Name: Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin, kriyo-EM çalışmaları için nükleozom çekirdek parçacıkları ve DNA onarım faktörleriyle komplekslerin hazırlanması yöntemini. Bu protokol, kromatin bağlamında yapısal analizleri mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'ndeki cryo-EM çekirdeğinden Dr. Mario Borgnia'ya ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'nden Dr. Joshua Strauss'a kriyo-EM ızgara hazırlığındaki mentorlukları ve eğitimleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende'ye bu projenin ilk aşamalarındaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Merhum Dr. Samuel H. Wilson ve laboratuvar üyelerinin, özellikle de Dr. Rajendra Prasad ve Dr. Joonas Jamsen'in genetik olarak kaynaşmış APE1-Polβ kompleksinin saflaştırılması için kilit katkılarını ve desteklerini takdir ediyoruz. Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir [hibe numaraları Z01ES050158, Z01ES050159 ve K99ES031662-01].

1. Nükleozom çekirdek parçacıklarını tuz-gardient diyalizi yoluyla birleştirin
NOT: Yapısal çalışmalar için rekombinant histon proteinleri kullanılarak nükleozom çekirdek parçacıklarının hazırlanması, diğerleri tarafından ayrıntılı olarak tanımlanmıştır14,15,16. Diğerleri tarafından tanımlanan rekombinant X. laevis histonlarının ve histon oktamer düzeneğinin saflaştırılmasını takip edin14,15 ve nükleozomal substratı aşağıda açıklandığı gibi birleştirin.
<ol><li>Belirtilen ölçekte üç oligonükleotid ( Tablo 1'de listelenmiştir) satın alın: UND-197mer, 161mer, 35mer.<ol><li>PAGE,17'i açıklandığı gibi ultramerleri (197mer ve 161mer) saflaştırır.<ol><li>1x tavlama tamponunda tavsal equimolar oligonükleotid miktarları (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Örneğin, 40 μL 161-mer [166,7 μM]; 8 μL 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL 197-mer comp ipliği [408,2 μM]; 10 μL 10x tavlama tamponu ve 10,9 μL dH2O. NOT: Tavlama reaksiyonunu bir sıcaklık gradyanı ile kontrol etmek çok önemlidir. Sıcaklık gradyanı ile ilgili ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>DNA'nın histon oktamerine oranını belirlemek için küçük ölçekli sulandırmalar (50 μL'lik son hacim için aşağıda gösterilen örneğin 1/57'si ile ölçeklendirin) uygulayın (DNA: oktamer'in tipik başlangıç oranları aşağıdaki gibidir: 1: 0.9, 1: 1.1, 1: 1.2, 1: 1: 2, 1: 2; Şekil 2A'da gösterilmiştir); Bu oranın küçük ölçekli yeniden yapılanmalarla ampirik olarak belirlenmesi kritik öneme sahiptir.<ol><li>Bu oran belirlendikten sonra, büyük ölçekli bir yeniden yapılanma hazırlayın. Örneğin, 32.9 μL DNA-197 bp [99.4 μM] karıştırın; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μL 5 M NaCl ve 62.3 μL WT histon oktamer [2.56 μM].</li>
	</ol></li>
	<li>Diyaliz tamponlarını yapın: RBsırasıyla Tablo 3 ve Tablo 4'te açıklandığı gibi düşük ve RByüksek; daha önce açıklandığı gibi yeniden yapılanmaları kurmak14.<ol><li>Diyaliz tüpünü RByüksekliği içeren beherin içine aktarın ve diyalizin hafifçe karıştırarak 16 saat boyunca veya 2 L RBdüşük atık kabına aktarılana kadar devam etmesine izin verin.</li>
	</ol></li>
	<li>Diyaliz tüpünü RB50mM tampon içeren 1 L'lik bir behere aktarın (Tablo 5) ve numunenin en az 3 saat veya gece boyunca diyalize girmesine izin verin.<ol><li>%6'lık bir poliakrilamid denatüre olmayan jel üzerinde sulandırma verimliliğini değerlendirerek,% 10'dan az serbest DNA ve tek bir NCP bandı olmasını sağlamak; NCP'leri 4 °C'de saklayın. Temsili optimal sulandırma sonuçları için Şekil 2A (şerit 5) ve Şekil 2B'ye bakınız.</li>
	</ol></li>
</ol>2. NCP-DNA onarım faktörü kompleksi (NCP-DRF) hazırlayın
<ol><li>Hazırlayıcı jel elektroforezi ile saflaştırma NOT: Bu yöntem en emek yoğun olanıdır (tarif edilen ikisinden) ve yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) türlerin (Şekil 6A) yüksek seyreltme faktörü nedeniyle, aşağıda gösterildiği gibi bazı sökülmelere neden olabilir. Şekil 7A (NCP hazırlık hücresi çıkış şeridi), DNA'yı serbest bırakır. Bununla birlikte,% 25'e kadar serbest DNA hala kriyo-EM çalışmaları ile uyumludur. Yüksek seyreltme nedeniyle, tüm kompleks yerine yalnızca NCP'yi saflaştırmak için bu yöntemi kullanın.<ol><li>Poliakrilamid jel çözeltisi 37.5: 1, akrilamid: bisakrilamid kullanarak, 0.2x TBE'de% 6 denatüre edici olmayan poliakrilamid jel çözeltisinin 70 mL'sini hazırlayın. Dış yarıçapı 28 mm olan silindirik bir jel dökün ve gece boyunca polimerize edin.</li>
		<li>Hazırlayıcı jel çalıştırma aparatını, 6-8 kDa MW kesimli bir diyaliz membranı kullanarak monte edin. Çalışan arabellek olarak 0,25x TBE ve 1x elüsyon arabelleği (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5) kullanın. Silindirik jeli 1 saat boyunca sabit bir 12 W'ta önceden çalıştırın ve peristaltik pompayı yaklaşık 1 mL / dak akış hızında çalıştıran fraksiyonları toplayın. NOT: DNA içeren fraksiyonları tanımlamak için bir UV dedektörü mevcut değilse, ilgilenilen fraksiyonları tanımlamak için 32P-NCP ile bir tarama deneyi yapılabilir. Tüm koşulları aynı tutarak, etiketsiz NCP'ler daha sonra bir UV dedektörü olmadan saflaştırılabilir.</li>
		<li>Bir santrifüj filtre kullanarak 2,8 mL NCP'yi 250 μL'ye konsantre edin (MW kesme 30 kDa) ve toplam 6 saat boyunca hazırlayıcı jel ve elektrofore üzerine yükleyin. 2 saatte, ksilen siyanol jelden tükendiğinde, 1.5 mL fraksiyonları toplamaya başlayın. NOT: 2.5 saatte, fraksiyonlar ksilen siyanolden temizlenecektir; DNA (197mer) yaklaşık 3-3.5 saatte ortaya çıkar ve NCP'nin 4.5-5 saat işaretinde ortaya çıkması beklenir.</li>
		<li>% 6'lık bir denatüre edici olmayan poliakrilamid jel üzerindeki ilgi fraksiyonlarını analiz edin. NCP içeren havuz fraksiyonları ve hemen bir santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa) ile 1 mg / mL'ye konsantre edin. Ertesi gün, ilgilenilen DNA onarım faktörü (DRF) ile kompleksleşmeden önce% 6 poliakrilamid denatüre olmayan jel üzerinde NCP'nin kalitesini değerlendirin.</li>
		<li>NCP'yi ve DRF'yi buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin, spesifik kompleks için en uygun tamponu kullanın. Örneğin, 1.000 μL NCP [1,2 μM] karıştırın; 260 μL 5x bağlama tamponu (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl ve 18 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM]. NOT: Kompleksin yapıldığı sıcaklık ve iyonik mukavemet, farklı kompleksler için optimizasyona ihtiyaç duyabilir.</li>
		<li>Glutaraldehit ekleyin (taze açılmış; EM notu)% 0.005'lik bir nihai konsantrasyona. Bu nedenle, bu reaksiyona, 13.2 μLdH2O ile 26.8 μL% 0.25 glutaraldehit ekleyin İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 13 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>1 M Tris-Cl, pH 7.5 ile 20 mM Tris-Cl, pH 7.5'lik nihai konsantrasyona kadar söndürün. ~50 μL'ye kadar konsantre edin ve tamponu 1x dondurma tamponu ile değiştirin: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 tuzdan arındırma sütunu kullanarak. DİKKAT: Glutaraldehit ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir; Yutulması halinde zararlıdır ve solunması halinde toksiktir. Bir laboratuvar önlüğü, gözlük, eldiven giyin ve glutaraldehiti duman başlığında tutun ve maske takın. NOT: Çapraz bağlama reaksiyonunu NCP ile bu düşük konsantrasyonda büyük bir hacimde gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu glutaraldehit konsantrasyonunda bile, ancak 10 kat daha yüksek konsantre NCP'de bile, önceki çapraz bağlama girişimleri, numunenin toplanmasına ve SDS PAGE ve boyut dışlama kromatografisinde belirtildiği gibi aşırı çapraz bağlanmaya yol açmıştır. Bu ızgaraların sadece kümelere sahip ayırt edilebilir parçacıkları yoktu (Şekil 5D, E).</li>
		<li>OD280 ve OD 260'taki absorbansları belirleyin ve OD 280'e dayanarak 1.3-3 mg / mL'ye ulaşmak için gerekirse daha fazla konsantre edin (OD260 / OD 280 = 1.7-2'nin tipik oranı iyi parçacıklar verir). 50 μL'lik bu küçük hacim için, numune kaybını azaltmanın en iyi yöntemi, bir diyaliz membranı ile kaplı 1,7 mL'lik bir tüpün kapağına sahip bir diyaliz düğmesi yapmak (6-8 kDa MW kesme), tüpün tabanını kesmek ve zarı kapağın üstüne kapatmak için tüpün kenarını kullanmaktır.</li>
		<li>Numuneyi içeren diyaliz düğmesini, membran aşağı bakacak şekilde bir polietilen glikol yatağının üzerine yerleştirin (her 2 dakikada bir ilerlemeyi kontrol edin). Bu yöntem, konsantratördeki numunenin seyreltilmesini veya kaybolmasını önlemek için ihtiyaç duyulan konsantrasyonun 2,5 kattan az veya 2,5 kata eşit olduğu durumlarda tercih edilir. Bu adımdan sonra kompleksin kriyo-EM ızgaralarını hemen hazırlamak çok önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırma<ol><li>Donmadan önceki gün, bir boyut dışlama kolonunu 60 mL dH2O ile yıkayın ve dengeleyin, ardından 80 mL dondurma tamponu (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) gece boyunca 0,4 mL / dak hızında yıkayın ve dengeleyin. NCP'leri sulandırmadan hemen sonra kullanarak, aynı kompleksi aşağıdaki gibi 2,5 kat daha fazla miktarda kullanarak hazırlayın: 2.500 μL NCP [1.2 μM] karıştırın; 650 μL 5x bağlama arabelleği; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] ve 55 μL 3M KCl.</li>
		<li>Karışımı çapraz bağlayıcı olmadan buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, preparatif jel yönteminde tarif edildiği gibi% 0.005'lik bir nihai konsantrasyona glutaraldehit ekleyin. Bununla birlikte, bu durumda, kompleksi yaklaşık 120 μL'ye kadar önceden dengelenmiş (dondurucu tamponlu) bir santrifüj filtrede yoğunlaştırın.</li>
		<li>Tepe fraksiyonlarını hemen analiz edin ve daha önce belirtildiği gibi histonları ve MBP-Pol β-APE1'i içeren fraksiyonları konsantre edin. Boyut dışlama yöntemini kullanarak başarılı sonuçlar için Şekil 5A,B,C'ye ve her iki yöntemi kullanarak Şekil 7'ye bakın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Nükleozomal kompleksi dondurun
<ol><li>Daldırma dondurucuyu açtıktan ve nemlendiriciyi 50 mL dH2 O ile doldurduktan sonra, oda sıcaklığını22° C'ye ve HR'yi (nem)% 98'e ayarlayın. Etan kabını ve sıvı azot kabını (etiketli bir ızgara kutusu içeren) ilgili alan tutucularına yerleştirin.</li>
	<li>Etan kabını etan kapağı dağıtıcısı ile örtün ve üzerine dikkatlice sıvı azot (LN2) dökün, aynı zamanda LN 2 kabını LN2 ile doldurun. LN2 seviyesi stabilize olduğunda ve% 100'e ve -180 ° C'lik bir sıcaklığa ulaştığında, etan valfini dikkatlice açın ve etan kabını şeffaf kapakta bir kabarcık oluşturana kadar doldurun. Etan dağıtıcıyı çıkarın.</li>
	<li>Kurutma cihazına iki filtre kağıdı yerleştirin ve bunları metal bir halka ile sabitleyin. Kuruluma gidin ve lekeleme için aşağıdaki parametreleri kullanın: 0 leke öncesi, 3 s leke, 0 leke sonrası; A-plunge'u seçin ve Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Ana ekranda, Forseps Yükle'ye tıklayın ve bunları karbon / uygulama tarafı sola bakacak şekilde (daha önce olduğu gibi hazırlanmış) bir ızgara ile yükleyin. Forsepsleri kalibre edin, katı bir leke sağlamak için Z eksenini ayarlayın. Alt Odacık'a tıklayın ve kompleksin 3 μL'sini (1.3-3 mg / mL; OD280). Blot/A-plunge'a tıklayın. Bu, ızgarayı önden lekelenmek üzere döndürecek ve donduracaktır.</li>
	<li>Izgarayı LN2 odasındaki ızgara kutusuna aktarın ve saklayın. Dört ızgaranın tümü dondurulduğunda ve ızgara kutusuna yerleştirildiğinde, kapağı tüm ızgaraların kapakla kaplandığı nötr konuma döndürün ve vidayı sıkın. Izgaralar, tarama başlatılana kadar LN2'de saklanabilir.</li>
</ol>4. Ekran ızgaraları
<ol><li>Numuneleri mikroskopa yüklemeden önce, vitrifiye ızgaraları bir halka üzerine yerleştirin ve bir C-klipsi kullanarak sabitleyin. Buz kontaminasyonunu önlemek için bu kırpma işlemini LN2 altında nem kontrollü bir odada gerçekleştirin.</li>
	<li>Mikroskopu yüklerken, ızgaraları 12 yuvalı bir kasete yerleştirin. Kaseti bir nanocab kapsülüne yerleştirin ve otomatik yükleyiciye yükleyin. Otomatik yükleyici robotik mekanizması işlemi başlatır.</li>
	<li>Izgarayı kasetten mikroskop aşamasına aktarın. Sahneyi 10° sallayarak ve aynı anda görüntülerde minimum düzlemsel kayma gözlenene kadar Z yüksekliğini hareket ettirerek sahne alanını ösentrik yüksekliğe ayarlayın.</li>
	<li>Ösentrik yüksekliğe ulaşıldığında, görüntülemeye başlayın. İlk olarak, her montajın 62x büyütmede çekildiği ızgaranın 3 x 3 montaj görüntüsünü alarak atlası elde edin. Farklı boyutlarda üç kare seçin; Ösentrik yüksekliği alın ve ardından 210x büyütmede görüntü alın.</li>
	<li>Bir kare görüntülendikten sonra, karelerin kenarından, ortasından ve aralarından birer delik seçin. Her deliği 2600x büyütmede görüntüleyin.</li>
	<li>Bu yüksek büyütmeli görüntüyü çekmeden önce, otomatik odaklama görüntüleme alanının bir ofsetinde gerçekleşir. Yüksek büyütmeli görüntüyü deliğin merkezinden 36.000x büyütme ve 7,1 s pozlama süresinde, 60 karede, 1,18 piksel boyutunda ve 3 μm bulanıklaştırmada çekin. Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 7'deki temsili tarama görüntülerine bakın.</li>
</ol>

<ol><li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+dynamics+at+DNA+replication%2C+transcription+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li>
<li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li>
<li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+DNA+damage+in+chromatin%3A+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li>
<li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li>
<li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li>
<li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li>
<li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li>
<li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li>
<li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme%2Fnucleosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li>
<li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurgess%2C+RRD+%22Guide+to+Protein+Purification%22">Guide to Protein Purification</a>. 463, Academic Press. (2009).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909(2016).</li>
<li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+%28Legobodies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationall+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).</li>
<li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255(2018).</li>
<li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li>
</ol>

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

DNA onarım faktörünü saflaştırmak için özel bir protokol, ilgilenilen enzime bağlı olacaktır. Bununla birlikte, protein ekspresyonu ve saflaştırma için rekombinant yöntemlerin kullanılması da dahil olmak üzere bazı genel öneriler vardır18; İlgilenilen protein çok küçükse (<50 kDa), kriyo-EM ile yapı tayini, füzyon sistemleri19, nanogövde bağlayıcı iskeleler20 ve görüntüleme stratejilerinin optimize edilmesi21 ile daha yakın za...

Ökaryotik DNA, histon proteinleri tarafından organize edilir ve sıkıştırılır ve kromatin oluşturur. Nükleozom çekirdek parçacığı (NCP), DNA onarımı, transkripsiyon ve replikasyon1 için DNA bağlayıcı proteinlere erişilebilirliği düzenleyen kromatinin temel tekrarlayan birimini oluşturur. NCP'nin ilk X-ışını kristal yapısı ilk olarak yirmi yıldan daha uzun bir süre önce çözülmüş olmasına rağmen2 ve NCP'nin daha birçok yapısı 3,4,5,6'dan beri yayınlanmış olmasına rağmen, nükleozomal substratlardaki DNA onarım mekanizmaları henüz tanımlanmamıştır. Kromatinde DNA onarımının altında yatan moleküler detayların ortaya çıkarılması, NCP'nin yerel yapısal özelliklerinin DNA onarım aktivitelerini nasıl düzenlediğini anlamak için katılımcı bileşenlerin yapısal karakterizasyonunu gerektirecektir. Bu, baz eksizyon onarımı (BER) bağlamında özellikle önemlidir, çünkü BER enzimleri ile yapılan biyokimyasal çalışmalar, kataliz için enzime özgü yapısal gereksinimlere ve DNA lezyonunun nükleozom içindeki yapısal konumuna bağlı olan nükleozomlarda benzersiz DNA onarım mekanizmaları önermektedir 7,8,9,10,11,12,13 . BER'in hayati bir DNA onarım süreci olduğu göz önüne alındığında, bu boşlukları doldurmaya ve aynı zamanda ilgili nükleozomal kompleksleri içeren diğer teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmaların gerçekleştirilebileceği bir başlangıç noktası oluşturmaya büyük ilgi vardır.
Cryo-EM, homojen numunenin büyük ölçekli hazırlanması zor olan komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını çözmek için hızla tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Bir DNA onarım faktörü (NCP-DRF) ile kompleksleştirilmiş NCP'lerin tasarımı ve saflaştırılması muhtemelen özel optimizasyon gerektirecek olsa da, kararlı bir NCP-DRF kompleksi oluşturmak ve dondurmak için burada sunulan prosedür, numunenin ve kriyo-EM ızgara hazırlığının nasıl optimize edileceği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 1'de gösterilen iki iş akışı (birbirini dışlamayan) ve protokoldeki belirli ayrıntılar kritik adımları tanımlar ve bu adımları optimize etmek için stratejiler sağlar. Bu çalışma, kromatin ve DNA onarım alanını, nükleozomal DNA onarımının moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için biyokimyasalın yapısal çalışmalarla tamamlanmasının teknik olarak mümkün olduğu bir yönde ilerletecektir.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES; pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>%25 glutaraldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 hazırlık hücresi</td><td>Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 santrifüj filtre (MW kesme 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid Cımbız</td><td>Ted Pella</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Dalma Dondurucu</td><td>Leica</td><td>Leica EM GP</td><td></td></tr><tr><td>C-1000 dokunmatik termodöngüleyici</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C-klipsler ve halkalar</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>Kırpma istasyonu</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz Membranı (MW cufoff 6-8 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15370752</td><td></td></tr><tr><td>Elmas Cımbız</td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>Entegre DNA Teknolojiler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI Titan Krios</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>FPLC arıtma sistemi</td><td>AKTA Saf</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Fraksiyon toplayıcı Model 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Kızdırma Deşarjı Temizleme Sistemi</td><td>Ted Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>Izgara Kutuları</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>Izgara Depolama Aksesuar Paketi</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Etan</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 peristaltik iki kafalı pompa</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex %16, Trisin, 1.0 mm, Mini Protein Jelleri</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (VWR) Düşük Tutma</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Poliakrilamid jel çözeltisi (37.5:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>polietilen glikol (PEG)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>PURX35050</tr><tr><td>Saflaştırılmış rekombinant DNA onarım faktörü</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Izgaralar</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant histon oktamer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı kırpma araçları</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 sütun 10/300</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>Thermo Fisher</td><td>Talos Arctica 200 kV</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız Komplesi FEI Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Gliserol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mark IV Sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filtre kağıdı (55 mM)</td><td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen siyanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Mikro Spin Tuz Giderme Kolonları, 7K MWCO, 75 & L</td><td>Termo Balıkçı Bilimsel</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

kriyo-elektron mikroskobu yapısal tayini için dna onarım faktörleri ile komplekslenmiş nükleozom Çekirdek parçacıklarının hazırlanması

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Kromatin bağlamında DNA onarımı tam olarak anlaşılamamıştır. Kromatinin temel tekrarlayan birimi olan nükleozom çekirdek parçacıklarını kullanan biyokimyasal çalışmalar, çoğu DNA onarım enziminin DNA hasarını serbest DNA'ya kıyasla daha düşük oranlarda giderdiğini göstermektedir. Baz eksizyon onarımı (BER) enzimlerinin nükleozomlardaki DNA hasarını nasıl tanıdığı ve giderdiğine dair moleküler detaylar açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, nükleozomal substratların biyokimyasal BER verileri, nükleozomun DNA lezyonunun ve enzimin konumuna bağlı olarak farklı yapısal bariyerler sunduğunu göstermektedir. Bu, serbest DNA'daki DNA hasarını gidermek için bu enzimler tarafından kullanılan mekanizmaların, nükleozomlarda kullanılanlardan farklı olabileceğini göstermektedir. Genomik DNA'nın çoğunluğunun nükleozomlara monte edildiği göz önüne alındığında, bu komplekslerin yapısal bilgisine ihtiyaç vardır. Bugüne kadar, bilimsel topluluk, bu komplekslerin teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için ayrıntılı protokollerden yoksundur. Burada, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) yapısal tayini için nükleozomun giriş-çıkışına yakın tek bir nükleotid boşluğuna bağlı iki genetik olarak kaynaşmış BER enziminden (Polimeraz β ve AP Endonükleaz1) oluşan bir kompleks hazırlamak için iki yöntem sunuyoruz. Her iki numune hazırlama yöntemi de daldırma dondurma yoluyla kaliteli ızgaraları vitrifiye etmek için uyumludur. Bu protokol, farklı BER faktörleri, öncü transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlere sahip diğer nükleozomal kompleksleri hazırlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.

MBP-Polβ-APE1'in rekombinant füzyon proteini ile bir kompleks yapmak için uygun şekilde monte edilmiş NCP'ler (Şekil 2) kullanıldı (Şekil 3). NCP'nin MBP-Polβ-APE1'e oranını kararlı bir kompleks oluşturmak için belirlemek için, NCP'nin MBP-Polβ-APE1'in 5 kat azı dişi fazlalığı ile tek başına kaymış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri (EMSA) (Şekil 4) gerçekleştirdik. Bu kompleksin optimizasyonu sırasında,...

Bu protokol, TEM ızgaralarının dondurulması için iki numune hazırlama yöntemi kullanılarak nükleozomal komplekslerin hazırlanmasını ayrıntılı olarak özetlemektedir.

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Baz eksizyon onarım enzimlerinin kromatin bağlamında DNA lezyonlarını nasıl çıkardığına dair yapısal bilgiler azdır. Bu, insan hastalıklarının etiyolojisinde rol oynayan mekanizmaları anlamamızda önemli bir boşluk oluşturmaktadır. Protokolümüzün temel avantajı, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak numune hazırlamayı optimize etmiş olmamızdır.Bu, alandaki diğer biyokimyacıların biyokimyasal çalışmalarını teknik olarak uygulanabilir kriyo-EM çalışmaları ile tamamlamalarını sağlayacaktır. Protokolümüz, öncü transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer faktörlerin nükleozomu nasıl etkilediğini araştırmak için de kullanılabilir. Bu, yapısal bilginin de sınırlı olduğu bir alandır.Dondurma koşullarına geçmeden önce numune hazırlamayı optimize etmek, projemizi ileriye taşımanın anahtarıydı ve bu en iyi şekilde substrat tasarımı, bağlama ve çapraz bağlama koşullarında standart biyokimyasal analizlerle yapılır. Başlamak için, NCP'yi ve ilgilenilen DNA onarım faktörünü, spesifik kompleks için en uygun tamponu kullanarak 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra,% 0.005'lik bir son konsantrasyona glutaraldehit ekleyinİyice karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında 13 dakika boyunca inkübe edin.Bir molar Tris-CL ile pH 7.5 ile 20 milimolar Tris-CL'nin son konsantrasyonuna kadar söndürün. Daha sonra, yaklaşık 50 mikrolitreye konsantre edin ve tamponu bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak dondurma tamponu ile değiştirin. Daha sonra, optik yoğunluk 280 ve 260 nanometredeki absorbansları belirleyin ve optik yoğunluk 280 nanometreye dayanarak mililitre başına 1.3 ila 3 miligrama ulaşmak için gerekirse daha fazla konsantre olun.Diyaliz düğmesini hazırladıktan sonra, numuneyi içeren düğmeyi, membran aşağı bakacak şekilde bir polietilen glikol yatağının üzerine yerleştirin. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırmayı gerçekleştirmek için, bir boyut dışlama sütununu 60 mililitre damıtılmış su ile yıkayın ve dengeleyin, ardından dakikada 0,4 mililitre oranında gece boyunca 80 mililitre dondurma tamponu izleyin. Ardından, tepe fraksiyonlarını hemen analiz edin ve histonun infüzyon proteini MBP-PolBeta-APE1'i içeren fraksiyonları konsantre edin.Aşağıdaki prosedürleri gösteren, NIH'deki cryo-EM çekirdeğinden bir bakalorya sonrası stajyer olan Elizabeth Viverette olacaktır. Daldırma dondurucuyu açtıktan ve nemlendiriciyi 50 mililitre damıtılmış suyla doldurduktan sonra, oda sıcaklığını 22 santigrat dereceye ve nemi% 98'e ayarlayınDaha sonra etan kabını ve sıvı azot kabını ilgili alan tutuculara yerleştirin. Daha sonra, etan kabını etan kapağı dağıtıcısı ile örtün ve azot kabını sıvı azotla doldururken üzerine dikkatlice sıvı azot dökün.Sıvı azot seviyesi stabilize edildiğinde ve% 100'e ulaştığında ve sıcaklık eksi 180 santigrat dereceye ulaştığında, etan valfini dikkatlice açın ve etan kabını şeffaf kapakta bir kabarcık oluşturana kadar doldurun. Ardından etan dağıtıcısını çıkarın. Kurutma cihazına iki filtre kağıdı yerleştirin ve bunları metal bir halka ile sabitleyin.Kuruluma gidin ve makalede açıklandığı gibi lekeleme parametrelerini ayarlayın, ardından A-Plunge'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Ana ekranda, Forseps Yükle'ye tıklayın ve karbon uygulama tarafı sola bakacak şekilde bir ızgara ile yükleyin. Forsepsleri kalibre edin, katı bir leke sağlamak için Z eksenini ayarlayın. Alt Oda'ya tıklayın ve kompleksin üç mikrolitresini uygulayın.Ardından, ızgarayı önden lekelemek için döndürecek ve daldırıp donduracak olan Blot A-Plunge'a tıklayın. Aktardıktan sonra, ızgarayı sıvı azot odasındaki ızgara kutusunda saklayın. Dört ızgaranın tümü dondurulduğunda ve ızgara kutusuna yerleştirildiğinde, kapağı tüm ızgaraların kapakla kaplandığı nötr konuma döndürün ve vidayı sıkın.Numuneleri mikroskopa yüklemeden önce, vitrifiye ızgaraları bir halka üzerine yerleştirin ve buz kontaminasyonunu önlemek için nem kontrollü bir odada sıvı azot altında bir C-klipsi kullanarak sabitleyin. Mikroskopu yüklerken, ızgaraları 12 yuvalı bir kasete yerleştirin. Kaseti bir nanocab kapsülüne karıştırın ve otomatik yükleyiciye yükleyin.Ardından, ızgarayı kasetten mikroskop aşamasına aktarın. Sahneyi 10 derece sallayarak ve aynı anda görüntülerde minimum düzlemsel kayma gözlenene kadar Z yüksekliğini hareket ettirerek sahneyi ösentrik yüksekliğe ayarlayın. Ösentrik yüksekliğe ulaşıldığında, atlası elde etmek için her montajın 62x büyütmede çekildiği ızgaranın 3'e 3 montaj görüntüsünü alarak görüntülemeye başlayın.Farklı boyutlarda üç kare seçtikten ve ösantrik yüksekliği aldıktan sonra, 210x büyütmede görüntü. Bir kare görüntülendikten sonra, karelerin kenarından, ortasından ve aralarından birer delik seçin. Ardından, her deliği 2.600x büyütmede görüntüleyin.Yüksek büyütmeli görüntüyü deliğin ortasından 36.000x büyütmede ve 7,1 saniye pozlama süresinde, 60 karede, 1,18 piksel boyutunda ve üç mikrometre bulanıklaştırmada çekin. Gösterimin temsili görüntülerine bakın. NCP'nin MBP-PolBeta-APE1'e oranını kararlı kompleks oluşturmak için belirlemek için, beş kat MBP-PolBeta-APE1 azı dişi fazlalığı ile NCP'nin tek tek kaydırılmış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri yapıldı.Daha küçük hacimde, NCP-PolBeta-APE1 kompleksinin montajı, numunenin aşırı çapraz bağlı olduğunu ve fark edilebilir bireysel kompleksleri olmayan agregalarla sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, NCP'lerde on kat seyreltme, agregasyonun önemli ölçüde azalmasına ve parçacık stabilitesinin iyileştirilmesine neden olmuştur. Hazırlayıcı jel ve boyut dışlama yöntemleri, preparatif jelin önemli miktarda yüksek moleküler ağırlıklı agrega içerdiklerinde NCP'lerin kalitesini arttırdığı ve ardından kompleksin boyut dışlama yoluyla saflaştırılması ile birleştirilebilir.Sonuçlar, her iki yöntemin de kararlı kompleksler oluşturmak için bağımsız olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, her iki ızgaradan toplanan veriler, yaklaşık 3.2-angstrom çözünürlükte neredeyse aynı iki boyutlu sınıfları ve üç boyutlu haritaları göstermektedir. Önce NCP'nin DNA onarım faktörüne optimal bir oranı belirlenmeli, daha sonra kompleksin glutaraldehit ile çapraz bağlanması, donma için gereken konsantrasyondan en az 10 kat daha seyreltik yapılmalıdır.Kompleksin bir kriyo-EM 3D haritası elde edildikten sonra, DNA onarım faktörünün nasıl bulunduğunu belirlemek ve bu etkileşimler için hangi bölgelerin önemli olduğunu belirlemek için daha fazla yapısal iyileştirmeye ihtiyaç duyulacaktır.

preparation-nucleosome-core-particles-complexed-with-dna-repair

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Keşfedin, kriyo-EM çalışmaları için nükleozom çekirdek parçacıkları ve DNA onarım faktörleriyle komplekslerin hazırlanması yöntemini. Bu protokol, kromatin bağlamında yapısal analizleri mümkün kılar.

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması (Video) | JoVE Journal

Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması

Daha fazla video keşfet