In Vitro Kalsiyum Birikimini Ölçmek için Yarı Otomatik ve Tekrarlanabilir Biyolojik Tabanlı Bir Yöntem

Yöntemimiz, insan vasküler düz kas hücrelerini kullanarak hasta örneklerinin kireçlenme eğilimini ölçmeye izin verir. Bu, vasküler kalsifikasyon bozukluklarına yönelik araştırmaları ilerletmeye yardımcı olacak ve yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Bu teknik, hassasiyeti artıran ve numunelerin zaman içinde ölçülmesine izin veren, böylece çoğaltma ihtiyacını azaltan ve sağlamlığı artıran floresan tabanlı bir algılama kullanır.

Başlamak için, kaplanmamış hücre kültürü üzerindeki insan vasküler düz kas hücrelerini% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede şişeler. % 70 ila% 90 akıcılığa ulaştıktan sonra hücreleri bölün. Bölmek için HVSMC'leri PBS ile iki kez yıkayın.

Tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede 2 ila 5 dakika kuluçkaya yatırın. Serum içeren bir ortam ekleyerek tripsin reaksiyonunu inhibe edin. Hücreleri 350 RCF'de 4 dakika boyunca santrifüj edin ve peleti bir bakım ortamında yeniden askıya alın.

Hücreleri gösterildiği gibi bir bölünmeye hazırladıktan sonra, kalsifikasyon deneyine başlamak için hücreleri sayın ve 48 delikli bir plakaya tohumlayın. % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede gece inkübasyonunu takiben, hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın, ikinci yıkamadan sonra kalan tüm PBS'yi dikkatlice aspire edin. Yavaşça kireçlenme ortamı ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede daha fazla inkübe edin.

Kalsifikasyon meydana gelene kadar her gün bir ışık mikroskobu ile kontrol edin. Görüntüleme yoluyla kalsifikasyonu tespit etmek için yazılımı açın ve Protokoller ve Yeni Oluştur'u seçin. Prosedür'ü seçin ve Sıcaklığı Ayarla'ya tıklayın.

Açılır pencerede sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve gradyanı 1 santigrat dereceye ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Açılır menüden tercih ettiğiniz plaka türünü seçin. Görüntü'yü tıklatarak görüntüleme adımını ekleyin. Ters Görüntüleyici'yi seçin ve Tamam'ı tıklatın. Üç görüntüleme kanalı ekleyin ve bunları DAPI, RFP ve Parlak Alan olarak ayarlayın.

Montaj kutusunu işaretleyin ve görüntülerin istediğiniz sayısını ve konumunu ayarlayın. Her bir kuyucuğun daha iyi bir kapsamını temsil etmek için Örtüşme'yi değiştirin. Hangi kuyucukların görüntüleneceğini seçin.

İlgilenilen kuyuların seçilebileceği yeni bir pencere açılacaktır. Netleme modunu ayarlamak için Netleme Seçenekleri'ni tıklatın. Yeni bir pencere açılacaktır.

Her kanalı ayrı ayrı ayarlayın. Genellikle, kuyular DAPI kanalına otomatik olarak odaklanır. Diğer tüm kanalları İlk kanaldan sabit odak yüksekliği olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatarak ayarlayın. Pencereyi kapatın.

Veri Azaltma'yı tıklayıp Görüntü Ön İşleme'yi seçerek önceden ayarlanmış veri azaltma adımlarını başlatın. Tamam'ı seçerek varsayılan ayarları kabul edin. Hücresel Analiz'i seçerek hücreleri saymak için bir adım ayarlayın. Kanal açılır menüsünden TsF DAPI Görüntüleri'ni seçin.

Görüntüleme yapıldıktan sonra daha fazla ayrıntı ayarlayın. Açılır pencere Etiket adımında İstatistikler'i seçerek RFP sinyalinin analizini hazırlayın ve giriş kanalı olarak TsF RFP'yi seçin. Üst Değer ve Düşük Değer kutularını işaretleyin.

Alt listedeki Toplam Alan kutusunu işaretleyin. Color Effect sütununda Hiçbiri'ni seçin. Açılır pencerede, Özel'i tıklayın ve Arka Plan kutusunu işaretleyin.

Tamam'a basın. Adil bir okuma için, sol taraftaki Oran düğmesine basarak hücre başına RFP sinyalini normalleştirin. Açılır pencerede, RFP Niceliği Toplam Alanı'nı seçin. Açılır menüden Veri Girişi 1 için Veri Girişi Olarak Hücre Sayısı 2'yi seçin.

Son olarak, Yeni Veri Kümesi Adı seçin ve Tamam'a iki kez basın. Daha önce gösterildiği gibi Renk Efekti'ni seçin ve sol üst köşedeki OK.In tıklayın, Dosya'yı seçin ve dosyayı Protokol dosya türü olarak kaydedin. Kalsifikasyonun ilk örneğinden sonra her zaman noktası için gözlemleri kaydedin.

Başlangıç yazılımında Şimdi Oku'ya basın ve Mevcut Protokol'e tıklayın. Önceki adımda oluşturulan protokolü seçin. Program denemeyi kaydetmenizi ister.

Bu, bu aşamada veya daha sonra sol üstteki Kaydet düğmesine tıklayarak manuel olarak yapılabilir. Bir açılır pencere, sistemin ısınmasını beklemenizi isteyecektir. Karbondioksit gazı kontrol cihazını açın ve% 5'e ayarlayınSistem ayarlanan sıcaklığa ulaştığında, bir plaka takmak ve okumak için bir istem görünecektir.

İptal'e basın. Kırılmayı ve dökülmeyi önlemek için plakayı inkübatörden görüntüleyiciye güvenli bir kutuda taşıyın ve bir kaza durumunda canlı hücrelerin taşınması için yerel biyogüvenlik yönetmeliklerine uygundur. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.

Prosedür'e tıklayın. Açılır pencerede, Önceden Ayarlanmış Görüntüleme Adımı'nı seçin. Odağı ve pozlamayı önce DAPI kanalında ayarlayın.

Tüm kanallarda Otomatik Pozlama kutusunun işaretini kaldırın, ardından DAPI kanalının yanındaki mikroskop simgesini tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. Netlemeyi yönlendirmek için kuyuyu seçin.

Bir sinyal zaten görünüyorsa, önce Otomatik Netleme'yi ve ardından Otomatik Pozlama'yı tıklatın. Değilse, önce pozlamayı artırın ve Otomatik Netleme ve Otomatik Pozlamayı tekrarlayın. Pozlama, Pozlama açılır menüsü seçilerek manuel olarak ayarlanabilir.

Birden fazla kuyucuktaki ayarları kontrol edin, ardından ayarları kaydedin. Pozlamayı tüm kanallar için aynı şekilde ayarlayın. RFP kanalı için, orta-yüksek kireçlenmeye sahip bir kuyu ile başladığınızdan emin olun.

Prosedür penceresini kapatın ve üst görev çubuğundaki yeşil Şimdi Oku düğmesini seçin. Denemeyi yazılım tarafından belirtildiği şekilde kaydedin. Her zaman noktası için bu işlemi tekrarlayın.

Sistem plakayı okurken, tüm görüntüler arka planda otomatik olarak işlenir. Görüntülenecek TsF DAPI görüntülerini seçerek hücre sayısı ayarlarını yapın. Çift tıklayarak istediğiniz kuyuyu seçin.

Yeni bir pencere açılacaktır. Görüntülerden birini seçin. Açılır pencerede Analiz sekmesini seçin.

Hücresel Analiz Hücre Sayısı'nı seçin ve Tamam'ı tıklatın. RFP ve Parlak Alan kanallarının seçimini kaldırın. Nesneleri Vurgula kutusunu işaretleyin. Menüyü açmak için Seçenekler'i tıklatın.

Boyut ve Yoğunluk Eşiği'ni tüm çekirdekleri içerecek şekilde ayarlayın, ancak kalıntıları hariç tutun, ardından Tamam'ı tıklayın. Ayarları tüm resimlere uygulamak için sol alttaki Değişiklikleri Uygula'yı tıklayın. Benzer şekilde, orta-yüksek miktarda kireçlenme içeren iyi uçlu bir görüntü seçin. Sinyal-gürültü oranını en iyi şekilde ayarlamak için, Görev menüsündeki Analiz sekmesini tıklatın.

Görüntü İstatistikleri'ni seçin. DAPI ve Parlak Alan kanalının seçimini kaldırın. Menüyü açmak için Seçenekler'i tıklatın.

Eşik Aykırı Değerleri kutusunu işaretleyin. Arka planın üzerindeki sinyalin öznel olmayan eşik değerini ayarlamak için, görev çubuğundan Çizgi aracını seçin. Bir pencere açılacaktır.

Arka planın bir alanını dahil ederken bir sinyal yaması boyunca bir çizgi çizin. Eşiklerin üst ve alt değerlerini ayarlayın. Yalnızca arka planın üzerindeki sinyali sayın ve enkaz veya eserler varsa hariç tutun.

Tamam'ı tıklatın ve ayarları diğer tüm kuyucuklara aktarmak için değişiklikleri uygulayın. Eşiğin diğer kuyularda doğru seçildiğini onaylayın. Hücre sayısı ve RFP eşikleri ayarlandıktan sonra verileri dışarı aktarın.

Verileri doğrudan bir elektronik tabloya dışa aktarmak için açılır menünün yanındaki Excel düğmesini tıklatın. Düşükten yükseğe kadar değişen farklı kalsifikasyon aşamaları tespit edildi ve analiz edildi. Kalsifikasyon, ışık mikroskobu kullanılarak siyah lekeler olarak tespit edildi, bu da birincil değerlendirme ve görüntülemeye ne zaman başlanacağını belirlemek için yararlı oldu.

Geliştirilmiş bir sinyal-gürültü oranı için, işlenmiş RFP görüntüleri kireçlenmeyi ölçmek için analiz edildi. Veriler, aynı zaman noktasında iki veya daha fazla koşulun karşılaştırılmasıyla elde edildi. Veriler, hücre başına kalsifikasyon alanı olarak hücre sayımına normalleştirildi.

Veriler aynı zamanda çeşitli zaman noktalarında aynı durumu gösteren bir zaman serisi olarak da tasvir edildi. Veri azaltma ve analizden sonraki sonuçların, görüntü dönüşümü ve eşik değerinden önce görülebilenleri yansıtması önemlidir.