Name: Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Öğrenin, manyetik mikroboncuklar ve konfokal floresan görüntüleme kullanarak hücre çekirdeğine mekanik kuvvet uygulama yöntemini. Bu teknik, çekirdek mekanobiyolojisindeki moleküler mekanizmaları canlı hücrelerde invaziv olmayan şekilde ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje UF Gatorade Ödülü Başlangıç Paketi (X. T.), UFHCC Pilot Ödülü (X. T. ve Dr. Dietmar Siemann), UF Fırsat Tohum Fonu (X. T.) ve UFHCC Üniversitesi Bilim İnsanları Programı (H. Y. Wang) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Nöroşirürji), Dr. Tian He (Harvard Üniversitesi), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Politeknik Üniversitesi), Dr. Jessie L-S Au (Kantitatif Sistemler Farmakoloji Enstitüsü), Dr. David Hahn (Arizona Üniversitesi), ve Nikon Destek Ekibi (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon ve Jon Ekman). Tang'ın, Yamaguchi'nin, Sharma'nın, Au'nun, Siemann'ın ve Guan'ın araştırma laboratuvarlarının tüm üyelerinden ve UF MAE Departmanının tüm personelinden gelen etkili destek için derinden minnettarız.

1. CRISPR / Cas9 mühendisliği B2B hücrelerinin bakımı
<ol><li>RPMI-1640'lı bir T25 şişesindeki kültür B2B hücreleri,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenir.</li>
	<li>B2B hücrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.</li>
	<li>Alt kültür, B2B hücreleri, akıcılık% 70 ila% 80'e ulaştığında.</li>
	<li>B2B hücre hattını RPMI-1640 kültür ortamında, %10 (v/v) DMSO ile -80 °C dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Deneylerde geçiş numarası 10'dan az olan B2B hücrelerini kullanın.</li>
</ol>2. Hücre kültürü
<ol><li>Hücreleri cam tabanlı bir Petri kabına tohumlayın.<ol><li>İçinde B2B hücreleri bulunan şişeyi inkübatörden biyogüvenlik kabinine taşıyın.</li>
		<li>Şişedeki kültür ortamını, vakum pompası bağlı aspire edici bir pipet kullanarak çıkarın.</li>
		<li>Şişeyi 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
		<li>Aspire edici pipeti kullanarak PBS'yi çıkarın.</li>
		<li>Hücreleri şişe substratının altından ayırmak için 0.5 mL% 0.05 Tripsin çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Şişeyi 5 dakika boyunca inkübatöre koyun.</li>
		<li>Şişeyi biyogüvenlik kabinine taşıyın. Şişeye 5 mL yeni kültür ortamı ekleyin ve çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
		<li>Ortamın 50 μL'sini hücrelerle (300 hücre / μL) cam tabanlı Petri kabına koyun. Petri kabına 2 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
		<li>Petri kabını inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin bağlanması için 12 saat bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Manyetik mikroboncuklarla hücreleri kültürleyin.<ol><li>0,2 g ağırlığında 7 μm ortalama çaplı karbonil demir mikroboncuklar (bundan böyle 7 μm mikroboncuklar olarak anılacaktır, Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Mikroboncukları 1 mL RPMI-1640 kültür ortamında askıya almak için bir pipet kullanın.</li>
		<li>B2B hücreli Petri kabını biyogüvenlik kabinine götürün.</li>
		<li>Petri kabına mikroboncuk içeren ortamın 200 μL'sini ekleyin. NOT: Mikro boncukların çökelmesini önlemek için ortamı hızlı bir şekilde ekleyin.</li>
		<li>Petri kabını, mikroboncuklar hücreler tarafından içselleştirilene kadar inkübatöre geri koyun. Farklı hücre hatları için içselleştirme için en uygun zamanı belirlemek üzere içselleştirmeyi her 6 saatte bir kontrol edin.</li>
		<li>İçselleştirmeyi kontrol etmek için, mikroboncuk, nükleer ve hücre sınırını görselleştirmek için konfokal floresan görüntüleme gerçekleştirin. Mikroboncuk hücre tarafından içselleştirilirse, hücre sınırı içinde olacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Çekirdeğin görselleştirilmesi
<ol><li>İnkübatördeki kültür ortamının 1,5 mL'sini 15 dakika ısıtın.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabininin ışığını kapatın. Hücreyi, ısıtılmış kültür ortamını, nükleer lekeyi ve Verapamil HCl'yi içeren Petri kabını biyogüvenlik kabinine alın. NOT: Nükleer boyama bileşenleri ışığa duyarlıdır. Çalışma sırasında ışığa maruz kalmaktan kaçının.</li>
	<li>DMSO ile 1000x nükleer lekeyi 100x'e kadar seyreltin.</li>
	<li>DMSO ile 100 mM Verapamil HCl'yi 10 mM'ye kadar seyreltin.</li>
	<li>1,5 mL kültür ortamına 15 μL 100x nükleer leke ve 15 μL 10 mM Verapamil HCl ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.</li>
	<li>Kültür ortamını Petri kabından çıkarın. Petri kabına nükleer boyama içeren kültür ortamını ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 2 saatten fazla bir süre boyunca inkübatöre geri koyun.</li>
</ol>4. Manyetik kuvvet uygulama donanımının hazırlanması
<ol><li>Tüm parçaları akrilonitril bütadien stiren (ABS) kullanarak 3D baskı yapın ve CAD tasarımını izleyerek birleştirin (Şekil 1A). CAD tasarımı Malzeme Tablosuna dahil edilmiştir.</li>
	<li>Mıknatısı mıknatıs hareket ettiren cihaza bağlamak için çift taraflı bant kullanın (Şekil 1A).</li>
	<li>Mıknatıs hareket ettirici cihazı mikroskop aşamasının yanına yerleştirin. Petri kabının üzerinde 13 mm ile 120 mm arasında hareket edene kadar mıknatısın uzamsal konumunu ayarlamak için üç düğmeyi kullanın. NOT: Manyetik mikro boncuklar üzerinde istenmeyen kuvvet uygulanmasını önlemek için mıknatıs ve Petri kabı arasındaki mesafenin üst sınırının mümkün olduğunca büyük olduğundan emin olun. 120 mm, bu deney düzeneğindeki maksimum değerdir. Mıknatısın, hedefler ve motorlu aşamalar dahil olmak üzere mikroskop parçalarına müdahale etmediğinden emin olun.</li>
	<li>Mıknatısı en yüksek z konumuna (120 mm'de) ayarlayın.</li>
</ol>5. Zorla uygulama ve canlı hücre görüntüleme
<ol><li>Uzun süreli görüntüleme için çevre odasının kurulması<ol><li>Çevre odasını iyice sterilize etmek ve temizlemek için% 75 etanol çözeltisi uygulayın.</li>
		<li>Çevre odasını ters çevrilmiş mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin.</li>
		<li>CO2 tankını açın ve CO2 giriş hızını 160 mL / dak'ya ayarlayın.</li>
		<li>Odanın sıcaklığını 44 °C (Üst), 42 °C (Banyo) ve 40 °C (Aşama) olarak ayarlayın.</li>
		<li>% 90 nemi korumak için çevre odasının banyosuna 20 mL arıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>Hedef hücreleri içeren cam tabanlı Petri kabını doku kültürü inkübatöründen çıkarın ve odaya yerleştirin.</li>
		<li>Petri çanağı konumunu sabitlemek için çevre odasının metal kelepçesini uygulayın. NOT: Petri kabı haznede sıkıca kenetlenmelidir, çünkü manyetik kuvvet kelepçelenmezse çanağı hareket ettirebilir.</li>
		<li>Odanın kapağını kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme parametrelerinin optimizasyonu<ol><li>İğne deliği boyutunu optimize edin: İğne deliği, odak dışı fotonları engeller. Daha büyük bir iğne deliği boyutu, daha fazla odak dışı foton verir, ancak daha parlak bir görüntü verir. Daha küçük bir iğne deliği boyutu, daha odaklanmış ve daha kısık bir görüntü sağlar. Uygun sinyal-gürültü oranına sahip odak içi konfokal görüntüler elde etmek için iğne deliği boyutunu optimize ettiğinizden emin olun.</li>
		<li>Lazer yoğunluğunu optimize edin: Lazer yoğunluğu, uyarılma yoğunluğunu ve dolayısıyla emisyon ışığını belirler. Düşük lazer yoğunluğu, düşük sinyal-gürültü oranı sağlar. Çok yüksek bir lazer yoğunluğu fotobeyazlatmaya neden olur. Lazer yoğunluğunu buna göre ayarlayın.</li>
		<li>Adım boyutunu ve adımlarını optimize edin: Adımlar ve adım boyutu, bir Z-yığınında kaç görüntü alacağını belirler. Daha küçük adım boyutları ve daha fazla adım, Z-yığını çözünürlüğünü artıracak, ancak aynı zamanda fotobeyazlatmayı da artıracaktır. Bu deneyde, ~15 μm hücre yüksekliğine sahip hücreler için 1 μm adım boyutu kullanılmıştır.</li>
		<li>Maruz kalma süresini optimize edin: Maruz kalma süresi, hücrenin uyarma lazerine ne kadar süre maruz kalacağını belirler. Düşük pozlama süresi sinyal-gürültü oranını azaltacaktır. Yüksek pozlama süresi fotobeyazlatmaya neden olur. Bu deneyde 4 sn'de 1 karelik bir pozlama süresi kullanılmıştır.</li>
		<li>Görüntüleme parametrelerinin optimizasyonu: Dört parametreden birini yinelemeli olarak değiştirin ve diğer parametreleri tutarlı tutun. Her seferinde, her görüntünün YAP N / C oranını ölçün ve fotobeyazlatma seviyesini belirlemek için YAP N / C oranı değişimini karşılaştırın. Sinyal-gürültü oranı, görüntüleme hızı ve fotobeyazlatma arasında bir denge kurana kadar optimizasyon işlemini tekrarlayın.</li>
		<li>Deneyler sırasında daha hızlı görüntüleme ayarları için optimize edilmiş görüntüleme parametrelerini kullanarak görüntüleme yapılandırmalarını tanımlayın. NOT: Bu çalışmada kullanılan konfigürasyonlar görüntüleme parametrelerinin 5.3. bölümünde açıklanmıştır. Bölüm 5.3'teki konfigürasyonların görüntüleme parametrelerini optimize etmek için, adım 5.2.5'teki yöntemle aynı yöntemi kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Küçük kuvvet uygulaması ve konfokal görüntüleme NOT: Bu çalışmada görüntüleme için Nikon Ti2-E mikroskobu kullanılmıştır ve görüntü elde etmek için ayrıntılı adımlar aşağıda verilmiştir.<ol><li>Ters çevrilmiş mikroskobu açın. Elements yazılım uygulamasını açın.</li>
		<li>Yapılandırma magnetic_find tanımlayın. Yalnızca FITC kanalını kontrol edin. PMT HV = 70, Ofset = 0, Lazer yoğunluğu = 10 olarak ayarlayın. 1/2 düğmesine tıklayarak tarama hızını 2 sn'de 1 kareye ayarlayın. 1,2 A.U. düğmesine tıklayarak iğne deliği boyutunu 1,2 AU olarak ayarlayın. Bu yapılandırma adım 5.3.5'te kullanılacaktır.</li>
		<li>Yapılandırma magnetic_YAP_Nucleus tanımlayın. FITC kanalını kontrol edin. PMT HV = 70, Ofset = 0, Lazer yoğunluğu = 10 olarak ayarlayın. 1 /2 düğmesine tıklayarak tarama hızını 4 sn'de 1 kareye ayarlayın. 1,2 A.U. düğmesine tıklayarak iğne deliği boyutunu 1,2 AU olarak ayarlayın. Çekirdek sınırını ve nükleer leke yoğunluğunu görüntülemek için Cy5 kanalını kontrol edin. PMT HV = 70, Ofset = 0, Lazer yoğunluğu = 10 olarak ayarlayın. İğne deliği boyutu 3D YAP görüntüleme için optimize edilmiştir. Cy5 kanalını kontrol ettikten sonra 1.2 A.U . düğmesine tekrar tıklamayın. Bu yapılandırma adım 5.3.7'de kullanılacaktır.</li>
		<li>Gerekirse Elements üzerinden DIA'yı açın. SpinView'i açın, parlak bir alan kullanın ve hücrelerin net bir odak içi görüntüsünü elde etmek için nesnenin odağını ayarlayın. Üç koşulda uygun çoklu tek hücreleri bulmak için 10x hedefi kullanın: içinde tek bir mikroboncuk ile, içinde birden fazla mikroboncuk ile ve içinde herhangi bir mikroboncuk olmadan. 40x hedefine geçin. Bu pozisyonu uygun pozisyon numarasıyla adlandırın.</li>
		<li>Elements'ı açın. magnetic_find tıklayın. Kilidi Kaldır düğmesini tıklayın.</li>
		<li>Tara'yı tıklatın ve odak düzleminin Z-konumunu ayarlayın. Seçili hücrelerin Z yığını için alt ve üst sınırı ayarlamak üzere Üst ve Alt düğmelerini tıklatın. Tara'yı tekrar tıklatarak taramayı durdurun.</li>
		<li>magnetic_YAP_Nucleus yapılandırmasına geçin. Dosya adını before_small_force.nd2 olarak ayarlayın. Kaydedilen Z-yığını ile Çalıştır düğmesine tıklayın.</li>
		<li>Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. SpinView'i açın ve Kayıt düğmesine tıklayın. Bu arada, mıknatısı Petri kabının tabanından 46 mm yukarıya doğru hareket ettirmek için mıknatıs hareket ettiren cihazın düğmesini döndürün. Parlak alan görüntü dizisini veya videoyu kaydedin. Mikroboncukların manyetik kuvvetin neden olduğu yer değiştirmeyi gösterdiğini doğrulamak için videoyu kontrol edin.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7 arasındaki adımları yineleyin; dosya adını after_small_force.nd2 olarak ayarlayın.</li>
		<li>Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. Ardından, SpinView'i açın ve Kayıt düğmesine tıklayın. Bu arada, mıknatısı Petri kabının tabanından 120 mm yukarıya taşımak için mıknatıs hareket ettiren cihazın düğmesini döndürün. Parlak alan görüntü dizisini veya videoyu kaydedin.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7 arasındaki adımları yineleyin ve dosya adını before_large_force.nd2 olarak ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Büyük kuvvet uygulaması ve konfokal görüntüleme<ol><li>Mıknatısın Petri kabı tabanının 13 mm yukarısına ulaşmasını sağlamak için çevre odasının kapağını çıkarın.</li>
		<li>Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. SpinView'i açın ve Kayıt düğmesine tıklayın. Bu arada, mıknatısı Petri kabının tabanından 13 mm yukarıya doğru hareket ettirmek için mıknatıs hareket ettiren cihazın düğmesini döndürün. Parlak alan görüntü dizisini veya videoyu kaydedin. Mikroboncukların manyetik kuvvetin neden olduğu yer değiştirmeyi gösterdiğini doğrulamak için videoyu kontrol edin.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7 arasındaki adımları yineleyin ve dosya adını after_large_force.nd2 olarak ayarlayın.</li>
		<li>Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. Ardından, SpinView'i açın ve Kayıt düğmesine tıklayın. Bu arada, mıknatısı Petri kabının tabanından 120 mm yukarıya taşımak için mıknatıs hareket ettiren cihazın düğmesini döndürün. Parlak alan görüntü dizisini veya videoyu kaydedin.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7 arasındaki adımları yineleyin; dosya adını retract_large_force.nd2 olarak ayarlayın.</li>
		<li>Çevre odasının kapağını kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Gerekirse daha fazla veri elde etmek üzere birden çok görünüm alanı için 5.2 ve 5.3 numaralı adımları yineleyin.</li>
</ol>6. Görüntü işleme ve veri analizi
<ol><li>YAP N/C oranının ölçülmesi<ol><li>Fiji ImageJ'yi açın. Adım 5'te çekilen .nd2 görüntülerini açın.</li>
		<li>Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın. Alanı, entegre yoğunluğu, ortalama gri değeri ve şekil tanımlayıcılarını kontrol edin.</li>
		<li>Çekirdeği tanımlamak için Cy5 kanalını kullanın. Çekirdeği özetlemek üzere serbest seçim aracını kullanmak için Serbest El Seçimleri'ne tıklayın. Ayrıca, ImageJ'deki otomatik nükleer maske makrosunu kontrol edin ( bkz.</li>
		<li>FITC kanalında Analiz > Ölçü'yü tıklayın. Ortalamanın ölçülen değeri, ortalama nükleer YAP yoğunluğu DN'dir.</li>
		<li>Çekirdeği tanımlamak için Cy5 kanalını kullanın. Hücreyi tanımlamak için FITC kanalını kullanın. Sitoplazma içinde ilgilenilen bir bölgeyi seçmek ve manyetik mikroboncuklardan kaçınmak üzere serbest seçim aracını kullanmak için Serbest El Seçimleri'ni tıklayın. Bu ilgi alanı çekirdeği içermemelidir.</li>
		<li>FITC kanalında Analiz > Ölçü'yü tıklayın. Ortalamanın ölçülen değeri, ortalama sitoplazmik YAP yoğunluğu DC'dir.</li>
		<li>YAP N/C oranını = DN / DC'yi hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Nükleer şeklin ve normalleştirilmiş nükleer leke yoğunluğunun ölçülmesi<ol><li>Fiji ImageJ'yi açın. Adım 5'te çekilen .nd2 görüntülerini açın.</li>
		<li>Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın. Alanı, entegre yoğunluğu, ortalama gri değeri ve şekil tanımlayıcılarını kontrol edin.</li>
		<li>Çekirdeği tanımlamak için Cy5 kanalını kullanın. Çekirdeği özetlemek üzere serbest seçim aracını kullanmak için Serbest El Seçimleri'ne tıklayın.</li>
		<li>Cy5 kanalında Analiz > Ölçü'ye tıklayın. Ortalamanın ölçülen değeri nükleer leke yoğunluğudur. Circ'in ölçülen değeri. nükleer döngüselliktir.</li>
		<li>Nükleer leke yoğunluğunu farklı kuvvet durumunda karşılaştırmak için, tüm nükleer leke yoğunluğu, normalleştirilmiş nükleer leke yoğunluğunu üretmek için "before_small_force.nd2" deki nükleer leke yoğunluğuna bölünür.</li>
	</ol></li>
</ol>

Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Manyetik mikroboncukların içselleştirilmesi (bölüm 2.2) kritiktir, çünkü hücre dışı mikroboncuklar doğrudan çekirdeğe kuvvet uygulayamaz. Kuvvet uygulaması ve görüntüleme (bölüm 5.3) bu deneydeki kritik adımlardır ve çekirdeği deforme etmek ve anlamlı biyolojik sonuçlara neden olmak için gereken kuvvet örneğe bağlı olabilir. Bu deneydeki kuvvet büyüklüğü (0.8 nN ve 1.4 nN), daha az hassas hücrelerde nükleer mekano-algılamayı tetiklemek için daha da arttırılabilir.
Manyetik kuvveti yüksek verim...

Bu çalışma, mekanik kuvveti doğrudan hücre çekirdeğine uygulayan manyetik aktüatörler ile yapısal ve fonksiyonel hücre altı değişiklikleri aynı anda görüntüleyen konfokal floresan mikroskobu birleştirilerek çekirdek mekanobiyolojisini aydınlatmak için yeni bir teknik geliştirmeyi ve uygulamayı amaçlamaktadır. Hücreler, doku sertliği 1,2,3,4, interstisyel sıvı basıncı ve kesme gerilmesi 5,6,7, yüzey topolojisi / geometrisi 8,9,10,11,12 ve gerilim / sıkıştırma gerilimi 13,14 dahil olmak üzere hücre dışı biyofiziksel sinyalleri algılar. 15,16. Biyofiziksel sinyaller biyokimyasal sinyallere dönüştürülür ve gen ekspresyonunun ve hücre davranışlarının potansiyel aşağı akış değişikliklerini tetikler - mekanotransdüksiyon 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 olarak bilinen bir süreç . Mekanotransdüksiyon süreçlerini incelemek için, atomik kuvvet mikroskobu 28, hücre germe cihazı29, biyo-MEMS (mikro-elektromekanik sistemler) kuvvet sensörü 15,30,31, kesme reolojisi32 ve StereoGörüş Sistemi 33 gibi hücrelere mekanik kuvvet uygulamak için sayısız teknik geliştirilmiştir. . Yakın tarihli bir derleme, hücre dışı mekanik ipuçlarını uygulamak ve mekanosensing'e müdahale etmek için yaklaşımları özetlemektedir34. Bugüne kadar, bu yöntemlerin çoğu hücre plazma zarına kuvvet uygular ve hücreler bu hücre dışı biyofiziksel sinyalleri doğrudan integrin, kadherin, iyon kanalları ve G-Proteini bağlı reseptörler gibi membran reseptörleri aracılığıyla alırlar. Daha sonra, sinyali hücre içi hücre iskeletine ve çekirdeğe iletir. Örneğin, mekano-algılamanın bir göstergesi olarak evet ilişkili protein (YAP) translokasyonu kullanılarak, hücrelerin substrat sertliğinin ve hücre dışı gerilimin mekanik sinyallerini hücre zarından algıladıkları ve YAP sitoplazmasından çekirdeğe translokasyonunu indüklemek için bunları hücre iskeletinden çekirdeğe ilettikleri gösterilmiştir28,35.
Son kanıtlar, hücre çekirdeğinin kendisinin bağımsız bir mekano-sensör 8,36,37 olduğunu göstermektedir. Bu, hücrelerden toplanan izole çekirdek üzerinde yapılan deneylerle kanıtlanmıştır; burada çekirdeklerin, doğrudan üzerlerine uygulanan mekanik kuvvete yanıt olarak sertliklerini adaptif olarak değiştirdiği ortaya çıkmıştır36. Birçok fizyolojik durumda, hem tümör hem de sağlıklı hücrelerdeki çekirdekler hücre dışı biyofiziksel sinyalleri algılar ve mekanik özelliklerini ve düzeneklerini değiştirir38,39,40. Örneğin, ekstravazasyon üzerine, tümör hücrelerinin nükleer sertliği azalır ve 24 saat38'in üzerinde yumuşaklığı korur. Kapalı interstisyel boşluktan göç sırasında, tümör hücrelerinin çekirdekleri sıklıkla yapısal bütünlüklerini kaybeder ve geri kazanır39. Bununla birlikte, çekirdeğin biyofiziksel sinyali algılama şekli bilinmemekle birlikte, Lamin Klima ve nükleoskeleton ve sitoiskelet (LINC) kompleksi 38,41'in bağlayıcısı gibi çeşitli nükleer zarf proteinleri ve protein ailelerinin dahil olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulayabilen yeni invaziv olmayan yöntemler, kuvvet iletiminin etkisini hücre-plazma zarından ve sitoiskeletten ayıracak ve nükleer mekano-algılamanın daha önce erişilemeyen moleküler mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacaktır.
Organel 42'yi manipüle etmek için optik cımbız kullanan ve hücrelere enjekte edilen mikroboncuklar43'ü kullanan araştırmalar, çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulamanın teknolojik yeteneğini gösterdi. Bununla birlikte, optik-cımbız tekniğinin birkaç sınırlaması vardır: (1) düşük verimli optik cımbız genellikle bir seferde yalnızca bir hücreyi veya mikroboncuğu manipüle eder; ve (2) nükleerin potansiyel fotohasarı ve sıcaklık artefakt-deformasyonu onlarca pN36 gerektirir ve karşılık gelen gerekli lazer gücü pN44,45 başına yaklaşık 10 mW'dir. Bu tür lazer yoğunluğu, hücrelerdeki fotohasarı tetiklemek ve deney46 sırasında hücre fonksiyonlarını bozmak için yeterlidir.
Canlı hücrelerdeki mikroboncuklar yoluyla uygulanan manyetik kuvvet, çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulama potansiyelini gösterir ve optik cımbızların sınırlamalarının üstesinden gelir. Mikroboncuklar sitoplazmaya verildikten sonra, manyetik bir alan aynı anda yüksek verimli bir şekilde birden fazla mikroboncuk üzerinde manyetik bir kuvvet uygulayabilir. Manyetik alan hücre fonksiyonlarını etkilemez47, ancak pN'den nN'ye kuvvet üretir, bu da nükleer deformasyonu indüklemek için yeterlidir 36,48,49. Bugüne kadar, manyetik mikroboncukların manipülasyonu hücre plazma zarı48, sitoplazma50 içinde, F-aktin51, çekirdek47 içinde ve izole çekirdek36 üzerinde uygulanmıştır. Bununla birlikte, mikroboncukların manyetik manipülasyonu, çekirdekteki mekanotransdüksiyonu incelemek için nükleer zarf üzerine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak için hiçbir zaman kullanılmamıştır.
Bu yazıda, manyetik mikroboncukları sitoplazmaya invaziv olmayan bir şekilde iletmek ve bu mikroboncukları çekirdeğe mekanik kuvvet uygulamak için kullanmak için basit bir teknik geliştirilmiştir (Şekil 1). Burada, yöntemi doğrulamak için mNeonGreen21-10/11 etiketli YAP'ı endojen olarak eksprese eden CRISPR / Cas9 mühendisliği insan normal B2B hücre hatları kullanılır. YAP, mekanoya duyarlı bir proteindir ve YAP'ın translokasyonu nükleer mekano-algılama14,28 ile düzenlenir. Endojen YAP'ı floresan protein (FP) mNeonGreen21-10/11 ile etiketlemek için CRISPR / Cas9 tarafından düzenlenmiş knock-in yaklaşımı seçildi. CRISPR düzenlemesinin eksik verimliliğe ve hedef dışı etkiye sahip olduğu bilinmesine rağmen, önceki yayınlardaki protokoller, doğru açık okuma çerçevesi ekleme52,53,54'ü seçmek için floresan sıralamayı entegre etti. Bu ek seçim katmanıyla, daha önce 52,53,54,55 oluşturulan 20'den fazla hücre satırında hedef dışı etiketleme olayı gözlenmedi. Bu bölünmüş bir floresan protein yapısıdır, ancak prensip olarak, herhangi bir ifade edilebilir floresan etiketi kullanılabilir olabilir. Bu etiketleme yaklaşımı transgen veya antikor yöntemlerinden daha üstündür. İlk olarak, transgen ekspresyonundan farklı olarak, etiketli protein, tek kopyalı gen dozajını korur ve doğal gen düzenleyici ağın fizyolojik bağlamında, protein konsantrasyonundaki, lokalizasyonundaki ve etkileşimindeki sapmaları sınırlayarak ifade eder. Bu çalışmada kullanılan etiketleme yöntemi, tam FP etiketlemeden daha yüksek bir büyüklük sırasına göre daha yüksek verim ve verimlilik elde etmektedir. Ayrıca, fiksasyon artefaktları ve yüksek kaliteli, yüksek özgüllüklü antikorların sınırlı mevcudiyeti nedeniyle immünofloresan ile ilişkili zorlukları da önler. İkincisi, bu makalede kullanılan yaklaşım, hücre fizyolojisinde minimum bozulma sağlar ve tüm endojen YAP'ların gerçek zamanlı olarak ortaya çıkarılmasını sağlar. Buna karşılık, diğer yaygın transgen yöntemleri sıklıkla YAP'ın aşırı ekspresyonuna yol açar. Ortaya çıkan yapay dağılım potansiyel olarak sitotoksisiteye neden olabilir ve hücrelerin mekano-algılamasını etkileyebilir56,57,58.
Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için bir protokol sunmaktadır. Özetle, burada sunulan protokoller, (1) çekirdeğin dışındayken manyetik mikroboncukların hücreye nasıl iletileceğini, (2) çekirdeğe manyetik kuvvet uygulamak için mikroboncukların nasıl manipüle edileceğini, (3) manipülasyon sırasında hücrelerin konfokal floresan görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve (4) kuvvet uygulama süreci boyunca YAP nükleer / sitoplazma (N / C) oranının nicel olarak nasıl analiz edileceğini göstermektedir. Sonuçlar, (1) endositoz yoluyla, manyetik mikroboncukların 7 saat içinde B2B hücrelerinin sitoplazmasına invaziv olmayan bir şekilde verilebileceğini göstermektedir (Şekil 2 ve Şekil 3); ve (2) doğrudan çekirdeğe uygulanan niceliksel manyetik kuvvet (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6) tek başına CRISPR/Cas9 mühendisliği B2B hücrelerinde YAP N/C oranının çeşitli değişikliklerini tetikleyebilir (Şekil 7 ve Şekil 8).

<table><tbody><tr><td>% 0,05 Tripsin</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 şişesi</td><td>Corning</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>7-&mikro; m ortalama çap karbonil demir mikro boncuklar</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>A1R konfokal sistem</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbonil Demir Tozu CM</td><td>BASF</td><td>30042253</td><td>Manyetik mikroboncuk</td></tr><tr><td>Kültür ortamı (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Bilgisayar</td><td>Windows 10 işletim sistemli</td><td>Dell</td><td></td></tr><tr><td>Çevre odası TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon</td><td></td><td></td>Laboratuvarı</tr><tr><td>Cam tabanlı petri kabı</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mıknatıs</td><td>K& J Manyetikler, Inc.</td><td>D99-N52</td><td></td></tr><tr><td>Tek renkli&nbsp; Kamera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements yazılım platformu</td><td>Nikon</td><td></td><td>yazılım platformu</td></tr><tr><td>Çekirdek maskesi ImageJ makro</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear maskesi</td></tr><tr><td>NucSpot Live 650 Biotium</td><td></td><td>#40082</td><td>Nükleer leke</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ taşıyıcı (CAD dosyaları)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td></tr></tbody></table>

Çekirdek mekanobiyolojisini incelemek için 3d manyetik kuvvet aktüatörü ve Çok fonksiyonlu floresan görüntülemeyi birleştirmek

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Mekanobiyolojide temel bir soru, canlı hücrelerin hücre fizyolojisi ve patolojisi bağlamında hücre dışı mekanik uyaranları nasıl algıladıklarıdır. Hücre dışı mekanik uyaranların hücresel mekano-hissinin membran reseptörleri, ilişkili protein kompleksi ve hücre iskeleti yoluyla olduğuna inanılmaktadır. Mekanobiyolojideki son gelişmeler, sitoplazmadaki hücre çekirdeğinin mekanik uyaranları aynı anda bağımsız olarak algılayabildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, hücre çekirdeğinin mekanik uyaranları nasıl algıladığına, dönüştürdüğüne ve tepki verdiğine dair mekanik bir anlayış, esas olarak geleneksel araçlarla çekirdek mekaniğine erişme ve ölçmedeki teknik zorluklar nedeniyle eksiktir. Bu yazıda, hücre çekirdeğini doğrudan deforme etmek için hassas ve invaziv olmayan 3D mekanik uyaranlar uygulayan yeni bir manyetik kuvvet aktüatörünün tasarımı, üretimi ve uygulanması açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mühendisliği yapılmış hücreleri kullanan bu çalışma, bu aracın, yüksek çözünürlüklü konfokal floresan görüntüleme ile birleştiğinde, çekirdek deformasyonunun bir fonksiyonu olarak tek hücrelerde mekanoya duyarlı evet ile ilişkili bir proteinin (YAP) gerçek zamanlı dinamiklerinin ortaya çıkarılmasını sağladığını göstermektedir. Bu basit yöntem, mekanobiyoloji topluluğundaki mevcut teknoloji boşluğunu kapatma ve çekirdek mekanotransdüksiyonu ile hücre fonksiyonu arasındaki ilişkide var olan bilgi boşluğuna cevap verme potansiyeline sahiptir.

Mıknatıs hareket ettirici bir cihazın tasarımı ve manyetik kuvvet uygulaması Manyetik mikroboncuklar aracılığıyla çekirdeğe kuvvet uygulamak için, mıknatısın uzamsal konumunu kontrol etmek için mıknatıs hareket ettirici bir cihaz tasarlanmış ve üretilmiştir. Mıknatıs hareket ettiren cihaz, bağlı mıknatısı döngü başına 1,59 mm'lik uzamsal çözünürlükte bağımsız olarak x, y ve z yönlerinde hareket ettirmek için merkezi bir çerçeve, üç düğme ve raylar içerir (Şekil 1A). Mıkna...

Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla hücre çekirdeğine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için yeni bir protokol sunmaktadır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Bu yöntemde, kuvvet doğrudan çekirdeğe uygulanır. Bu, kuvvet iletim etkisini hücre plazma zarından ve sitoiskeletten ayırır ve nükleer mekanosensingin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarır. Kuvvet, canlı hücreler içinde invaziv olmayan bir şekilde uygulanır.Optik cımbızla karşılaştırıldığında, manyetik alan ve manyetik kuvvet hücre fonksiyonlarını etkilemez ve daha yüksek verime sahiptir. Ortalama çapı yedi mikrometreye sahip 0.2 gram karbonil demir mikroboncuk tartarak hücreleri manyetik mikroboncuklarla kültürlemeye başlayın. Mikroboncukları bir pipet kullanarak bir mililitre RPMI 1640 kültür ortamında askıya alın.Daha sonra B2B hücreli Petri kabını biyogüvenlik kabinine alın ve Petri kabına mikroboncuk içeren ortamın 200 mikrolitresini hızla ekleyin. Petri kabını, mikroboncuklar hücreler tarafından içselleştirilene kadar bir inkübatöre koyun. Ters çevrilmiş mikroskobu açın ve konfokal floresan görüntülemeyi kullanarak, mikroboncuk, nükleer ve hücre sınırını görselleştirerek her altı saatte bir hücre hatlarının içselleştirilmesi için en uygun zamanı belirleyin.İçselleştirilmiş mikroboncuklar hücre sınırı içinde mevcut olacaktır. Küçük kuvvet uygulaması ve canlı hücre görüntüleme için, Elements yazılım uygulamasını açın. Yapılandırma manyetik bulgusunu tanımlamak için, tarama hızını iki saniyede bir kareye ayarlamak üzere ikiden fazla düğmeyi tıklatın.İğne deliği boyutunu 1,2 Havadar üniteye ayarlayın. Yalnızca FITC kanalını kontrol edin ve PMT HV'yi 70, ofset sıfır, lazer yoğunluğunu 10 olarak ayarlayın. Manyetik YAP çekirdeği yapılandırmasını tanımlamak için, dörtten fazla düğmeye tıklayarak tarama hızını dört saniyede bir kareye ayarlayın.Ardından, iğne deliği boyutunu 1.2 Havadar üniteye ayarlamak için 1.2 Havadar ünite düğmesine tıklayın ve FITC kanalını kontrol edin. PMT HV'yi 70, ofset sıfır, lazer yoğunluğunu 10 olarak ayarlayın. Çekirdek sınırını ve nükleer leke yoğunluğunu görüntülemek için, siyanin 5 kanalını kontrol edin.1.2 Havadar ünite düğmesine tıklamayın ve PMT HV'yi 70'e, ofset sıfıra ve lazer yoğunluğunu 10'a ayarlamayın. İğne deliği boyutu, üç boyutlu YES ile ilişkili protein görüntüleme için optimize edilecektir. Ardından, DIA'yı Elements aracılığıyla açın.Döndürme görünümünü açın, parlak bir alan kullanın ve hücrelerin net bir odak içi görüntüsünü elde etmek için nesnenin odağını ayarlayın. İçinde tek bir mikroboncuk bulunan, içinde birden fazla mikroboncuk bulunan ve içinde herhangi bir mikroboncuk bulunmayan bir hücre gibi üç koşulda uygun çoklu tek hücreleri bulmak için 10X hedefi kullanın. Ardından 40X hedefine geçin ve bu pozisyonu uygun pozisyon numarasıyla adlandırın.Elements'i açın, manyetik bul'a tıklayın, kilidi kaldırın, ardından sekmeleri tarayın, ardından seçilen hücrelerin Z yığını için alt ve üst sınırı ayarlamak üzere odak düzleminin Z konumunu ayarlamak için üst ve alt düğmeleri seçin. Tara'yı tekrar tıklatarak taramayı durdurun. Manyetik YAP çekirdek yapılandırmasına geçin ve dosya adını before_small_force.nd2 olarak ayarlayın.Kaydedilen Z yığını ile çalıştır düğmesine tıklayın. Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. spin görünümünü açın ve kayıt düğmesine tıklayın.Mıknatıs hareket ettirici cihazın düğmesini döndürerek mıknatısı Petri kabının tabanının 46 milimetre yukarısına getirin. Manyetik kuvvetin neden olduğu mikroboncuk yer değiştirmesini doğrulamak için videoyu kaydedin ve kontrol edin. Dosya adını after_small_force.nd2 olarak ayarlayarak tarama yordamını yineleyin.Ardından, sağ ışık yoluna geçin, DIA'yı açın ve kayıt düğmesine tıklamadan önce döndürme görünümünü açın. Mıknatıs hareket ettirici cihaz düğmesini Petri kabının altından 120 milimetreye kadar döndürün ve parlak alan görüntü dizisini veya videosunu kaydedin. Dosya adını before_large_force.nd2 olarak ayarlayarak tarama adımlarını yineleyin.Mikroboncuklar, FITC veya siyanin 5 kanalında lazer uyarımı altında floresan yayamazlar. Böylece, içselleştirilmiş mikroboncuklar, YES ile ilişkili protein ve çekirdeğin floresansının konfokal görüntülemesinde bulunan koyu oyukla tanımlanmıştır. Nükleer döngüsellik, kontrol hücreleri ile mikroboncuk içselleştirmeli hücreler arasında anlamlı bir fark göstermedi.Mikroboncukla birlikte kültürlenmiş ancak içselleştirme yapılmamış kontrol hücrelerinin YES ile ilişkili protein hücresi çekirdeği-sitoplazma oranı ve mikroboncuk içselleştirmeli hücreler de anlamlı bir fark göstermemiştir. Aktinin çekirdek deformasyonu ve depolimerizasyonu, sitoiskelet içeren hücrelerde mikroboncuklar tarafından uygulanan sıkıştırma kuvvetinden kaynaklanmıştır. Kantitatif AFM kuvvet yer değiştirme ilişkisi tarafından sağlanan kantitatif görüntüleme analizi kalibrasyon eğrisi.Bu ilişkiye dayanarak, boncukların uyguladığı kuvvet tahmin edildi. Çekirdek deformasyonu ve YES ile ilişkili protein translokasyonu, uygulama veya manyetik kuvvetin serbest bırakılması üzerine gözlendi. Yeşil kanaldaki YES ile ilişkili proteindeki yoğunluk değişiklikleri ve kırmızı kanaldaki çekirdek boyamasında hiçbir değişiklik olmaması, manyetik kuvvet kaynaklı nükleer deformasyonun YES ile ilişkili protein translokasyonu tarafından tetiklendiğini doğruladı.İki grup içinde YES ile ilişkili protein çekirdeği-sitoplazma oranının net değişiminin nicelleştirilmesi, sitoplazma içindeki mikroboncuklara uygulanan manyetik kuvvetin YES ile ilişkili protein translokasyonunu indüklediğini ve YES ile ilişkili protein çekirdeği-sitoplazma oranını değiştirdiğini doğruladı. Kuvvet ve görüntüleme uygulamadan önce, hücrelerin manyetik mikro boncukları içselleştirdiğinden ve boncukların hücre sınırı içinde olduğundan emin olun.

combining-3d-magnetic-force-actuator-multi-functional-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Biz, küresel ya da lokalize gerginlik uygulama yanıt tek, yaşayan yapışık hücrelere kaynaklı nükleer ve iskelet deformasyonları ölçmek için, iki bağımsız, mikroskop tabanlı araçlar sunuyoruz. Bu teknikler, nükleer sertliği belirlemek için (yani, deformabilitesi) ve, çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet iletim prob kullanılır.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Öğrenin, manyetik mikroboncuklar ve konfokal floresan görüntüleme kullanarak hücre çekirdeğine mekanik kuvvet uygulama yöntemini. Bu teknik, çekirdek mekanobiyolojisindeki moleküler mekanizmaları canlı hücrelerde invaziv olmayan şekilde ortaya çıkarır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

Daha fazla video keşfet