Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

RNA FISH boyama, mikrobiyom bakterileri ve hücre içi patojenler de dahil olmak üzere C.elegans'ı doğal olarak kolonize eden veya enfekte eden mikropların görselleştirilmesi, tanımlanması ve nicelleştirilmesi için yararlıdır. Bu teknik basit, hızlı ve sağlamdır, bu da mikropları bütün bir bozulmamış hayvan bağlamında etkili bir şekilde lekelemesine ve görselleştirmesine izin verir. RNA FISH'i vahşi C.elegans'taki bağırsak mikrobiyom bakterilerini tespit etmek ve görselleştirmek için kullanabiliriz.

Bu, memeli sistemlerindeki karşılaştırılabilir etkileşimleri anlamamıza yardımcı olabilir. Nematodları istenen ilgili mikropla aktardıktan sonra, NGM plakalarından mikrosantrifüj tüplerine nakledildikten sonra, mikrofüj tüplerine bir mililitre 1X PBST ekleyerek nematodları yıkayın. Numuneleri uygun hızda bir mikrosantrifüj veya Nanofuge içinde döndürün.

Bir pipet kullanarak, süpernatanın 100 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın. PBST ile yıkamayı iki ila üç kez tekrarlayın. Nematodları paraformaldehit ile sabitlemek için,% 4'lük bir paraformaldehit konsantrasyonu için nematod peletinin üzerinde 100 mikrolitre süpernatant içeren mikrofüj tüpüne 33 mikrolitre% 16 paraformaldehit ekleyerek başlayın.

Kolonize edilen veya ilgili mikropla enfekte olan nematodları içeren numuneleri oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca inkübe edin. Paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve numunelere 0,5 mililitre PBST ekleyin. Numuneleri, metin yazısında belirtildiği gibi uygun hızda bir mikrosantrifüjde döndürün.

Bir pipetle, peleti rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Mikrofüj tüplerindeki numunelere 0,5 mililitre PBST ekleyin. PBST ile yıkamayı iki ila üç kez tekrarlayın.

Son yıkamayı takiben, numuneleri aşağı doğru döndürün ve pelet bozulmadan bırakarak süpernatanı çıkarın. Ardından, numune başına bir mililitre hibridizasyon tamponu hazırlayın. Nematod peletini içeren mikrofüj tüplerine 800 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin.

Mikrosantrifüjdeki numuneleri topaklayın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. İstenilen FISH probu ile hibridizasyon tamponu numunesi başına 100 mikrolitreyi, mikrolitre probu ve karıştırmak için vorteks başına 5 ila 10 nanogramlık bir son konsantrasyona hazırlayın.

Her numuneye FISH probu içeren 100 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin. Tüpleri hafifçe hafifçe hafifçe hareket ettirerek veya ters çevirerek karıştırın. Numuneleri gece boyunca kuru bir banyoda 46 ila 54 santigrat derecede veya 46 ila 54 santigrat derecede bir termal karıştırıcıda dakikada 1.200 dönüşte inkübe edin.

Numune başına üç mililitre yıkama tamponu hazırlayın. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın. Nematod peletini rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat ederken bir pipet kullanarak hibridizasyon tamponunu çıkarın.

Her numuneye bir mililitre hazırlanmış yıkama tamponu ekleyin. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın. Pelet bozulmadan bırakmaya dikkat ederken bir pipet kullanarak yıkama tamponunu çıkarın.

Her numuneye bir mililitre hazırlanmış yıkama tamponu ekleyin. Numuneleri kuru bir banyoda 48 ila 56 santigrat derecede bir saat veya dakikada 1.200 dönüşte 48 ila 56 santigrat derecede termal karıştırıcıda inkübe edin. Kuru bir banyoda inkübe ediliyorsa, tüpleri her 15 ila 20 dakikada bir yavaşça ters çevirin.

Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, peleti rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat ederken yıkama tamponunu çıkarın. Numunelerin her birine 100 ila 500 mikrolitre PBST ekleyin.

Bu noktada, numuneler protokol devam etmeye hazır olana kadar PBST'de dört santigrat dereceye kadar bir haftaya kadar saklanabilir. Numuneleri uygun hızda topaklayın. Nematod peletini rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla PBST'yi çıkarın.

Numunelere DAPI ile 20 mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ekleyin. 200 mikrolitrelik pipetleyiciyi 200 mikrolitrelik pipet ucuyla doldurun ve daha büyük nematodların pipetlenmesine izin vermek için pipetin ucunu kesmek üzere makas kullanın. Kesilmiş pipet ucu ile, peletin 5 ila 10 mikrolitresini mikroskop slaytına aktarın.

22 x 22 kapak fişi ile örtün. Slaytları saklamak için, kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve daha fazla kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede karanlık bir kutuda saklayın. Diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında, vahşi bir Caenorhabditis tropicalis suşunun bağırsak epiteline yönlü olarak yapıştığı görülen bir bakteri ile kolonize edildiği bulunmuştur.

Yeşil evrensel 16S rRNA probundan ve kırmızı Alphaproteobacteria türü probundan gelen floresan sinyal tamamen örtüşür, bu da bağırsakları kolonize eden bakterilerin çoğunun yapışan Alphaproteobacteria bakterisi olduğunu düşündürmektedir. Orsay virüsünün iki parçalı RNA genomu RNA1 ve RNA2 segmentlerinden oluşur ve her iki segmenti de hedefleyen FISH probları geliştirilmiştir. Yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş ZIP1 proteini, sitoplazmada pozitif Orsay virüsü FISH boyaması gösteren hücrelerin bağırsak çekirdeklerinde lokalize olarak görülür.

Orsay'a özgü veya N.parisii'ye özgü FISH ile boyanmış çoklu hayvanların, kolay niceleme için bu sinyalin gücünü gösterdiği gösterilmiştir. C.elegans'ın 18S'ye bağlanmak için rekabet eden türe özgü problar kullanılarak iki mikrosporidia paraziti ile birlikte enfeksiyonu, çekirdekleri boyamak için DAPI kullanımı, enfeksiyonun tüm hayvan bağlamında, özellikle de büyük, kolayca tanımlanabilir çekirdeklere sahip bağırsak için daha iyi lokalizasyonuna izin verir. N.parisii ile enfeksiyonlar, merontların sporlara dönüşmesine neden olur.

Ortaya çıkan FISH boyaması, muhtemelen kırmızı renkte N.parisii'ye özgü problarla boyanmış N.parisii sporlarına karşılık gelen küçük ve büyük çubuk şeklindeki yapıları göstermektedir. Fiksatif ajanı seçerken, PFA fiksasyonunun morfolojinin ve transgenik GFP'nin daha iyi korunmasına izin verdiğini, ancak sporoplazmaların görselleştirilmesi için aseton fiksasyonunun gerekli olduğunu unutmayın. RNA FISH, C.elegans bağırsaklarını kolonize eden bakterileri tanımlamak ve görselleştirmek için kullanılabilir.

Araştırmacılar daha sonra bu konakçı-mikrop etkileşimlerinde yer alan faktörleri tanımlamak için daha fazla genetik tarama gerçekleştirebilirler.