Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

Bu yöntemde, kuvvet doğrudan çekirdeğe uygulanır. Bu, kuvvet iletim etkisini hücre plazma zarından ve sitoiskeletten ayırır ve nükleer mekanosensingin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarır. Kuvvet, canlı hücreler içinde invaziv olmayan bir şekilde uygulanır.

Optik cımbızla karşılaştırıldığında, manyetik alan ve manyetik kuvvet hücre fonksiyonlarını etkilemez ve daha yüksek verime sahiptir. Ortalama çapı yedi mikrometreye sahip 0.2 gram karbonil demir mikroboncuk tartarak hücreleri manyetik mikroboncuklarla kültürlemeye başlayın. Mikroboncukları bir pipet kullanarak bir mililitre RPMI 1640 kültür ortamında askıya alın.

Daha sonra B2B hücreli Petri kabını biyogüvenlik kabinine alın ve Petri kabına mikroboncuk içeren ortamın 200 mikrolitresini hızla ekleyin. Petri kabını, mikroboncuklar hücreler tarafından içselleştirilene kadar bir inkübatöre koyun. Ters çevrilmiş mikroskobu açın ve konfokal floresan görüntülemeyi kullanarak, mikroboncuk, nükleer ve hücre sınırını görselleştirerek her altı saatte bir hücre hatlarının içselleştirilmesi için en uygun zamanı belirleyin.

İçselleştirilmiş mikroboncuklar hücre sınırı içinde mevcut olacaktır. Küçük kuvvet uygulaması ve canlı hücre görüntüleme için, Elements yazılım uygulamasını açın. Yapılandırma manyetik bulgusunu tanımlamak için, tarama hızını iki saniyede bir kareye ayarlamak üzere ikiden fazla düğmeyi tıklatın.

İğne deliği boyutunu 1,2 Havadar üniteye ayarlayın. Yalnızca FITC kanalını kontrol edin ve PMT HV'yi 70, ofset sıfır, lazer yoğunluğunu 10 olarak ayarlayın. Manyetik YAP çekirdeği yapılandırmasını tanımlamak için, dörtten fazla düğmeye tıklayarak tarama hızını dört saniyede bir kareye ayarlayın.

Ardından, iğne deliği boyutunu 1.2 Havadar üniteye ayarlamak için 1.2 Havadar ünite düğmesine tıklayın ve FITC kanalını kontrol edin. PMT HV'yi 70, ofset sıfır, lazer yoğunluğunu 10 olarak ayarlayın. Çekirdek sınırını ve nükleer leke yoğunluğunu görüntülemek için, siyanin 5 kanalını kontrol edin.

1.2 Havadar ünite düğmesine tıklamayın ve PMT HV'yi 70'e, ofset sıfıra ve lazer yoğunluğunu 10'a ayarlamayın. İğne deliği boyutu, üç boyutlu YES ile ilişkili protein görüntüleme için optimize edilecektir. Ardından, DIA'yı Elements aracılığıyla açın.

Döndürme görünümünü açın, parlak bir alan kullanın ve hücrelerin net bir odak içi görüntüsünü elde etmek için nesnenin odağını ayarlayın. İçinde tek bir mikroboncuk bulunan, içinde birden fazla mikroboncuk bulunan ve içinde herhangi bir mikroboncuk bulunmayan bir hücre gibi üç koşulda uygun çoklu tek hücreleri bulmak için 10X hedefi kullanın. Ardından 40X hedefine geçin ve bu pozisyonu uygun pozisyon numarasıyla adlandırın.

Elements'i açın, manyetik bul'a tıklayın, kilidi kaldırın, ardından sekmeleri tarayın, ardından seçilen hücrelerin Z yığını için alt ve üst sınırı ayarlamak üzere odak düzleminin Z konumunu ayarlamak için üst ve alt düğmeleri seçin. Tara'yı tekrar tıklatarak taramayı durdurun. Manyetik YAP çekirdek yapılandırmasına geçin ve dosya adını before_small_force.nd2 olarak ayarlayın.

Kaydedilen Z yığını ile çalıştır düğmesine tıklayın. Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. spin görünümünü açın ve kayıt düğmesine tıklayın.

Mıknatıs hareket ettirici cihazın düğmesini döndürerek mıknatısı Petri kabının tabanının 46 milimetre yukarısına getirin. Manyetik kuvvetin neden olduğu mikroboncuk yer değiştirmesini doğrulamak için videoyu kaydedin ve kontrol edin. Dosya adını after_small_force.nd2 olarak ayarlayarak tarama yordamını yineleyin.

Ardından, sağ ışık yoluna geçin, DIA'yı açın ve kayıt düğmesine tıklamadan önce döndürme görünümünü açın. Mıknatıs hareket ettirici cihaz düğmesini Petri kabının altından 120 milimetreye kadar döndürün ve parlak alan görüntü dizisini veya videosunu kaydedin. Dosya adını before_large_force.nd2 olarak ayarlayarak tarama adımlarını yineleyin.

Mikroboncuklar, FITC veya siyanin 5 kanalında lazer uyarımı altında floresan yayamazlar. Böylece, içselleştirilmiş mikroboncuklar, YES ile ilişkili protein ve çekirdeğin floresansının konfokal görüntülemesinde bulunan koyu oyukla tanımlanmıştır. Nükleer döngüsellik, kontrol hücreleri ile mikroboncuk içselleştirmeli hücreler arasında anlamlı bir fark göstermedi.

Mikroboncukla birlikte kültürlenmiş ancak içselleştirme yapılmamış kontrol hücrelerinin YES ile ilişkili protein hücresi çekirdeği-sitoplazma oranı ve mikroboncuk içselleştirmeli hücreler de anlamlı bir fark göstermemiştir. Aktinin çekirdek deformasyonu ve depolimerizasyonu, sitoiskelet içeren hücrelerde mikroboncuklar tarafından uygulanan sıkıştırma kuvvetinden kaynaklanmıştır. Kantitatif AFM kuvvet yer değiştirme ilişkisi tarafından sağlanan kantitatif görüntüleme analizi kalibrasyon eğrisi.

Bu ilişkiye dayanarak, boncukların uyguladığı kuvvet tahmin edildi. Çekirdek deformasyonu ve YES ile ilişkili protein translokasyonu, uygulama veya manyetik kuvvetin serbest bırakılması üzerine gözlendi. Yeşil kanaldaki YES ile ilişkili proteindeki yoğunluk değişiklikleri ve kırmızı kanaldaki çekirdek boyamasında hiçbir değişiklik olmaması, manyetik kuvvet kaynaklı nükleer deformasyonun YES ile ilişkili protein translokasyonu tarafından tetiklendiğini doğruladı.

İki grup içinde YES ile ilişkili protein çekirdeği-sitoplazma oranının net değişiminin nicelleştirilmesi, sitoplazma içindeki mikroboncuklara uygulanan manyetik kuvvetin YES ile ilişkili protein translokasyonunu indüklediğini ve YES ile ilişkili protein çekirdeği-sitoplazma oranını değiştirdiğini doğruladı. Kuvvet ve görüntüleme uygulamadan önce, hücrelerin manyetik mikro boncukları içselleştirdiğinden ve boncukların hücre sınırı içinde olduğundan emin olun.