağışıklık sistemi tarafından parazit kontrol süreçlerinin daha iyi anlaşılması ve kronik dokularda bulunan nadir uyuyan parazitlerin izlenmesi için çok önemlidir.
Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), büyük doku veya organların ince kesitleme olmadan 3D görüntülenmesi için en kapsamlı ve tarafsız yöntemlerden biridir. Işık tabakası mikroskopları, yalnızca odak düzlemindeki floroforları uyarmak, örneklerin fotobeyazlatmasını ve fototoksisitesini azaltmak ve ultra hızlı kameralar kullanarak binlerce doku katmanının görüntülerini kaydetmek için ince bir ışık tabakası kullanır. Lazer ışığının dokulara uygun şekilde nüfuz etmesi için gerekli olan yüksek doku saydamlık seviyesi, doku delipidasyonu ve renk dejenerasyonunu takiben kırılma indisinin (RI) homojenize edilmesiyle elde edilir, bu da ışığın saçılmasını azaltır ve yüksek kaliteli görüntüler oluşturur 9,10,11.
 Bütün farelerin12,13,14, organoidlerin15,16,17, muhabir floresan belirteçleri eksprese eden organların18,19,20,21,22,23 ve son zamanlarda sınırlı sayıda insan dokusunun görüntülenmesi için doku temizleme yaklaşımları geliştirilmiştir 24 . Doku temizleme için mevcut yöntemler üç aileye ayrılmıştır: (1) DISCO protokolleri 25,26 gibi organik çözücü bazlı yöntemler, (2) CLARITY27 gibi hidrojel bazlı yöntemler ve CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) gibi sulu yöntemler18,19,28,29 . CUBIC protokolleri, endojen olarak eksprese edilen muhabir proteinlerinin floresansını koruyarak organ şeklini ve doku bütünlüğünü korur. Bu tekniğin en son güncellemesi olan CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), floresan etiketli antikorlar ve DNA etiketleme28 kullanılarak epitopların tespit edilmesine de izin verir.
Bu protokolde, berraklaştırılmış bozulmamış fare dokularında floresan proteinleri eksprese eden T. cruzi'yi tespit etmek için CUBIC boru hattı kullanılmıştır. Optik olarak şeffaf dokular LSFM ile görüntülendi, 3D rekonstrükte edildi ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin, uykudaki amastigotların ve organ başına T hücrelerinin kesin toplam sayısı otomatik olarak ölçüldü. Ayrıca, bu protokol, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle tek tip etiketlenmesini sağlamak için başarıyla kabul edildi. Bu yaklaşımlar, enfekte konakçılarda T. cruzi'nin genişlemesini ve kontrolünü anlamak için gereklidir ve Chagas hastalığı için kemo- ve immüno-terapötiklerin tam olarak değerlendirilmesinde yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>1-metilimidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolon (Antipirin</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu hücre kültürü plakaları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-fare Fab parçası</td><td>Jackson İmmüno-Araştırma Laboratuvarları</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-tavşan Fab parçası</td><td>Jackson İmmüno-Araştırma Laboratuvarları</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alfa;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C + A2: A44G-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Suşu #007914</td><td>Ortak Ad: Ai14, Ai14D veya Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Suşu #007914</td><td>Ortak Adı: Ai14, Ai14D veya Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 İyodür</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Suşu #032080</td><td>Ortak Adı: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Temizleme mendilleri Kimwipes</td><td>&nbsp; Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D immün boyama kiti</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D nükleer boyama kiti</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat bazlı jel süper yapıştırıcı</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioktadesil-3,3,3',3'-tetrametilindotrikarbosiyanin iyodür) Şirket: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Santrifüj tüpleri 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Falcon Santrifüj tüpleri 50 ve nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Sigma</td><td>#H3884 veya #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Dosya Dönüştürücü x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaris yazılımı</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector yazılımı</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>İntravenöz enjeksiyon iğnesi 23-G</td><td>Sartori, Minisart Şırınga filtresi</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>tüy bırakmayan mendiller</td></tr><tr><td>Hafif tabaka floresan mikroskobu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II görüntüleme sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet uçları, 10 & L, 200 ve mikro; L ve 1.000 &mikro; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y ve T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu pipet dağıtıcı</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Çözümü</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butildietanolamin</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-Metilnikotinamid</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Uzak Kırmızı Nükleer Leke</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Kurban Perfüzyon Sistemi</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>Costar Steril</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum karbonat (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Yeşil Nükleik Asit Lekesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

sağlam berraklaştırılmış organlarda tripanosoma cruzi ile enfekte hücrelerin, uykuda olan amastigotların ve t hücrelerinin kantitatif 3d görüntülenmesi

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas hastalığı, başta Latin Amerika olmak üzere dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen ihmal edilmiş bir patolojidir. Chagas hastalığı ajanı Trypanosoma cruzi (T. cruzi), insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli türünü enfekte eden, kalp ve sindirim patolojilerine neden olan çeşitli biyolojiye sahip zorunlu bir hücre içi parazittir. Chagas hastalığının karmaşık biyolojisini anlamak ve tedavi rejimlerinin sonucunu doğru bir şekilde değerlendirmek için T. cruzi in vivo enfeksiyonlarının güvenilir bir şekilde tespit edilmesi uzun zamandır gereklidir. Mevcut protokol, 3D yeniden yapılandırılmış, temizlenmiş organlarda T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin otomatik olarak ölçülmesi için entegre bir boru hattı göstermektedir. Işık tabakası floresan mikroskopisi, tüm organ veya dokularda aktif olarak çoğalan ve uykuda olan T. cruzi parazitlerinin ve bağışıklık efektör hücrelerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Ayrıca, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle düzgün bir şekilde etiketlenmesini sağlamak için CUBIC-HistoVision boru hattı başarıyla kabul edildi. 3D immün boyama ile birlikte doku temizleme, ilaç tedavi protokollerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek, T. cruzi ile enfekte olmuş dokuların hücresel organizasyonunun anlaşılmasını geliştirmek için tarafsız bir yaklaşım sağlar ve Chagas hastalığında anti-T. cruzi immün yanıtları, doku hasarı ve onarımı ile ilgili keşifleri ilerletmesi beklenmektedir.

KÜBİK sabit dokular, fiksatifleri çıkarmak için PBS ile yıkandı ve daha sonra doku mimarisini korurken dokunun renginin bozulmasına neden olan pigmentleri ve lipitleri dokudan çıkaran temel tamponlu bir amino alkol çözeltisi olan CUBIC-L kokteylleri ile inkübe edildi. Kağıttaki ızgara çizgileri, organların uygun şekilde temizlendiğini gösteren dokulardan görülebilir (Şekil 2A). Delipidasyondan sonra, dokular yıkandı ve sırasıyla RI homojenizasyonu ve görüntüleme için CUBIC-R...

Mevcut protokol, bozulmamış, temizlenmiş organ ve dokulardaki çoğalan ve uykuda olan Trypanosoma cruzi parazitlerini ve T hücrelerini görselleştirmek ve hassas bir şekilde ölçmek için ışık tabakası floresan mikroskopisi ve otomatik yazılım destekli yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknikler, tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güvenilir bir yol sağlar ve parazit-konakçı etkileşimlerine yeni bakış açıları sunar.

Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Bu teknik, tüm şeffaf organların daha eksiksiz ve 3D bir görüntüsünü sağladı ve sadece çoğaltmanın değil, aynı zamanda uykudaki parazit ve bağışıklık faktörü hücrelerinin de nicelleştirilmesi için yararlı oldu. Bu teknik, parazitlerin, bağışıklık hücrelerinin ve enfeksiyondan kaynaklanan doku hasarının özel ilişkisini belirlememizi sağlar. Epitop immün boyama ve DNA etiketleme de bu teknikle karşılaştırılabilirdi.Bu protokol, Chagas hastalığının fare modellerinde tedavi sonuçlarını değerlendirmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Uzun bir tedavi süresi boyunca daha az sıklıkta verilen daha yüksek bireysel dozların tedavisi, hem çoğalan hem de uykuda olan parazitleri ortadan kaldırır. Prosedürü gösteren, Rick Tarleton'un laboratuvarından bir araştırma teknisyeni olan Caleb Hawkins olacak.Enfekte bir farenin organlarını el yazmasında açıklandığı gibi ötenazi, diseke ve sabitledikten sonra, bireysel organları 10 mililitre% 50 su ile seyreltilmiş CUBIC-L'ye batırın, gece boyunca ışıktan korunan 50 mililitrelik konik tüplerde oda sıcaklığında hafifçe sallayın. Ertesi gün,% 50 CUBIC-L'yi 10 mililitre% 100 CUBIC-L ile değiştirin ve tüpü çalkalayıcı inkübatöründe düz tutarken altı gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu kuluçka süresinin sonunda, dokular neredeyse tamamen şeffaf olmalıdır.Şeffaf organları PBS ile iki kez 37 santigrat derecede iki saat boyunca hafifçe sallayarak yıkayın. Her yıkamada, Triton X-100'ü çıkarmak için dokuları yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. DNA boyama için, ticari olarak temin edilebilen nükleik asit boyasını beş mililitre boyama tamponunda 1:2.500'de seyreltin.Daha sonra, dokuyu nükleer boya çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe batırın ve ayakta durma pozisyonunda beş gün boyunca yumuşak bir rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Dokuyu 15 mililitre 3D nükleer boyama yıkama tamponu ile oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe çalkalayarak üç kez yıkayın. Gerekli miktarda birincil ve ikincil antikor hesaplayın.Birincil ve ikincil antikorları amber iki mililitrelik bir tüpte karıştırın ve 1.5 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tampon değişimi için, 7,5 mililitre 2x HV1 3D immün boyama tamponunu 7,5 mililitre çift damıtılmış su ile karıştırın. Doku örneğini tampona batırın ve yatay konumda 15 mililitrelik bir konik tüpte hafifçe sallanarak 32 santigrat derecede 1,5 saat boyunca inkübe edin.Doku örneğini tampon değişim ortamından toplayın ve antikor boyama çözeltisine batırın. Dokuları bir hafta boyunca 32 santigrat derecede ayrı ayrı inkübe edin, tüpleri ışıktan uzakta ayakta duran bir konumda hafifçe sallayın. Doku örneklerini dört santigrat dereceye taşıyın ve ayakta dururken inkübe edin.HV1 3D immün boyama yıkama tamponunu dört santigrat dereceye kadar soğuttuktan sonra, numuneyi her biri yatay konumda hafifçe sallanan 30 dakika boyunca dört santigrat derecede iki kez 15 mililitre tamponla yıkayın. Formalini HV1 3D immün boyama yıkama tamponunda% 1'e kadar seyreltin ve numuneyi dört santigrat derecede 24 saat boyunca çözeltinin sekiz mililitresine hafifçe sallayarak batırın. Şimdi, numuneyi 37 santigrat derecede bir saat boyunca taze% 1formalin çözeltisinde inkübe edin ve 25 santigrat derecede iki saat boyunca 15 mililitre PBS'de yıkayın.Şeffaf organları, oda sıcaklığında beş mililitre %50 su ile seyreltilmiş CUBIC-R+solüsyonu içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe hafifçe çalkalayarak daldırın. Beş mililitre% 100 CUBIC-R + ile değiştirin ve iki gün boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Kimwipes'i kullanarak dokuları kurutun ve ardından altı delikli bir kültür plakasında beş mililitre montaj çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında inkübe edin.Dokuları jel süper yapıştırıcı kullanarak mikroskop numune tutucusuna yapıştırın. Numuneleri 120 mililitre montaj çözeltisi ile doldurulmuş mikroskop kuvars küvete batırın. Onları uzunlamasına eksenlerine enine olarak görüntüleyin ve tepesi ve aortu yatay olarak hizalanmış olarak kalbe yapıştırın.3D yeniden yapılandırılmış Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş kalp, ventriküllere kıyasla atriyumda enfekte olmuş hücrelerin daha yüksek bir oranını gösterdi. Uyuyan parazitler, 3D genişlemiş insets'te gösterildiği gibi kalpte tanımlanabilir. ZsGreen1 eksprese eden T hücrelerinin yanı sıra Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş hücreler, Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş bir CD8 muhabir faresinden iskelet kasında görselleştirildi.3D yeniden yapılandırılmış görüntünün 3D yakınlaştırmaları, enfekte olmuş bir hücrenin bölgesindeki T hücrelerini tanımladı. Konakçı ile enfekte hücrelerdeki T hücrelerinin arayüzü konfokal mikroskopi ile görselleştirildi. İmmün yetmezlikli bir farenin kalbinde, iki farklı Trypanosoma cruzi suşu ile enfekte olmuş konakçı hücreler tespit edildi ve dokulardan dilimleme, kalp atriyumunda çeşitli doku derinliklerinde bol miktarda parazitle enfekte olmuş hücre gösterdi.Trypanosoma cruzi ile enfekte olmuş ve temizlenmiş kalpte vaskülatürün immün tespiti, kalbin karmaşık vaskülatürünü ortaya çıkarır. Parazitle enfekte olmuş hücreler kalp atriyumunda gözlenebilir. İskelet kasının nükleer boyanması, az sayıda veya tespit edilemeyen tdDomates paraziti olan bölgelerde çekirdek birikimi gösterdi.TdDomates ve GFP parazit muhabiri belirteçlerinin RFP ve GFP'ye karşı antikorlarla ve tüm temizlenmiş iskelet kasının güçlendirilmesi güçlü floresan ile sonuçlandı. Bu nedenle kritik noktalar KÜBİK tampondaki inkübasyon süresi, DNA boyasındaki seyreltme ve inkübasyon süresi, antikorlardaki inkübasyon süresi ve kırılan indeks eşleştirme çözeltisindeki inkübasyon süresidir. Spesifik antikorlar boyası ve hızlı reaksiyon ile ek boyama kullanımı, bu tekniğin potansiyelini önemli ölçüde artırabilir ve sağlam organlarda çoklu hücrelerin, süreçlerin ve yapının tespit edilmesine izin verebilir.Artık parazitleri öldürmekten sorumlu bağışıklık hücrelerini, parazitlerin kronik olarak devam ettiği dokuları ve spesifik ilaçların dokulara dağılımını keşfetmek için daha iyi ve daha eksiksiz bir yolumuz var.

quantitative-3d-imaging-trypanosoma-cruzi-infected-cells-dormant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

GFP transgenik sıtma parazitleri ve bu organ içinde parazit hareketlilik ve kan akımının ölçülmesi ile dalak intravital mikroskobi gerçekleştirmek için yöntem gösteriyor.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte İn Vivo Ile Toxoplasma gondii

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Trypanosoma cruzi Ajan Chagas hastalığının klinik olarak tanınan patoloji aniden geliştirmek uzun ömürlü asemptomatik enfeksiyondan üretir. Aşağıdaki araştırma Protokolü cinsel üst nesneden döl için aktarılan T. cruzi enfeksiyon çözülmeye bir kısa vadede ailesi tabanlı epidemiyolojik çalışma açıklar.

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

Bu protokol, örnek toplama, metabolit ekstraksiyonu, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi veri toplama, 3D model oluşturma ve son olarak veri görselleştirme dahil olmak üzere trypanosomatid enfeksiyonu sırasında metabolit dağılımının 3D modelini oluşturma adımlarını açıklar.

Tripozomatid Enfeksiyonunu İncelemek için Kimyasal Kartografi Yaklaşımları

Bu çalışma, Chagas hastalığından sorumlu patojen olan Trypanosoma cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasında ultrayapı genişletme mikroskobunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Hücre iskeleti proteinleri ve pan-proteom etiketleme için optimize edilmiş tekniği dahil ediyoruz.

Ultrastrüktürel Genleşme Mikroskobu in Üç İn Vitro Yaşam Döngüsü Aşamaları Trypanosoma cruzi

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Burada sağlanan protokol, veri toplama, analiz ve yorumlamaya odaklanarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans modelinde ilaç etkinliği çalışmaları gerçekleştirmek için ayrıntılı adımları açıklamaktadır. Teknik sorunları en aza indirmek için sorun giderme ve kalite kontrol prosedürleri de sağlanmaktadır.

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

Öğrenin, ışık sayfası floresan mikroskobisi ve otomatik yazılım destekli yöntemlerle Trypanosoma cruzi parazitlerinin ve T hücrelerinin berraklaştırılmış organlarda 3D görüntülenmesini. Chagas hastalığı tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güçlü bir araçtır.

Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet