Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü
16 Eylül 2022
Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.
Bu, dolaşımdaki serbest DNA'ya dayanan aşağı akış sıvı biyopsi uygulamaları için kan örneklerinin işlenmesi ve depolanması için standart bir protokoldür. Bu, teknik birkaç yıldır kullanılmasına rağmen, yayınlanan ilk standart protokoldür. Çoğu çeviri veya bilimsel laboratuvarda bulunan standart ekipmanlarla takip etmek kolaydır.
Protokol tüm laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilebilir. Protokol, numuneleri toplama ve saklama şeklimizi standartlaştırmaya yardımcı olur, bu da sonuçta klinikte etki yaratacak ve hassasiyetin en önemli olduğu aynı veya benzer aşağı akış analizini gerçekleştiren farklı merkezler arasındaki değişkenliği azaltacaktır. Bu yöntem özellikle onkoloji araştırmalarında ve klinik uygulamalarda yararlıdır.
Bununla birlikte, sıvı biyopsisinin de kullanıldığı diğer kanser dışı hastalıklarda da uygulanabilir. Kan örneği santrifüj edildikten sonra, ne kadar plazma veya serumun çıkarılacağını bilmek zor olabilir, ancak bu özel yönergeleri takip etmek bu konuda yardımcı olacaktır. Protokolün geri kalanını laboratuvarda sınırlı deneyimle takip etmek çok kolaydır.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Jorge olacaktır. Başlamak için, oda sıcaklığında taze kan içeren tüpü, maksimum mola uygulanarak, 1600 kez g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın.
Serum süpernatantının üst fazı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin ve uygun olduğunda hemoliz varlığını kaydedin. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, serumu toplama tüplerine 250 mikrolitrelik alikotlar olarak aktarın.
Aliquots doğru etiketlenmelidir. Serumu hemen saklama kutusunda eksi 80 santigrat derecede dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin. Örneklerin gerekli dört saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın.
EDTA tüpünü oda sıcaklığında 1600 kez g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, maksimum mola uygulanır. Santrifüjlemeden sonra, plazma süpernatantı berrak ve sarımsı görünecektir. Numunenin hemoliz belirtileri gösterip göstermediğini kontrol edin ve plazmayı tek kullanımlık bir serolojik pipet kullanarak hücresel tabakayı rahatsız etmeden 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücre tabakasının üzerinde yaklaşık beş milimetrede küçük bir plazma kalıntısı hacmi bırakın. Hemoliz gözlenirse, daha fazla analiz için numuneyi atın. İlk santrifüjleme adımından taşınan artık sağlam kan hücrelerini çıkarmak için plazmayı ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünü santrifüj yapın.
Tüpün altındaki hücre peletini değil, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın ve tek kullanımlık bir serolojik pipet kullanarak bir ila dört mililitre polipropilen kriyojenik bios veya Eppendorfs'a bir ila dört mililitre plazma aktarın. Plazmanın kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için tüpün dibinde artık bir plazma hacmi bırakılmalıdır. Plazmayı hemen saklama kutusunda eksi 80 santigrat derecede dik olarak dondurun ve numune depolama süresini kaydedin.
Numunelerin doğru şekilde etiketlendiğini ve gerekli dört saatlik zaman dilimi içinde işlendiğini doğrulayın. Bir P1000 ve filtrelenmiş uç kullanarak hücresel tabakayı toplayın ve iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Hemen dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Aşağı akış uygulamaları için kullanılabilecek yüksek kaliteli cfDNA ekstraksiyonunun bir örneği burada gösterilirken, bu grafik görüntü yüksek düzeyde genomik kontaminasyona sahip uygun olmayan bir numunenin bir örneğini temsil etmektedir. Plazma veya serum fraksiyonu sarı renkte olmalıdır. Bu, bireysel örneğe bağlı olarak değişebilir.
Hemolizli örnekler atılmalıdır. Plazma fraksiyonunu çıkarırken herhangi bir hücre peletini çıkarmamaya dikkat edin. Bu protokol, immün tespit teknikleri kullanılarak serum ve plazma örneklerinde kodlanamayan RNA'ların veya proteinlerin tespiti gibi diğer nükleik asit bazlı ve protein uygulamaları için de kullanılabilir.
Bu, birçok laboratuvarda kullanılan çok standart bir tekniktir. Bu protokol, araştırmacıların analizimizi nasıl yaptığımızı standartlaştırmalarına yardımcı olur, çünkü bu, gelecekteki klinik uygulamalar için gerekli olan çok önemli bir husustur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, dolaşımdaki serbest DNA'ya odaklanan sıvı biyopsi uygulamaları için kan örneklerinin işlenmesi ve depolanması için standart bir protokol sunmaktadır. Protokol, izlenmesi kolay olacak şekilde tasarlanmıştır ve çoğu çeviri araştırma laboratuvarında uygulanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Onkoloji
- Çeviri araştırması
Arka Plan
- Sıvı biyopsi, onkoloji çeviri çalışmalarını dönüştürmüştür.
- Örnek toplama, kalite ve depolama klinik uygulama için kritiktir.
- Bu, bu teknik için yayınlanan ilk standart protokoldür.
- Yöntem birkaç yıldır kullanılmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Örneklerin toplama ve depolanmasını standartlaştırmak.
- Benzer analizler yapan farklı merkezler arasındaki değişkenliği azaltmak.
- Klinik uygulamalarda hassasiyeti artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kan örneklerinin işlenmesi.
- Dolaşımdaki serbest DNA için depolama protokolleri.
- Standart laboratuvar ekipmanlarının kullanımı.
- Tüm laboratuvar personeli tarafından erişilebilir protokol.
Ana Sonuçlar
- Standartlaştırılmış protokol, örnek işlemeyi iyileştirir.
- Sonraki analizlerdeki değişkenliği azaltır.
- Onkoloji araştırmalarında daha iyi klinik sonuçlara olanak tanır.
Sonuçlar
- Protokol, sıvı biyopsi uygulamalarının güvenilirliğini artırmak için kritiktir.
- Standartlaştırma, klinik uygulamaları olumlu yönde etkileyecektir.
- Onkoloji araştırmalarında hassasiyet ihtiyacının artmasına destek sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardized preanalytical protocols for liquid biopsy are critical for ensuring reproducible, high-quality circulating-free DNA (cfDNA) samples across translational and clinical research pipelines. This protocol directly addresses variability in sample handling, supporting predictive confidence and enabling robust downstream molecular analyses. Its adoption impacts early discovery, assay development, and translational continuity in oncology and other disease areas utilizing cfDNA.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent cfDNA sample quality for hypothesis-driven biomarker studies.
- Reduces preanalytical variability, supporting functional target validation.
- Facilitates reliable comparison of molecular signatures across cohorts.
Screening & Assay Development
- Provides standardized input material for assay optimization and validation.
- Supports reproducibility and quantitative output in cfDNA-based assays.
- Enables scalable sample processing for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample handling with requirements for translational biomarker studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of cfDNA markers.
- Reduces risk of sample-related artifacts in disease-relevant model systems.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions preanalytical sample handling as a foundational step from early discovery through lead identification and translational research. Its standardization supports robust data generation and cross-study comparability.
- Discovery Biology: Ensures cfDNA integrity for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, contamination-minimized inputs for downstream molecular analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with consistent sample quality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cross-team protocol for cfDNA sample processing in diverse R&D settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cfDNA studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cfDNA-driven programs.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory expertise and adherence to biosafety protocols.
- Needs standard centrifugation and cold storage infrastructure.
- Demands rigorous sample labeling and time-tracking for cross-team standardization.
- Adaptable to various nucleic acid and protein applications in plasma and serum.
- Sample quality is limited by hemolysis and processing time constraints as specified.
