Name: Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Keşfedin CRISPR-Cas9 ile zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemeleri ve Long QT Sendromu modellemesi. Bu yöntem, genetik varyantların görsel tespiti ve fenotipik analizi için etkili bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri Proje hibesi (T.W.C.) ve Kanada Keşif hibeleri Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (T.W.C.) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+methods+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Genome editing methods in animal models.</a> Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+genome+editing+technology+in+animal+disease+modeling+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+data%3A+Zebrafish+as+a+model+for+cardiovascular+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease.</a> Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kegel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+using+zebrafish+to+identify+new+genes+involved+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Oligodendrocytes%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination.</a> Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>González-Rosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+cardiac+disease%3A+From+fortuitous+mutants+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine.</a> Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).</li>
<li>Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+editing+of+the+Zebrafish+genome+made+simple+and+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient.</a> Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).</li>
<li>Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+CRISPR%2FCas9-based+knock-in+approaches+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish.</a> Methods. 121-122, 77-85 (2017).</li>
<li>Armstrong, G. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+directed+knockin+of+point+mutations+in+the+zebrafish+tardbp+and+fus+genes+in+ALS+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).</li>
<li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+modification+by+a+long+ssDNA+template+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish.</a> BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).</li>
<li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+zebrafish+models+for+inherited+disorders+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).</li>
<li>Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+zebrafish+knock-in+reporter+lines+in+the+nefma+gene+by+Cas9-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination.</a> Genesis. 58 (1), 23340(2020).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).</li>
<li>Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+tagging+in+zebrafish+facilitated+by+insertion+into+non-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions.</a> Development. 148 (19), (2021).</li>
<li>Prykhozhij, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+knock-in+of+point+mutations+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Boel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+homology-directed+repair+by+ssODNs+in+zebrafish+induces+complex+mutational+patterns+resulting+from+genomic+integration+of+repair-template+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Tessadori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+CRISPR%2FCas9-based+nucleotide+editing+in+zebrafish+to+model+human+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+generating+somatic+point+mutations+with+germline+transmission+in+the+zebrafish+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).</li>
<li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels. 10 (2), 101-110 (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+3.+E.15%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+1%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+KCNH2+gene+mutations+of+type+2+long+QT+syndrome+in+larval+zebrafish+using+microscopy+and+electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography.</a> Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).</li>
<li>Dhillon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+embryonic+and+larval+ECG+measurement+in+zebrafish+for+quantifying+the+effect+of+QT+prolonging+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs.</a> PLoS One. 8 (4), 60552(2013).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+cardiac+conduction+phenotypes+in+developing+zebrafish+larvae%3A+Implications+to+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity.</a> Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).</li>
<li>Hurst, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+optimization+of+tools+for+embryonic+electrocardiograph+recording+for+heart+dysfunction+in+zebrafish%22">Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish</a>. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).</li>
<li>Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+express+an+orthologue+of+HERG+and+are+sensitive+toward+a+range+of+QT-prolonging+drugs+inducing+severe+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).</li>
<li>MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%3A+In+vivo+screening+in+the+zebrafish+to+overcome+complexity+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

CRISPR-Cas9 kullanarak hassas gen düzenlemelerinin mühendisliği, HDR mekanizmalarının düşük verimlilikleri ve verimli tespitleri nedeniyle zorlanmaktadır. Burada, zebra balığında pozitif düzenlemelerin doğrudan görsel olarak algılanmasıyla hassas düzenlemeler üreten CRISPR-Cas9 tabanlı iki sgRNA ekzon değiştirme yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu yaklaşımın etkinliği, zkcnh6a geninde kesin düzenlemeler üreterek gösterilmiştir. Bu yazıda, gen düzenlenmiş zebra balığı larvalarında kardiyak fonksiyonun, kalp atış hızı, ...

Hayvan modellerinde CRISPR tabanlı gen düzenleme stratejileri, genetik olarak kalıtsal hastalık, gelişim ve toksikolojinin tüm organizma düzeyindeincelenmesini sağlar 1,2,3. Zebra balığı, insanlara birçok fizyolojik açıdan murin veya insan kaynaklı hücre modellerinden daha yakın olan güçlü bir model sağlar4. Zebra balıklarında hem ileri5 hem de ters genetik tarama6 için kapsamlı bir dizi genetik araç ve strateji kullanılmıştır. Zebra balığındaki kapsamlı genetik haritalama ve ek açıklama, hedeflenen gen nakavtlarını (KO'lar) ve hassas vuruşları (KI'lar)7 tasarlamak için birincil teknik olarak gen düzenleme yaklaşımlarını kolaylaştırmıştır.
Buna rağmen, zebra balıklarında hassas KI düzenlemeleri oluşturmak, düşük verimlilik ve doğru algılamanın zorluğu ile sınırlıdır. Transkripsiyon faktörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler) KI'lar8 için başarıyla kullanılmış ve optimize edilmiş olmasına rağmen, CRISPR daha basit sgRNA hedeflemesi ile gelişmiş bir gen düzenleme stratejisi sağlar. Çok sayıda çalışma, zebra balığı 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20'de hassas KI'lar oluşturmak için CRISPR'yi kullanmıştır, ancak CRISPR aracılı homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla oluşturulan bu düzenlemeler düşük içsel başarı ile verimsiz olma eğilimindedir. birincil ekran olarak genotipleme gerektiren oranlar 9,10,14,21. Bu, zebra balıklarında verimli bir KI CRISPR sistemine ve hassas düzenlemeleri tespit etmek için güvenilir, yüksek verimli bir sisteme duyulan ihtiyacı göstermektedir.
Bu çalışmanın amacı, zebra balığı kalplerinde başarılı düzenlemelerin basit ve yüksek verimli tespiti ile hassas bir kardiyak gen KI oluşturmak için bir platform tanımlamaktı. TALEN yaklaşımı8'e dayanan bir CRISPR-Cas9 tabanlı iki sgRNA ekzon replasman yaklaşımı tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, iki sgRNA kılavuzu kullanılarak hedef dizinin eksizyonunu ve ilgilenilen KI'nın yanı sıra genetik olarak kodlanmış bir intronic muhabir genini içeren eksojen bir şablon dizisi ile değiştirilmesini içerir (Şekil 1). Genetik olarak kodlanmış bir floresan muhabirin hedef gen intronik dizisine entegrasyonu, pozitif düzenlemelerin etkili bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Daha sonra, zebra balığı larvalarında, bireyleri ani kardiyak ölüme yatkın kılan bir kardiyak elektriksel bozukluk olan kalıtsal LQTS ile ilişkili gen varyantlarının non-invaziv karakterizasyonu için kardiyak elektriksel fonksiyonu değerlendirmek için bir fenotipleme platformu tanımlanmıştır.
Bu yaklaşımlar, kalıtsal hastalıkları modellemek ve gen ekspresyon kalıplarının haritalanması ve gelişimsel düzenleme gibi biyolojik ve fizyolojik soruları ele almak için zebra balığı KI gen düzenlemelerine erişimi ve bunların kullanımını artıracaktır. Zebra balığı kalpleri, insan kardiyak elektrofizyolojik özelliklerine murin modellerinden daha iyi paralel olduğundan, kalp hastalığı modellemesiiçin genetik olarak izlenebilir bir sistem olarak özellikle çekici olabilirler 7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Altyapı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro Yönetici</td><td>Açık Kaynak (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>EKİPMANLAR</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu Plaka</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm Petri Kabı</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 Kamera</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000 İnkübatör</td><td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra Transkripsiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 Spektrofotometre</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjector</td><td>Harvard Aparatı</td> PowerPac Temel Güç Kaynağı <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Steroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geniş Mini Alt Hücre GT Elektroforez Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Zebra Balığı Muhafazası Sistem</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen Sentezi</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Dizileme</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta; Yetkili Hücreler</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR Tamponu</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Nükleotid Karışımı</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI Endonükleaz w/ tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI Endonükleaz w / tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 Plazmid (XL1 Mavi bakteriyel agar bıçağı)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI Endonükleaz, tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII Endonükleaz, tampon NEB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metilen mavisi</td><td>sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ile MLM3613 Plazmid (XL1 Mavi bakteriyel agar bıçağı)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Trikain)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 Plazmid (DH5 & alfa; bakteriyel agar bıçağı)</td> <td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonükleaz w / tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI Endonükleaz w / tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaz tampon</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraz</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Tampon</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Hidroklorür</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI Endonükleaz w / tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td>Bileşen Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavlama Tamponu (pH 7.5-8.0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 Ortamı (pH 7.2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 mM MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon Tamponu (pH 7.5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı kalplerinde crispr-cas9 aracılı hassas knock-in düzenlemeleri

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Hayvan modellerinde düzenli olarak kümelenmiş aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR), fizyolojik olayların incelenmesi için kesin genetik manipülasyon sağlar. Zebra balığı, tüm organ ve organizma düzeyinde kalıtsal hastalık, gelişim ve toksikoloji ile ilgili sayısız soruyu incelemek için etkili bir genetik model olarak kullanılmıştır. İyi açıklamalı ve haritalanmış zebra balığı genomu nedeniyle, gen düzenleme için çok sayıda araç geliştirilmiştir. Bununla birlikte, CRISPR kullanarak hassas knock-in düzenlemeleri üretmenin etkinliği ve tespit etme kolaylığı sınırlayıcı bir faktördür. Burada açıklanan, kardiyak repolarizasyondan sorumlu ve elektriksel bozukluk Uzun QT Sendromu (LQTS) ile ilişkili bir gendeki hassas düzenlemelerin basit tespiti ile CRISPR-Cas9 tabanlı bir knock-in yaklaşımıdır. Bu iki tek kılavuzlu RNA (sgRNA) yaklaşımı, hedef diziyi heyecanlandırır ve değiştirir ve genetik olarak kodlanmış bir muhabir genini birbirine bağlar. Bu yaklaşımın yararı, vahşi tip ve gen düzenlenmiş zebra balığı larvalarında kardiyak elektriksel fonksiyonun invaziv olmayan fenotipik ölçümlerini tanımlayarak gösterilmiştir. Bu yaklaşım, bütün bir organizmada hastalıkla ilişkili varyantların verimli bir şekilde çalışılmasını sağlar. Ayrıca, bu strateji, muhabir genleri, ortologlar veya gen editörleri gibi tercih edilen eksojen dizilerin eklenmesi için olanaklar sunar.

Bu iki sgRNA ekzon replasmanı CRISPR yaklaşımının başarılı kullanımı, zebra balığındaki zkcnh6a geninde LQTS ile ilişkili varyant R56Q'yu tasarlamak için hassas bir düzenlemenin tanıtılması ve basit bir şekilde tespit edilmesiyle vurgulanmaktadır. Şekil 6 , yukarıda tarif edildiği gibi CRISPR bileşenleri ile tek hücreli embriyo aşamasında enjekte edilen temsili bir 3 dpf larvasını göstermektedir. Şekil 6A, YFP mVenus muhabirinin göz merceğindeki gen eks...

Bu protokol, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemelerini kolaylaştırmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Uzun QT Sendromu ile ilişkili bir gen varyantını modellemek için bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için bir fenotipleme boru hattı sunulmuştur.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Protokolümüz, CRISPR düzenlemelerinin hem hassas entegrasyonu hem de basit görsel tespiti için bir boru hattı ve ayrıca düzenleme sonrası fenotiplemenin bir örneğini sağlar. Bu yaklaşımın temel avantajı, başarılı düzenlemelerin verimli ve basitleştirilmiş bir şekilde tanımlanmasını sağlayan CRISPR düzenleme algılamasının kolaylığıdır. Bu yaklaşım, zebra balıklarında hastalıkla ilişkili varyantların basit bir şekilde üretilmesini ve karakterize edilmesini sağlar.Burada uzun QT sendromunu inceliyoruz. Farmasötik tedavilerle ilgili takip çalışmaları daha sonra araştırılabilir. İlgilenilen gen için zebra balığı ortologunu tanımlayarak hedef bölge dizisini dışlamak için iki sgRNA kılavuzu tasarlayarak başlayın.Şablonu oluşturmak için kullanılan iki kilobaz kanat dizisi de dahil olmak üzere, hedef bölgeyi ilgilenilen gen dizisi içinde bulmak için Ensembl'i kullanın. CRISPOR gibi bir tasarım yazılımı aracı kullanın ve Danio rerio türlerini ve Cas enzimini seçin. İki sgRNA yaklaşımı için, hedef ekzondan önce bir sgRNA ve hemen aşağı akış intronunda ikinci bir sgRNA seçin.Seçilen sgRNA'ların yüksek özgüllüğe ve düşük tahmin edilen hedef dışı bağlanmaya sahip olduğundan emin olun. Minimum hedef dışı bağlamaya sahip kılavuzları belirlemek için CRISPOR sıralamalarını kullanın. Şimdi PCR tabanlı Sanger dizileme genotiplemesi için en olası potansiyel hedef dışı bölgeleri belirleyin.İki sgRNA'yı seçtikten sonra, her biri için ters tamamlayıcıyı, mutasyondan önce gelen iki tamamlayıcı oligoyu ve mutasyonun aşağı yönünde iki tamamlayıcı oligoyu elde edin. Kılavuzu tercih edilen plazmid'e dahil etmek için her oligoya uyumlu kısıtlama bölgeleri ekleyin. Seçilen kılavuz dizilerinin DR274 plazmidine entegrasyonu için, beş asal BSA1 kısıtlama bölgesini kullanarak bir çıkıntı oluşturun ve kılavuzların beş ana ucundaki BSA1 tanıma bölgelerini tasarlayın.Daha sonra, PKHR5 plazmidinde bulunan M venöz YFP muhabir genini kuşatacak iki dizi parçası seçerek zebra balığında HDR için eksojen şablonu tasarlayın. Şablonu M venöz YFP muhabir geninin her iki tarafına eklemek için iki bölüme ayırın. Kodlama sırasının kesilmesini önlemek için bölünmüş sitenin bir intron içinde olduğundan emin olun.PKHR5 plazmidine klonlamayı kolaylaştırmak için makalede belirtilen tüm gerekli modifikasyonları dahil edin. Embriyoları döllenmeden yaklaşık 40 dakika sonra bir hücre aşamasında enjekte edin. Üç günlük döllenmeden sonra, zebra balığı larvalarını, kendi kendini düzeltme reflekslerini kaybedene kadar% 0.3 MS222 içeren 25 milimetrelik bir Petri kabına aktararak anestezi yapın.Anestezi uygulandıktan sonra, larvayı 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. GFP veya YFP'yi tespit edebilen bir mikroskop kullanarak, larvaların gözlerinde muhabir gen floresansını tarar. Larvaların görüntülerini yakaladıktan sonra, muhabir gen ifadesinin varlığını veya yokluğunu belgeleyin.Doğru ve kesin HDR gen düzenlemesini doğrulamak için, daha önce gösterildiği gibi larvaları döllenmeden üç gün sonra anestezi yaparak ve hotshot yöntemini kullanarak genomik DNA'yı kuyruk klipsinden izole ederek genotipleme yapın. Eksize edilmiş kuyruk klipsi 15 mikrolitre 25 milimolar sodyum hidroksite ekleyin ve 20 dakika boyunca 95 santigrat derece inkübe edin, ardından 1.5 mikrolitre tris hidroklorik asit ile nötralize edin. 30 saniye boyunca 13.800 kez G'de santrifüj yapın ve ekstrakte edilen genomik DNA'yı içeren süpernatantı tutun.Larvaları E3 ortamında kurtarın ve daha fazla çalışma yapılması gerekiyorsa konut sistemine geri gönderin. Ekstrakte edilen genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak, hedef içi ve potansiyel hedef dışı bölgelerin PCR tabanlı Sanger dizilimini gerçekleştirin. Hedef üzerindeki primer tasarımın mutasyon bölgesini ve en yakın sgRNA bağlanma bölgesini yakaladığından emin olun.İlgilenilen genle entegrasyonu doğrulamak için yerleştirilen homoloji kolundan ve hedef genden geçişi tespit etmek için ayrı bir dizileme astarı tasarlayın. Hedef dışı ilk üç potansiyel alanı sıralamak için astarlar tasarlayın. Her zebra balığı için tanımlanabilir genotipleme, kalp atış hızı, perikardiyal boyutlar, EKG fenotipleme ve muhabir gen verilerini derleyin.YFP M venöz muhabir gen ekspresyonu adalarda gözlendi ve başarılı şablon entegrasyonunun olumlu bir muhabiri olarak hareket etti. Muhabir gen pozitif balıkların, R26Q varyantını ZKCNH6A'ya tanıtan kesin düzenleme G56A'ya sahip oldukları bulundu. Perikardiyal boyutların göz bölgesinin bir oranı olarak ölçümü burada gösterilmiştir.Zebra balıklarında kardiyak repolarizasyon bozuklukları ile ilişkili perikardiyal ödem artışı ile birlikte bradikardi eğilimi R56Q geni düzenlenmiş larvalarda gözlenmiştir. Döllenmeden üç gün sonra zebra balığı larva kalbinden EKG kaydı burada gösterilmiştir. Bu yaklaşımın en önemli yönü, CRISPR prosedürlerinde sıklıkla olduğu gibi kılavuz tasarımıdır.Başarılı CRISPR düzenlemeleri için etkili kılavuzlar gereklidir. Daha fazla hassasiyet veya diğer işlevlere izin veren alternatif CRISPR yöntemleri takip edilebilir. Ek olarak, in vivo indüklenebilir bir düzenleme sistemi sağlayan bir asal düzenleme kompleksi gibi büyük genler eklenebilir.

crispr-cas9-mediated-precise-knock-in-edits-in-zebrafish-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA'ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Keşfedin CRISPR-Cas9 ile zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemeleri ve Long QT Sendromu modellemesi. Bu yöntem, genetik varyantların görsel tespiti ve fenotipik analizi için etkili bir protokol sunar.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Daha fazla video keşfet