Tümör Mikroçevresinin Mikro Ölçekli Proteomik Analizi için Endüstriyelleşmiş, Yapay Zeka Rehberliğinde Lazer Mikrodiseksiyonu

Bu protokol, doku segmentasyonu için AI odaklı görüntü analizini entegre eder. Histoloji ile lazer mikrodiseksiyonu ile seçici hasat ve bizi Patomiklerin gerçekliğine yaklaştırır. AI kullanarak doku yatırım getirisini önceden tanımlamak, doku slaytlarının ortam sıcaklığında bekleme süresini sınırlar, bu hasatları gerçekleştirmek için insan gücü çabasını azaltır ve operatör değişkenliğini azaltır.

Bu teknik, doku örneklerinden spesifik hücresel popülasyonların toplanmasını veya zenginleştirilmesini içeren herhangi bir hastalık veya patolojiye dayalı araştırmalara geniş ölçüde uygulanabilir. Bu yöntem, temel histopatoloji bilgisi ve LMD deneyimi olan kullanıcılar için basittir. Önemli olan, hücreler için temiz kalibratör kestiğinizden emin olmak ve sınıflandırıcıyı iyi eğitmektir.

Başlamak için, referans kalibrasyon referanslarını kesmeden önce kızağın tamamen kuru olduğundan emin olun. Lazer Mikrodiseksiyon yazılımını açın ve şekilleri içe aktar seçeneğinin altındaki varsayılan kalibrasyon noktası sld dosyasını açın. Slaytı, doku aşağı bakacak ve etiket tarafı operatöre daha yakın olacak şekilde yükleyin.

Lazer mikrodiseksiyon aşamasındaki slayt tutucuya, kesimden önce otomatik odaklama seçeneğini seçin. Lazer mikroskobu ve varsayılan kalibrasyon noktası sld dosyasını kullanarak, kalibrasyon referanslarını PEN membranına kesin. Sadece lazer mikrodiseksiyonla zenginleştirilmiş koleksiyonlar için görüntü analiz yazılımını açın.

Açık görüntüleri seçin ve açılır pencereden, slaydın taranmasıyla oluşturulan nokta svs görüntü dosyasını seçin. Ek açıklamalar sekmesine gidin, dokunun etrafına bir kutu çizmek için dikdörtgen detaylandırma aracını seçin ve kullanın. Kutu ek açıklamasını seçin ve resme sağ tıklayın.

Gelişmiş açılır menüyü seçin, ardından bölümleme seçeneğini tıklayın. Kutucuk boyutunu ve alanını sırasıyla 500 ile 40 arasında ayarlayın ve kutucukları oluşturmak için Tamam'ı seçin. Kutucukları oluşturmak için kullanılan çevre kutusu ek açıklamasını seçin ve silin.

Katman eylemleri açılır menüsünü seçin, ardından döşenmiş detaylandırmaları nokta detaylandırma dosyası olarak kaydetmek için dışa aktar'ı tıklayın. AI tarafından sınıflandırılan ek açıklama katmanlarını döşenmiş ek açıklamalar dosyasıyla aynı klasöre birleştirmek için geliştirilen Python dapa algoritmasının kaydedilmiş bir kopyasını yerleştirin. Döşenmiş ek açıklama dosyasının adını kopyalayın.

Boşta kalan tümleşik geliştirme ortamını kullanarak Python programını açın ve döşenmiş ek açıklama dosyasının adını programın altındaki alıntılar arasına yapıştırın. Çalıştır açılır menüsünü seçin ve ardından modülü çalıştır'a tıklayın. Tüm döşenmiş ek açıklamaların tek bir katman altında birleştirileceği birkaç dosyanın oluşturulmasını bekleyin.

Görüntü analizi yazılımını açın ve ek açıklamalar sekmesine gidin. Katman eylemleri açılır menüsünü seçin, ardından görüntüdeki tüm ek açıklamaları kaldırmak için Tüm katmanları sil'i tıklayın. Katman eylemleri açılır menüsünü seçin, ardından yerel ek açıklama dosyasını içe aktar'ı tıklayın.

Açılır pencerede, komut dosyası tarafından oluşturulan birleştirilmiş nokta ek açıklama dosyasını seçin. İçe aktarılan tüm kutucukların aynı ek açıklama katmanı altında olduğundan emin olun. Sınıflandırıcı sekmesinden, tümör, stroma ve boş cam slayt arka plan YG'lerinin temsili alanlarını vurgulamak için üreticinin talimatlarını izleyin.

Sınıflandırıcıyı çalıştırmadan önce, gelişmiş sınıflandırıcı seçenekleri'ni tıklatın, YG kutusunu veya ek açıklamalar sekmesindeki kutuları işaretleyerek istediğiniz ek açıklama katmanını seçin. Sınıflandırıcıyı çalıştırmak için sınıflandırıcı eylemleri menüsünden detaylandırma katmanı seçeneğini kullanın. Sınıflandırıcı analizi tamamlandıktan sonra, detaylandırmalar sekmesine gidin ve analizden oluşturulan detaylandırma katmanını seçin.

Katman eylemleri açılır menüsünü seçin, ardından görüntüdeki diğer tüm detaylandırma katmanlarını kaldırmak için Geçerli olan tüm katmanları sil'i tıklayın. Ardından, katman eylemleri açılır menüsünü seçin, ardından ek açıklamaları nokta detaylandırma dosyası olarak kaydetmek için dışa aktar'ı tıklayın. Oturum veya proje için bir klasör oluşturun ve nokta ek açıklama dosyasını bir alt klasörün içine kaydedin.

Slaytın benzersiz tanımlayıcısıyla etiketlenir. Ek açıklamalar sekmesine gidin, katman eylemleri açılır menüsünü seçin, sonra görüntüdeki tüm detaylandırmaları kaldırmak için Tüm katmanları sil'i tıklayın. Kalem aletini seçin ve her kalibrasyon referansından kısa bir çizgi çizin.

İşaretlerden çizgileri aşağıdaki sırayla çizin. Sol üst, sağ üst, sağ alt. Katman eylemleri açılır menüsünü seçin, ardından döşenmiş detaylandırmaları do detaylandırma dosyası olarak kaydetmek için dışa aktar'ı tıklayın.

Dosya adına alt çizgi kalibi ekleyin ve dosyayı döşenmiş şekillerin koordinatlarını içeren alt klasöre yerleştirin. Ana projenin adresini kopyalayın. Boşta kalan tümleşik geliştirme ortamını kullanarak XML alma oluşturma komut dosyası malliator'ını açın ve ardından proje klasörü adresini komut dosyasının altındaki tırnak işaretleri arasına yapıştırın.

Çalıştır açılır menüsünü seçin, ardından komut dosyasını yürütmek için modülü çalıştır'a tıklayın. İşaretli membran kızağını, doku aşağı bakacak şekilde ve etiket tarafı operatöre daha yakın olacak şekilde lazer mikroskop aşamasındaki slayt tutucuya yükleyin. Dosya açılır menüsünden şekilleri içe aktar'ı seçin.

Slayt için oluşturulan nokta XML, LMD içe aktarma dosyasını seçin. Dosyadan referans noktalarının yüklenmesini önlemek için açılır pencerede hayır'ı, kalibrasyon için önceden depolanmış referans noktalarını kullanmaktan kaçınmak için ikinci açılır pencerede hayır'ı seçin. Lazer mikro diseksiyon uygulamasından gelen talimatları izleyin ve kalibrasyon çarpı işaretini slayttaki üç kalibrasyon referansının her birine hizalayın.

Slayt görüntüsünün sol üst, sağ üst ve sağ alt kısımlarında görünen kalibrasyon referanslarını arayın. Görüntü analiz yazılımında ters lazer mikrodiseksiyonunun referans noktalarına karşılık gelecek şekilde mikroskop aşamasında kaydırılır. Konumlandırmak için 5x sübjektif lensi ve her kalibrasyon referansını hizalamak için 63x sübjektif lensi kullanma arasında geçiş yapın.

Referans noktalarını dosyaya kaydetmekten kaçınmak için açılır pencerede hayır'ı seçin ve slaytın eklendiğini onaylamak için ikinci açılır pencerede Tamam'ı seçin. 5x öznel lensi konumuna getirin ve gerçek büyütmeyi kullanmak için açılır pencerede evet'i seçin. İçe aktarılan şekiller göründüğünde, kamerayı dokuya odaklayın.

Şekil listesi penceresindeki tüm şekilleri vurgulayın ve seçin. Referans olarak görüş alanı içindeki bir veya iki ek açıklamayı kullanarak bunları yerine sürükleyin ve lazerle kesmek için dikey z eksenini hizalayın. Tüpleri PCT mikrotüpleri için tasarlanmış üniversal tüp tutucuya yükleyin.

İçe aktarılan şekilleri gözden geçirin ve toplama için uygun tüp konumuna atayın. Lazeri başlatmak için start cut (kesik kes) düğmesine basın. Numune tüpünü LMD dokularıyla boşaltın ve kapatın ve kuru buz koyun.

Termosiklet ve santrifüjlemeden sonra, LMD doku örneklerini topladı, mikrokapakları PCT mikrotüplerinden çıkardı ve attı. Tripsin ekleyin, 30 milimetre kare doku başına bir mikrogram oranı ekleyin. Ve mikro kapak aletini kullanarak mikro tüpe bir mikro havane yerleştirin.

Mikrotüpleri bir varil döngüsü kartuşuna aktarın ve kartuşun tamamını monte edin. Kartuşu namlu çevrimi basınç odasına yerleştirin ve kapağı sabitleyin. 50 saniye boyunca 45.000 PSI'da namlu çevrimi ve 60 döngü için 50 santigrat derecede 10 saniye boyunca atmosferik basınç.

LC-MS MS analizi için, otomatik numune alma şişelerini uygun konumlarda sıvı kromatografisi otomatik numune alma cihazına yükleyin. Otomatik örnekleyiciyi kapatın ve uygun bir gradyan ve kütle spektrometresi yöntemiyle tek tek kesirleri analiz edin. En değişken 100 proteini kullanarak denetimsiz hiyerarşik kümeleme.

Yüksek dereceli seröz over kanseri ve yumurtalık berrak hücreli karsinom histo tiplerinin lazer mikrodiseksiyonu ile zenginleştirilmiş ve tüm tümör örneklerinden ayrılmasıyla sonuçlandı. Buna karşılık, lazer mikrodiseksiyonu hem yüksek dereceli seröz over kanserinden hem de yumurtalık berrak hücreli karsinomundan stroma örneklerini zenginleştirdi. Birlikte kümelenmiş ve lazer mikrodiseksiyonundan bağımsız olarak zenginleştirilmiş tümör ve tüm tümör örnekleri.

5.971 kantifiye protein arasında, 215'i, yüksek dereceli seröz over kanseri ve yumurtalık berrak hücreli karsinom örneklerinden elde edilen tüm tümör koleksiyonları arasında önemli ölçüde değişmiştir. Hughes tarafından nicelleştirilen 76 imza proteininden 57'si bu veri kümesinde birlikte ölçüldü ve yüksek oranda korelasyonluydu Sınıflandırıcının en zorlu kısım olduğu eğitimi. Indica Lab yazılım talimatlarını takip etmek ve sınıflandırıcıyı rafine etmek en doğru sonuçları verdi.

Diğer her şey standartlaştırılmıştır. Bu AI güdümlü LMD iş akışı kullanılarak toplanan doku, burada açıklanan kütle spektrometrisi tabanlı proteomikler veya genomi, transkriptomik veya diğer omik analizler dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış analitik uygulamalarıyla uyumludur.