Hücre Kaçakçılığının Pozitron Emisyon Tomografisi Görüntülemesi: Bir Hücre Radyo-Etiketleme Yöntemi
27 Ekim 2023
Burada sunulan, kullanıma hazır bir radyoetiketleme synthonu, [89 Zr]Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89Zr]Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89 Zr]Zr-DBN) kullanılarak bir pozitron emisyon tomografisi (PET) radyoizotopu, 89Zr (t1/2 78.4 h) ile radyoetiket hücrelerine yönelik bir protokoldür. [89Zr] Zr-DBN ile radyo-etiketleme hücreleri, uygulamadan sonra 7 güne kadar PET ile vücutta uygulanan radyoaktif işaretli hücrelerin invaziv olmayan izlenmesi
Bu protokol, hücrelerin ve zirkonyum-89-DBN'nin radyoaktif etiketlenmesi ve PET ile non-invaziv takibi için aşamalı bir yöntemi açıklar. Bu teknik aynı zamanda, zirkonyum-89-DBN'nin hücre yüzey proteinlerinin birincil araçlarına kovalent konjugasyonu ile hücrelerin radyoaktif etiketlenmesi için güvenilir ve kararlı bir yöntem sağlar. Nörolojik hastalıklar ve çeşitli kanserler için hücre tedavileri ile çalışan doktorlar ve bilim adamları, bu protokolü, invaziv olmayan PET görüntüleme yoluyla hücre bazlı tedavilerin farmakokinetiğini anlamada etkili bulacaktır.
Ayrıntılı protokol, yeni kullanıcılara bu radyoetiketleme tekniğini öğrenmeleri ve benimsemeleri için rehberlik sağlar. Kritik adımlarda yer alan ek düğümler, yeni bir kullanıcı için sorunların giderilmesine yardımcı olacaktır. Başlamak için, yaklaşık 100 miligram hidroksamat reçinesi içeren bir kolon hazırlayın ve kolonunu sekiz mililitre saf susuz asetonitril ile yıkayarak ve ardından beş ila altı mililitre hava ile yıkayarak etkinleştirin.
Kolona iki mililitre 0.5 normal hidroklorik asit geçirin. Beş ila altı mililitre hava ek bir yıkamadan geçtikten sonra, hem zirkonyum-89 hem de doğal itriyum içeren çözeltiyi yavaşça hidroksimat reçinesine yükleyin. Bağlanmamış doğal itriyumun hidroksamat reçinesinden 20 mililitre iki normal hidroklorik asit, ardından 10 mililitre deiyonize su ile yıkanması.
Zirkonyumdan zirkonyum-89 hidrojen fosfat formunda kurtulmak için, kolona 0.5 mililitre 1.2 molar dipotasyum fosfat potasyum dihidrojen fosfat tamponu ekleyin ve kolon üzerinde 30 dakika bekletin. Zirkonyumu kolondan çıkarmak için 1.5 mililitre 1.2 molar tampon ekleyin. Daha sonra, tamponda formüle edilmiş yaklaşık 120 mikrolitre zirkonyum-89 hidrojen fosfat alın ve 7.528'lik bir pH elde etmek için çözeltiyi HEPES-KOH ve potasyum karbonat ile nötralize edin.
Yaklaşık 285 mikrolitre nötralize zirkonyum-89 hidrojen fosfata dört mikrolitre taze hazırlanmış beş milimolar DFO-Bn-NCS ekleyin. Ve çözeltiyi pipetleyerek karıştırın. Zirkonyumu itriyumdan izole ettikten sonra, kolona 0.5 mililitre bir molar oksalik asit ekleyin ve zirkonyumu zirkonyum-89 oksalat formunda elüte etmek için kolon üzerinde bir dakika bekletin.
Kolona 2.5 mililitre bir molar oksalik asit ekleyin. Zirkonyum-89 oksalatı zirkonyum-89 klorüre dönüştürmek için, anyon değişim kolonunu altı mililitre asetonitril ile yıkayın, ardından beş ila altı mililitre hava ile yıkayın. Ardından, sütunu 10 mililitre tuzlu su ile yıkayın ve ardından başka bir hava yıkayın.
Zirkonyum-89 oksalat içeren çözeltiyi hava ile tekrar yıkamadan önce aktif anyon değişim kolonuna yavaşça yükleyin. Ardından, bağlanmamış oksalat iyonunu çıkarmak için sütunu 50 mililitre deiyonize su ile yıkayın. Zirkonyumdan zirkonyum-89 klorür formunda kurtulmak için, kolona 0.1 mililitre normal bir hidroklorik asit ekleyin ve kolonda bir dakika bekletin.
Zirkonyumu kolondan 0.4 mililitre ilave bir normal hidroklorik asit ile çıkarın. Çıkarılan zirkonyum-89 klorürü, 10 ila 30 dakika boyunca sabit bir nitrojen gazı akışı altında 65 santigrat derecede bir ısıtma bloğuna yerleştirerek V şeklinde bir şişede kurutun ve ardından kurutulmuş zirkonyum-89 klorürü suda yeniden sulandırın. 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde 500 mikrolitre HEPES tamponlu HBSS'de yaklaşık 6 milyon hücre ile 500 mikrolitre hücre süspansiyonu hazırlayın ve formüle edilmiş zirkonyum-89-DBN'den yaklaşık 100 mikrolitre ekleyin.
Zirkonyum-89-DBN ve hücre süspansiyonunu, çözeltiyi bir mikro pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Hücreleri ve zirkonyum-89-DBN karışımını, hücre etiketlemesi için 30 ila 45 dakika boyunca 25 ila 37 santigrat derecede yaklaşık 550 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Yeni hazırlanmış radyoaktif TLC çözücü kullanarak hücre radyoaktif işaretleme reaksiyonu üzerinde radyoaktif TLC gerçekleştirin.
Ekranda gösterilen denklemi kullanarak Rf'deki radyoaktivite yüzdesini 0.01 ila 0.02'ye eşit olarak hesaplayın. Ayrı bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde, arka plan düzeltmesi için hücresiz bir kontrol olarak kullanmak için yaklaşık 100 mikrolitre formüle edilmiş zirkonyum-89-DBN'yi yaklaşık 500 mikrolitre HEPES tamponlu HBSS ile karıştırın. Ekranda gösterilen denklemi kullanarak Rf'deki radyoaktivite yüzdesini 0,01 ila 0,02'ye eşit olarak hesaplayın, ardından hesaplanan iki radyoaktivite yüzdesini çıkararak etkili hücre radyoetiketlemesini hesaplayın.
Radyo-etiketlemenin tamamlandığını onayladıktan sonra, radyo-etiketleme reaksiyonunun söndürülmesini gerçekleştirmek için 600 mikrolitre soğutulmuş hücreye uygun tam ortam ekleyin. Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 96G'de santrifüjleyin. Ve süpernatanı atın.
Peletlenmiş hücreleri, soğutulmuş ortamın 500 mikrolitresinde, ortamı bir mikro pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri 96G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, ekranda gösterilen denklemi kullanarak tüm yıkamalardan sonra nihai radyoetiketleme verimliliğini hesaplayın.
Radyoaktif işaretli hücrelerin kalitesinden emin olmak için, radyoaktif işaretli hücrelerin son süspansiyonunu görsel olarak inceleyin ve herhangi bir küme yoksa, radyoaktif etiketleme ve yıkama adımlarından sonraki bir saat içinde PBS'de hazırlanan% 0.4 tripan mavisi çözeltisi kullanarak bir tripan mavisi dışlama canlılık testi yapın. Zirkonyum-89 hidrojen fosfat ve zirkonyum-89 klorür kullanılarak zirkonyum-89 için DFO-Bn-NCS'nin şelasyon verimliliği, radyoaktif TLC ile ölçüldüğü gibi farklıdır. Yedi gün boyunca zirkonyum-89 ile radyoaktif işaretli çeşitli hücrelerin stabilitesi burada gösterilmektedir.
Zirkonyum-89 radyoaktivitesinin radyoaktif işaretli hücreler tarafından tutulmasının, incelenen tüm hücrelerde stabil olduğu ve etiketlemeden sonraki yedi gün boyunca ihmal edilebilir bir akış gözlendiği bulundu. Zirkonyum-89-DBN ile farklı hücre tiplerindeki hücre radyoaktif etiketleme verimlilikleri bu tabloda gösterilmektedir. Hücre radyo-etiketleme verimliliği, yıkamadan sonra radyoaktif işaretli hücre peletinde gözlenen düzeltilmemiş bir verim olarak %20 ila %50 arasında değişmektedir.
Bu protokolün en kritik adımı, şelasyon karışımına DFO-Bn-NCS eklenmesi ve radyoaktif işaretli hücrelerin kalite değerlendirmesidir. Bu tekniğin uygulanması, hücre bazlı tedavilerin farmakokinetiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Ayrıca, hücre tedavilerinin klirens profilini değiştirmek için herhangi bir klinik ihtiyaç hakkında sorular ortaya çıkaracaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücrelerin zirkonyum-89-DBN ile radyoişaretlenmesi ve PET ile invaziv olmayan izlenmesi için adım adım bir yöntem tanımlar. Bu teknik, uygulamadan sonraki 7 güne kadar vücutta uygulanan radyoişaretli hücrelerin izlenmesi için güvenilir bir yöntem sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Terapisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Hücrelerin radyoişaretlenmesi, in vivo izlenme ve görüntülemeyi sağlar.
- 89 Zr, PET görüntüleme için uygun olan 78.4 saatlik bir yarı ömre sahiptir.
- Bu yöntem, hücre bazlı tedavilerin farmakokinetiklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.
- Özellikle nörolojik hastalıklar ve kanserler için faydalıdır.
Çalışmanın Amacı
- Radyoişaretli hücrelerin invaziv olmayan izlenmesi için bir protokol sağlamak.
- Görüntüleme yoluyla hücre tedavilerinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
- Yeni kullanıcıların radyoişaretleme tekniklerini benimsemesine yardımcı olmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hidroksamat reçine kolonunun hazırlanması.
- Kolonun anhidrus asetonitril ile aktivasyonu.
- Zirkonyum-89-DBN'nin hücre yüzeyi proteinlerine kovalent bağlanması.
- Hücrelerin radyoişaretlenmesi için adım adım protokol.
Ana Sonuçlar
- Hücrelerin [89 Zr]Zr-DBN ile başarılı bir şekilde radyoişaretlenmesi.
- PET görüntüleme kullanarak hücrelerin invaziv olmayan izlenmesi.
- Protokol, yeni kullanıcılar için sorun giderme rehberliği sağlar.
- Radyoişaretleme yönteminin stabilitesi ve güvenilirliği gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Protokol, hücre tedavilerinde araştırmacılar için önemlidir.
- PET görüntüleme yoluyla farmakokinetiklerin çalışılmasını kolaylaştırır.
- Yeni kullanıcılar tekniği etkili bir şekilde öğrenebilir ve uygulayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Noninvasive PET imaging of radiolabeled cell therapies enables direct, quantitative tracking of cell trafficking and persistence in vivo, addressing a critical gap in pharmacokinetic and pharmacodynamic understanding. This capability supports predictive confidence in cell therapy development, informing risk-adjusted advancement and portfolio prioritization. The method's compatibility with diverse cell types positions it as a reusable platform for translational and preclinical R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fate and biodistribution in living systems.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying trafficking and retention profiles.
- Facilitates functional validation of engineered or lineage-guided cell products.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in cell therapy pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized radiolabeling protocols for reproducible cell tracking assays.
- Delivers quantitative PET readouts for comparative evaluation of cell preparations.
- Supports assay scalability and cross-study comparability through robust radiolabeling chemistry.
- Enables reliable assessment of cell viability and labeling efficiency post-radiolabeling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical cell trafficking data with translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through IND-enabling studies by supporting longitudinal cell tracking.
- Reduces biological uncertainty in preclinical models by enabling direct visualization of cell fate.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying in vivo persistence and clearance profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This radiolabeling and PET imaging workflow integrates from early discovery through preclinical validation, supporting lead identification and translational continuity for cell-based therapies.
- Discovery Biology: Quantitative PET imaging enables hypothesis testing of cell trafficking and engraftment.
- Screening: Standardized radiolabeling supports reproducible, quantitative cell tracking assays.
- Analytics: PET readouts provide direct, quantitative measurements of cell distribution and retention.
- Translational Research: Enables alignment of preclinical cell fate data with clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: The platform is adaptable to multiple cell types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell therapy development.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible radiolabeling workflows.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiochemistry, cell handling, and PET imaging analytics.
- Needs access to radiolabeling infrastructure and PET imaging facilities.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of cell types but may require optimization for specific products.
- Radiolabeling efficiency and cell viability must be validated for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Preparation of [89Zr]Zr‐p‐Isothiocyanatobenzyl‐Desferrioxamine ([89Zr]Zr‐DBN)
3:06
Obtaining 89Zr as [89Zr]ZrCl4
5:11
Radiolabeling of Cells
8:24
Results: 89Zr Chelation Efficiency with DFO‐Bn‐NCS, Cell Radiolabeling Efficiency and Stability of Zr‐89 Label on Radiolabeled Cells
9:29
Conclusion
![Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
