Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)
27 Temmuz 2022
Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.
RNA FISH boyama, mikrobiyom bakterileri ve hücre içi patojenler de dahil olmak üzere C.elegans'ı doğal olarak kolonize eden veya enfekte eden mikropların görselleştirilmesi, tanımlanması ve nicelleştirilmesi için yararlıdır. Bu teknik basit, hızlı ve sağlamdır, bu da mikropları bütün bir bozulmamış hayvan bağlamında etkili bir şekilde lekelemesine ve görselleştirmesine izin verir. RNA FISH'i vahşi C.elegans'taki bağırsak mikrobiyom bakterilerini tespit etmek ve görselleştirmek için kullanabiliriz.
Bu, memeli sistemlerindeki karşılaştırılabilir etkileşimleri anlamamıza yardımcı olabilir. Nematodları istenen ilgili mikropla aktardıktan sonra, NGM plakalarından mikrosantrifüj tüplerine nakledildikten sonra, mikrofüj tüplerine bir mililitre 1X PBST ekleyerek nematodları yıkayın. Numuneleri uygun hızda bir mikrosantrifüj veya Nanofuge içinde döndürün.
Bir pipet kullanarak, süpernatanın 100 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın. PBST ile yıkamayı iki ila üç kez tekrarlayın. Nematodları paraformaldehit ile sabitlemek için,% 4'lük bir paraformaldehit konsantrasyonu için nematod peletinin üzerinde 100 mikrolitre süpernatant içeren mikrofüj tüpüne 33 mikrolitre% 16 paraformaldehit ekleyerek başlayın.
Kolonize edilen veya ilgili mikropla enfekte olan nematodları içeren numuneleri oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca inkübe edin. Paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve numunelere 0,5 mililitre PBST ekleyin. Numuneleri, metin yazısında belirtildiği gibi uygun hızda bir mikrosantrifüjde döndürün.
Bir pipetle, peleti rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Mikrofüj tüplerindeki numunelere 0,5 mililitre PBST ekleyin. PBST ile yıkamayı iki ila üç kez tekrarlayın.
Son yıkamayı takiben, numuneleri aşağı doğru döndürün ve pelet bozulmadan bırakarak süpernatanı çıkarın. Ardından, numune başına bir mililitre hibridizasyon tamponu hazırlayın. Nematod peletini içeren mikrofüj tüplerine 800 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin.
Mikrosantrifüjdeki numuneleri topaklayın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. İstenilen FISH probu ile hibridizasyon tamponu numunesi başına 100 mikrolitreyi, mikrolitre probu ve karıştırmak için vorteks başına 5 ila 10 nanogramlık bir son konsantrasyona hazırlayın.
Her numuneye FISH probu içeren 100 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin. Tüpleri hafifçe hafifçe hafifçe hareket ettirerek veya ters çevirerek karıştırın. Numuneleri gece boyunca kuru bir banyoda 46 ila 54 santigrat derecede veya 46 ila 54 santigrat derecede bir termal karıştırıcıda dakikada 1.200 dönüşte inkübe edin.
Numune başına üç mililitre yıkama tamponu hazırlayın. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın. Nematod peletini rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat ederken bir pipet kullanarak hibridizasyon tamponunu çıkarın.
Her numuneye bir mililitre hazırlanmış yıkama tamponu ekleyin. Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın. Pelet bozulmadan bırakmaya dikkat ederken bir pipet kullanarak yıkama tamponunu çıkarın.
Her numuneye bir mililitre hazırlanmış yıkama tamponu ekleyin. Numuneleri kuru bir banyoda 48 ila 56 santigrat derecede bir saat veya dakikada 1.200 dönüşte 48 ila 56 santigrat derecede termal karıştırıcıda inkübe edin. Kuru bir banyoda inkübe ediliyorsa, tüpleri her 15 ila 20 dakikada bir yavaşça ters çevirin.
Numuneleri uygun hızda santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak, peleti rahatsız edilmeden bırakmaya dikkat ederken yıkama tamponunu çıkarın. Numunelerin her birine 100 ila 500 mikrolitre PBST ekleyin.
Bu noktada, numuneler protokol devam etmeye hazır olana kadar PBST'de dört santigrat dereceye kadar bir haftaya kadar saklanabilir. Numuneleri uygun hızda topaklayın. Nematod peletini rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla PBST'yi çıkarın.
Numunelere DAPI ile 20 mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ekleyin. 200 mikrolitrelik pipetleyiciyi 200 mikrolitrelik pipet ucuyla doldurun ve daha büyük nematodların pipetlenmesine izin vermek için pipetin ucunu kesmek üzere makas kullanın. Kesilmiş pipet ucu ile, peletin 5 ila 10 mikrolitresini mikroskop slaytına aktarın.
22 x 22 kapak fişi ile örtün. Slaytları saklamak için, kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve daha fazla kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede karanlık bir kutuda saklayın. Diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında, vahşi bir Caenorhabditis tropicalis suşunun bağırsak epiteline yönlü olarak yapıştığı görülen bir bakteri ile kolonize edildiği bulunmuştur.
Yeşil evrensel 16S rRNA probundan ve kırmızı Alphaproteobacteria türü probundan gelen floresan sinyal tamamen örtüşür, bu da bağırsakları kolonize eden bakterilerin çoğunun yapışan Alphaproteobacteria bakterisi olduğunu düşündürmektedir. Orsay virüsünün iki parçalı RNA genomu RNA1 ve RNA2 segmentlerinden oluşur ve her iki segmenti de hedefleyen FISH probları geliştirilmiştir. Yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş ZIP1 proteini, sitoplazmada pozitif Orsay virüsü FISH boyaması gösteren hücrelerin bağırsak çekirdeklerinde lokalize olarak görülür.
Orsay'a özgü veya N.parisii'ye özgü FISH ile boyanmış çoklu hayvanların, kolay niceleme için bu sinyalin gücünü gösterdiği gösterilmiştir. C.elegans'ın 18S'ye bağlanmak için rekabet eden türe özgü problar kullanılarak iki mikrosporidia paraziti ile birlikte enfeksiyonu, çekirdekleri boyamak için DAPI kullanımı, enfeksiyonun tüm hayvan bağlamında, özellikle de büyük, kolayca tanımlanabilir çekirdeklere sahip bağırsak için daha iyi lokalizasyonuna izin verir. N.parisii ile enfeksiyonlar, merontların sporlara dönüşmesine neden olur.
Ortaya çıkan FISH boyaması, muhtemelen kırmızı renkte N.parisii'ye özgü problarla boyanmış N.parisii sporlarına karşılık gelen küçük ve büyük çubuk şeklindeki yapıları göstermektedir. Fiksatif ajanı seçerken, PFA fiksasyonunun morfolojinin ve transgenik GFP'nin daha iyi korunmasına izin verdiğini, ancak sporoplazmaların görselleştirilmesi için aseton fiksasyonunun gerekli olduğunu unutmayın. RNA FISH, C.elegans bağırsaklarını kolonize eden bakterileri tanımlamak ve görselleştirmek için kullanılabilir.
Araştırmacılar daha sonra bu konakçı-mikrop etkileşimlerinde yer alan faktörleri tanımlamak için daha fazla genetik tarama gerçekleştirebilirler.
Genel Bakış
Bu makale, bakteriler ve Orsay virüsü gibi hücre içi patojenler dahil olmak üzere C. elegans'ı kolonize eden ve enfekte eden mikropların tespit edilmesi ve miktarının belirlenmesi için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, bütün nematodlarda görselleştirme ve nicelleştirme için RNA FISH boyamasını kullanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Nörobilim
- Patojen Etkileşimi
Arka Plan
- Bağırsak mikropları, C. elegans sağlığında kritik bir rol oynar.
- Konak-mikrop etkileşimlerinin anlaşılması, memelilerdeki benzer süreçlere dair öngörüler sağlayabilir.
- RNA FISH, mikrobiyal kolonizasyonu incelemek için güçlü bir tekniktir.
- Orsay virüsü ve mikrosporidya gibi patojenler, nematod biyolojisini önemli ölçüde etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans modelindeki mikrobiyal enfeksiyonların saptanması ve miktarının belirlenmesi için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Nematod bağırsaklarındaki mikrobiyal etkileşimlerin anlaşılmasını geliştirmek.
- Konak-mikrop dinamikleri üzerine yapılacak ileri genetik çalışmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Mikropların görselleştirilmesi için RNA FISH boyaması.
- Nematodların paraformaldehit ile yıkanması ve fikslenmesi.
- Hedefli tespit için spesifik FISH probları ile hibridizasyon.
- Mikrobiyal kolonizasyonu ve enfeksiyonu değerlendirmek için mikroskobik analiz.
Temel Sonuçlar
- Yabani C. elegans örneklendirmelerinde bağırsak mikrobiyom bakterilerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- FISH probları kullanılarak spesifik patojenlerin tanımlanması.
- Enfekte nematodlardaki patojen yükünün miktarının belirlenmesi.
- Enfeksiyonların morfolojisi ve lokalizasyonuna ilişkin bilgiler.
Sonuçlar
- RNA FISH, C. elegans'deki mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinde etkilidir.
- Protokol, bağırsak kolonizasyonunun ve patojen dinamiklerinin ayrıntılı analizine olanak tanır.
- Bulgular, diğer organizmalardaki konakçı-mikrop etkileşimlerine ilişkin gelecekteki araştırmalara bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
RNA FISH, Caenorhabditis elegans bağırsakları içindeki mikrobiyal kolonizasyon ve enfeksiyonun doğrudan görselleştirilmesini ve nicelendirilmesini sağlayarak, memeli sistemleriyle ilgili konakçı-mikrop etkileşimlerinin sorgulanması için güçlü bir model sunar. Bu yaklaşım, genetik olarak manipüle edilebilir bir organizmada mikrobiyal dinamikleri açıklığa kavuşturarak erken aşama keşifleri destekler, translasyonel araştırmalara veri sağlar ve mikrobiyom hedefli terapötikler için mekanistik risk azaltma süreçlerini kolaylaştırır. Yöntemin, genetik araçlardan yoksun olanlar da dahil olmak üzere çeşitli mikropları tespit edebilme yeteneği, preklinik model seçimi ve hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Mikrobiyal kolonizasyon ve enfeksiyonun tüm hayvan bağlamında fonksiyonel doğrulamasını sağlar.
- Kommensal ve patojenik etkileşimleri birbirinden ayırarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- İnsan sağlığı ile ilgili konak-mikrop yollarının hipotez odaklı sorgulanmasını kolaylaştırır.
- Mikrobiyal dinamikleri etkileyen konak faktörlerini belirlemek için genetik taramalar için bir platform sunar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bütün organizmalarda mikrobiyal yük ve lokalizasyonun standartlaştırılmış, kantitatif çıktılarını sağlar.
- Türe özgü veya geniş kapsamlı problar kullanarak bakterilerin, mikrosporidyumların ve virüslerin tekrarlanabilir tespitine olanak tanır.
- Çeşitli mikrobiyal hedefler için analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
- Biyolojik sistemleri, sonraki aşamalardaki bileşik veya genetik tarama iş akışları için valide eder.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- İn vivo bağırsak enfeksiyonu ve kolonizasyonunu modelleyerek hastalıkla ilgili sistemlerle uyum sağlar.
- Konak-mikrop etkileşimlerinin keşfinden preklinik doğrulamasına kadar süreklilik sağlar.
- Enfeksiyon dinamiklerini ve konak yanıtını nicelleştirerek risk ayarlı ilerleme kararlarına olanak tanır.
- Enfeksiyon lokalizasyonu ve yükünün görselleştirilmesi yoluyla translasyonel biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu RNA FISH protokolü; hipotez testlerini, hedef doğrulamasını ve C. elegans'taki mikrobiyal kolonizasyonun kantitatif değerlendirmesini mümkün kılarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur. Erken keşif, assay geliştirme ve translasyonel araştırma iş akışlarında kullanılmak üzere konumlandırılmıştır.
- Keşif Biyolojisi: Konak-mikrop etkileşimlerini in vivo olarak görselleştirerek yolak aydınlatılmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Mikrobiyal tespit ve enfeksiyon yükü için nicel, tekrarlanabilir çıktılar sağlar.
- Analitik: Farklı deneysel koşullar altında mikrobiyal kolonizasyonun doğrudan ölçülmesine ve karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Korunmuş bağırsak biyolojisinden yararlanarak, model organizma bulgularını memeli sistemlerine taşır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Genetik modifikasyona ihtiyaç duymadan, çeşitli mikrobiyal tespitler için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Konak-mikrop çalışmalarında öngörü güvenilirliğini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Mikrobiyal görüntüleme için standartlaştırılmış, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir iş akışları sağlar.
- Stratejik Değer: Mikrobiyomla ilgili hedeflerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak karar verme süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Mikrobiyom hedefli programların risk ayarlı önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- RNA FISH prob tasarımı ve floresan mikroskobisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Fiksasyon reaktiflerine (PFA, aseton) ve görüntüleme altyapısına erişim gereklidir.
- Prob seçimi ve görüntüleme protokolleri için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Prob spesifitesi değiştirilerek çeşitli mikrobiyal hedeflere uyarlanabilir.
- Mikrop tipine ve istenen morfolojik korumaya göre dikkatli fiksasyon seçimi gerekliliği ile sınırlıdır.
