Name: Retina Dokusunda İmmün Boyalı Kaspaz-9un Miktarının Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Öğrenin, retina dokusunda immünohistokimya ile kaspaz-9 ekspresyonunu belirleme ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, apoptoz ve hücre biyolojisi araştırmalarında terapötik hedeflerin tanımlanmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (NSF-GRFP) hibe DGE - 1644869 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS), ödül numarası F99NS124180 NIH NINDS Çeşitlilik İhtisas F99 (CKCO'ya), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) 5T32EY013933 (AMP'ye), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (RO1 NS081333, R03 NS099920'den CMT'ye) ve Savunma Bakanlığı Ordu/Hava Kuvvetleri (DURIP'ten CMT'ye).

Bu protokol, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için yaptığı açıklamayı takip eder. Kemirgen deneyleri, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve izlenmiştir.
1. Retina dokusunun hazırlanması ve kriyoseksiyon
<ol><li>İntraperitoneal anestezi (ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg)) uygulayarak hayvanları ötenazi yapın ve RVO'ya maruz kalan fareleri (ayrıntılar için bkz.8 ) peristaltik bir pompa kullanarak% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin. NOT: Ötanizasyon ve perfüzyona geçmeden önce anestezi derinliğini doğrulamak için hayvanı parmağınızla sıkıştırın. Perfüzyon ile ilgili detaylar16 maddede bulunabilir.</li>
	<li>Forseps kullanarak dikkatli bir enükleasyon ile gözleri toplayın ve dünyayı 1 mL% 4 PFA'ya koyun. Gözleri gece boyunca 4 ° C'de bırakın. Gözleri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın, 1 mL 1x PBS ekleyin ve çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
	<li>Gözleri, sakarozun emilimini gösteren tüpün dibine yerleşene kadar 3 gün boyunca% 30 sakarozun 1 mL'sine batırın.</li>
	<li>Göz yuvarlak bir görünüme (yaklaşık 50 μL) sahip olana kadar gözleri 30 G'lık bir şırınga kullanarak optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile doldurun.</li>
	<li>Gözler kapatılana kadar gözleri optimum kesme sıcaklığı bileşiğine sahip bir kriyomolda gömün ve kriyoskopiye hazır olana kadar -80 ° C'de dondurun.</li>
	<li>Bölüm, gözleri 20 μm'de bir kriyostat kullanarak cam slaytlara gömdü.<ol><li>Optimum kesme sıcaklığı bileşik bloğunu kriyomolddan çıkarın.</li>
		<li>Optimum kesme sıcaklığı bileşiği ekleyerek ve bloğu mandren üzerine yerleştirerek kriyostat mandren üzerine yerleştirin. Donana kadar kriyostatın içinde bırakın.</li>
		<li>Retina dokusu görülene kadar bloğu 20 μm'de kesmeye devam edin. NOT: Bu, 30x büyütmede (3x objektif, 10x göz merceği) bir ışık mikroskobu ile doğrulanabilir. Dokular OCT ortamından renk ve şekil ile ayırt edilebilir.</li>
		<li>Retina dokusunu mikroskop slaytlarında slayt başına dört bölümden oluşan bir dizi halinde toplayın. NOT: Retina kesitlerinin yerleştirilmesi önerisi için Şekil 1A'ya bakınız.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytları, tedaviyi ve genotipi kimliksizleştiren bir kimlikle etiketleyin.</li>
	<li>Kızakları lekelenene kadar -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. İmmünohistokimya
NOT: Hücre morfolojisini korumak için immünohistokimya için sabit kriyokorunmuş doku kullanın. İn vivo7 elde edilen optik koherens tomografi (OCT) görüntüleri düzeyinde olan bölümleri seçin. Kriyostattan toplanan ilk iki slayt serisini veya retina dokusuna 150 μm'den kesitleri kullanın.
<ol><li>Slaytları karanlık ve nemli bir slayt odasına yerleştirin.</li>
	<li>Geçirgenlik ve blokaj: OCT'yi çıkarmak ve daha sonra atmak için retina kesitlerini 300 μL 1x PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca% 0.1 Triton X-100 ile 300 μL 1x PBS ekleyerek dokuyu geçirgenleştirin ve daha sonra atın.</li>
	<li>300 μL bloke edici tampon (% 10 Normal Keçi Serumu (NGS),% 1 Sığır Serumu Albümini (BSA) 1x PBS'de, filtrelenmiş) ekleyerek dokuyu bloke edin ve gece boyunca 4 ° C'de bırakın.</li>
	<li>Primer antikorlar: Bloke edici tampondaki primer antikorları seyreltin. Kullanılan birincil antikorlar arasında 1:800'de anti-cl-kaspaz-9, 1:50'de anti-CD31 ve 1:150'de anti-kaspaz-7-488 (doğrudan etiketli antikor) bulunur. NOT: Birincil antikorların uygun şekilde seyreltilmesi için üreticinin tavsiyesine uyun.<ol><li>Bloke edici tamponu kesitlerden dökün ve retinal slaytlara 100 μL birincil antikor kokteyli uygulayın.</li>
		<li>Enine kesitleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bölümleri 300 μL 1x PBS ile 5 dakika boyunca dört kez yıkayın. NOT: Doku kesitleri çok kırılgansa, retina bölümlerinin yer değiştirmesini önlemek için slaytın köşesine bir doku uygulanarak kılcal etki kullanılarak yıkamalar çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Aynı konakçı türde yetiştirilen primer antikorların çapraz etiketlenmesini önlemek için, doğrudan etiketlenmiş antikorları uygulamadan önce boyamayı ikincil antikorlarla tamamlayın.</li>
	<li>İkincil antikorlar: İkincil antikorları bloke edici tamponda% 0.1'lik bir konsantrasyonda seyreltin. Örneğin, tavşanda yetiştirilen bir antikor olan anti-cl-caspaz-9'u tespit etmek için keçi-anti-tavşan-568 ikincil kullanın.<ol><li>Sekonder antikor kokteylinin 200 μL'sini retinalara uygulayın.</li>
		<li>RT'de dokuyu 2 saat boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Bölümleri 300 μL 1x PBS ile 5 dakika boyunca dört kez yıkayın.</li>
		<li>Çekirdekleri% 0.02'lik bir seyreltmede 300 μL DAPI ile 5 dakika boyunca sabitleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>300 μL 1x PBS ile 5 dakika boyunca bir kez yıkayın.</li>
	<li>Floresan sinyalini koruyan 500 μL floromount-G ortamı kullanarak retinal bölümlere bir kapak kayması yerleştirin ve kapak kaymasını dikkatlice slaytın üstüne yerleştirerek kabarcıkları önleyin.</li>
</ol>3. Konfokal görüntüleme
<ol><li>Konfokal mikroskopi ile lekeli kesitlerin görüntülerini elde edin.<ol><li>Konfokal mikroskobu açın.</li>
		<li>Slaytı sahne alanına yerleştirin.</li>
		<li>Retina bölümünü net bir şekilde görmek için odağı ayarlayın. NOT: Bölüm başına en az dört görüntü ve retina başına dört bölüm görüntü alın. Önerilen görüntüleme alanları için Retinal görüntüleme şemasına bakın (Şekil 1B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>20x veya 40x hedefi kullanarak, Z-yığını edinimine sahip konfokal bir mikroskop kullanarak görüntü kaspazı, vasküler ve nükleer boyama. NOT: Görüntüleme parametreleri ve yazılım kurulumu, bir deneydeki tüm görüntüleme için sabit olmalıdır. 20x hedefi, nükleer boyama ile iyi tanımlanmış retina tabakalarına genel bir bakış sağlar. 40x hedefi daha fazla hücresel ayrıntı sağlar.<ol><li>Alma ayarlarını tıklayarak kanal başına uygun pozlama ve lazer yoğunluğu sürelerini ayarlayın.</li>
		<li>Z serisine tıklayarak tüm bölümü görselleştirmek için Z yığınını ayarlayın ve dokunun derinliğini kapsayacak şekilde parametreleri yukarı ve aşağı ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kriyoseksiyon sırasında atanan maskeli kimliği takip eden görüntüleri kaydedin.</li>
</ol>4. Kaspaz seviyelerinin ölçülmesi
<ol><li>405, 470, 555 ve 640 kanallı görüntü dosyalarını FIJI'nin konsoluna sürükleyin.</li>
	<li>Image (Görüntüyü > Renk > Kanalları Birleştir) seçeneğini tıklatın.</li>
	<li>Dosyalara renkleri aşağıdaki gibi atayın: kırmızıdan 555'e, yeşilden 470'e, griden 405'e, camgöbeği 640'a.</li>
	<li>Image > Stack > Z Project'i tıklatarak Z-yığınını sıkıştırın.</li>
	<li>Projeksiyon Türü: Maksimum Yoğunluk'a tıklayın.</li>
	<li>Image > Color Channels Tool (Renkli Kanallar Aracı) seçeneğini tıklatarak Channels Interface'i açın.</li>
	<li>Parlaklık ve Kontrast arayüzünü açın.</li>
	<li>Kanal başına parametre seçin.<ol><li>Kanallar'a gidin ve bir kanal seçin.</li>
		<li>İmleci kaspaz ifade edilen hücrenin üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin.</li>
		<li>İmleci arka planın üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Test parametreleri<ol><li>Parlaklık ve Kontrast arayüzüne gidin.</li>
		<li>Seç'i tıklayın.</li>
		<li>Görüntülenen minimum değeri takın (kaspaz ifade edilen hücrenin açıklamalı piksel değeri).</li>
		<li>Görüntülenen maksimum değeri (arka planın açıklamalı piksel değeri) takın.</li>
		<li>Tamam'ı tıklatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm kanallar için 4.8-4.9 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Kör dokudan rastgele görüntüler seçerek parametreleri test edin. NOT: Parlaklık ve kontrast parametrelerini yalnızca arka plan değeri diğer görüntüler için yeterli değilse düzenleyin.</li>
	<li>Parametreler ayarlandıktan sonra, görüntü dosyalarını açın ve Z-yığınını sıkıştırın.</li>
	<li>Kaspaz kanalı ve izolektin, vasküler belirteç kanalı için parlaklık ve kontrast parametrelerini ekleyin.</li>
	<li>Pozitif alanların okunması olarak vasküler belirtecin kaspaz ekspresyonu ile kolokalizasyonunu kullanarak vasküler pozitif alanların sayısını ölçmek için nokta aracını kullanın.</li>
	<li>Adım 4.14'ü tekrarlayın, ancak Hoechst'i nöronal pozitif alanların belirteci olarak kullanın.</li>
	<li>Resim başına bir e-tablodaki değerlere açıklama ekleyin.</li>
	<li>Değerlerin bölüme göre ortalaması.</li>
	<li>Bölüm değerlerinin ortalaması - bu göz başına okuma olacaktır.</li>
</ol>5. Endotel hücre kaspazı-9'un alaka düzeyinin genetik olarak doğrulanması
<ol><li>RVO7'ye maruz kalan Casp9FL / FL-VECad-CreERT2 farelerinden elde edilen retinaları kullanın.</li>
	<li>Yukarıda bölüm 2'de açıklandığı gibi kaspaz-9 (silinmiş kaspaz), kaspaz-7 (aşağı akış efektörü kaspaz), vasküler belirteçler ve DAPI için retinaları immünoboyar.</li>
	<li>Yukarıda bölüm 3 ve 4'te açıklandığı gibi görüntü ve nicelik.</li>
</ol>6. RVO'da kaspaz-9'un hedeflenmesi
<ol><li>RVO'ya tabi tutulan farelerden gözler elde edin, ardından kaspaz-9 inhibitörü Pen1-XBir3'ün7'de olduğu gibi topikal olarak gözlere uygulanması.</li>
	<li>Yukarıda bölüm 2'de açıklandığı gibi kaspaz-7 (aşağı akış efektör kaspaz), vasküler belirteçler ve DAPI için retinaları immünoboyar.</li>
	<li>Yukarıda bölüm 3 ve 4'te açıklandığı gibi görüntü ve nicelik.</li>
</ol>

<ol><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
<li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamirez%2C+MLG+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22">Seminars in Cell & Developmental Biology</a>. 82, Academic Press. 79-85 (2018).</li>
<li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+therapeutic+targets+in+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li>
<li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9%3A+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728(2021).</li>
<li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li>
<li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system%3A+implications+for+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980(2021).</li>
<li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li>
<li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137(2015).</li>
<li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li>
<li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+the+balance%3A+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar aşağıdaki rakip çıkarları beyan ederler: C.M.T. aşağıdaki patent başvurularına sahiptir US20200164026, US20190142915 ve US20150165061. C.M.T. ve S.S.'nin ABD 20140024597 patent başvurusu var. C.M.T., A.M.P. ve M.I.A.'nın US2020058683 patent başvurusu vardır. C.M.T. ve Y.Y.J.'nin WO2018013519 patent başvurusu vardır. M.I.A ve C.M.T, New York Şehrindeki Columbia Üniversitesi Mütevelli Heyeti tarafından yapılan WO/2020/223212 patent başvurusunda mucit olarak listelenmiştir. Geri kalan yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Kaspazlar, hücre ölümü ve inflamasyondaki rolleri için en iyi şekilde çalışılan çok üyeli bir proteaz ailesidir; Bununla birlikte, daha yakın zamanlarda, bazı aile üyeleri için çeşitli ölüm dışı işlevler ortaya çıkarılmıştır 4,5. Kaspaz fonksiyonu hakkındaki anlayışımızın çoğu, hücre kültüründeki çalışmalardan ve insan hastalığından elde edilen çıkarımsal verilerden kaynaklanmaktadır. Hastalıkta kaspazların anormal indüksiyonu, aktivasyonu veya inaktivasyonu oldu...

Kaspazlar, hastalık 1,2'de gelişimsel hücre ölümünü, immün yanıtları ve anormal hücre ölümünü düzenleyen bir proteaz ailesidir. Kaspaz ailesinin üyelerinin çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda indüklendiği iyi bilinmekle birlikte, hangi kaspazın hastalık patolojisini yönlendirdiğini anlamak daha zordur3. Bu tür çalışmalar, bireysel kaspaz ailesi üyelerinin işlevini tanımlamak, karakterize etmek ve doğrulamak için araçlar gerektirir. İlgili bireysel kaspazların ayrıştırılması hem mekanik hem de terapötik açıdan önemlidir, çünkü literatürde kaspazların farklı rollerine dair kanıtlar sağlayan çok sayıda çalışma vardır 4,5. Bu nedenle, amaç terapötik bir fayda için bir hastalıkta bir kaspazı hedeflemekse, ilgili aile üyelerinin spesifik olarak hedeflenmesi kritik öneme sahiptir. Dokudaki kaspaz düzeylerini saptamak için kullanılan geleneksel teknikler arasında batı lekelenmesi ve enzimatik ve florometrik yaklaşımlaryer almaktadır 3,6. Bununla birlikte, bu önlemlerin hiçbiri kaspaz seviyelerinin hücreye özgü tespitine izin vermez ve bazı senaryolarda, parçalanmış kaspazlar genellikle geleneksel protein analizi önlemleri ile tespit edilemez. Kaspazların aynı dokuda farklı apoptotik ve apoptotik olmayan roller oynayabileceği bilinmektedir7, bu nedenle gelişimsel ve hastalık yolaklarının doğru anlaşılması için hücreye özgü kaspaz düzeylerinin dikkatli bir şekilde karakterize edilmesi gerekmektedir.
Bu çalışmada nörovasküler hipoksi-iskemi - retinal ven tıkanıklığı (RVO)7,8 modelinde kaspaz aktivasyonu ve fonksiyonu gösterilmiştir. Retina gibi karmaşık bir dokuda, glial hücreler, nöronlar ve vaskülatür7 dahil olmak üzere RVO'da indüklenen hipoksi-iskemiden etkilenebilecek birden fazla hücre tipi vardır. Yetişkin fare retinasında, immünohistokimya (IHC)7 ile ölçüldüğü gibi, sağlıklı dokuda belirgin olan çok az kaspaz ekspresyonu vardır, ancak gelişim9 sırasında veya retina hastalığı10,11 modellerinde durum böyle değildir. IHC, biyomedikal araştırmalarda iyi kurulmuş ve hastalık ve patolojik hedeflerin doğrulanmasına, mekansal lokalizasyon yoluyla yeni rollerin tanımlanmasına ve proteinlerin nicelleştirilmesine izin veren bir tekniktir. Parçalanmış kaspaz ürünlerinin batı lekesi veya florometrik analiz ile tespit edilemediği durumlarda, farklı kaspazların spesifik hücre lokalizasyonu veya lokalizasyon yoluyla kaspaz sinyal yollarının sorgulanması durumunda, IHC kullanılmalıdır.
RVO'da fonksiyonel olarak ilişkili kaspaz (lar) ı belirlemek için, IHC, kaspazlar ve hücresel belirteçler için doğrulanmış antikorlarla birlikte kullanıldı. Laboratuvarda yapılan önceki çalışmalar, kaspaz-9'un bir iskemik inme modelinde ve nöronal disfonksiyon ve ölümden korunan oldukça spesifik bir inhibitör ile kaspaz-9'un inhibisyonunda hızla aktive olduğunu göstermiştir12. Retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) bir parçası olduğundan, nörovasküler yaralanmalarda kaspaz-9'un rolünü sorgulamak ve daha fazla araştırmak için bir model sistem olarak hizmet eder13. Bu amaçla, RVO'nun fare modeli, kaspaz-9'un hücreye özgü yerini ve dağılımını ve nörovasküler hasardaki etkisini incelemek için kullanıldı. RVO, çalışan yaşlı erişkinlerde vasküler yaralanmadan kaynaklanan körlüğün yaygın bir nedenidir14. Kaspaz-9'un endotel hücrelerinde apoptotik olmayan bir şekilde eksprese edildiği, ancak nöronlarda eksprese edilmediği bulundu.
Bir doku olarak, retina, vasküler ağların takdir edilmesini sağlayan düz bir montaj veya nöronal retinal tabakaları vurgulayan kesitler olarak görselleştirilme avantajına sahiptir. Enine kesitlerde kaspaz proteini ekspresyonunun nicelleştirilmesi, retinadaki kaspaz (lar) ın lokalizasyonunu tanımlayarak retinal nöronal bağlantı ve görme fonksiyonunda hangi kaspazın potansiyel olarak kritik olduğu konusunda bağlam sağlar. Tanımlama ve validasyondan sonra, tanımlanan kaspazın indüklenebilir hücreye özgü delesyonu kullanılarak ilgilenilen kaspazın hedeflenmesi sağlanır. Potansiyel terapötik sorular için, aktif kaspazı inhibe etmek için özel araçlar kullanılarak ilgilenilen kaspazların alaka düzeyi test edildi. Kaspaz-9 için yüksek seçici inhibitör 7,15 pervane edilen bir hücre, Pen1-XBIR3 kullanıldı. Bu yazıda 2 aylık erkek C57BL/6J suşu ve C57BL/6J arka planlı tamoksifen kaynaklı endotelyal kaspaz-9 nakavt (iEC Casp9KO) suşu kullanıldı. Bu hayvanlar RVO'nun fare modeline maruz bırakıldı ve C57BL / 6J, kaspaz-9 seçici inhibitörü Pen1-XBir3 ile tedavi edildi. Tanımlanan metodoloji, merkezi ve periferik sistemlerdeki diğer hastalık modellerine uygulanabilir 7,15.

<table><tbody><tr><td>anti-Kaspaz-7 488</td><td>Novus Biyolojikler</td><td>NB-56529AF488</td><td>1:150'de kullanım</td></tr><tr><td>anti-cl-Kaspaz-9</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9505-S</td><td>1:800'de kullanım</td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>1:50'de kullanım</td></tr><tr><td>Konfokal İplik Diski Mikroskobu</td><td>Biovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 2.3.0</td><td>açık kaynak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluormount G</td><td>Fisher</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 fare</td><td>laboratuvarı tarafından oluşturulan</td><td></td><td>Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Isolectin (594, 649)</td><td>Vector</td><td>DL-1207</td><td>1:200'de kullanım</td></tr><tr><td>Ketamin Hidroklorür</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen1-XBir3</td><td>laboratuvarı tarafından oluşturulan</td><td></td><td>Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Prism 9.1</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.'ye bakın.</td><td>Fisher</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Görünüm 4.0 Ziyaretçi</td><td>Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

retina dokusunda İmmün boyalı kaspaz-9'un miktarının belirlenmesi

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Kaspaz ailesinin, hücre farklılaşması, aksonal yol bulma ve proliferasyon dahil olmak üzere hücre ölümünün ötesinde birçok hücresel yola aracılık ettiği bilinmektedir. Hücre ölümü proteazları ailesinin tanımlanmasından bu yana, gelişim, sağlık ve hastalık durumlarında belirli aile üyelerinin işlevini tanımlamak ve genişletmek için araçlar araştırılmıştır. Bununla birlikte, şu anda yaygın olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen kaspaz araçlarının çoğu, hedeflenen kaspaz için spesifik değildir. Bu yazıda, sinir sistemindeki kaspaz-9'u tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için kullandığımız yaklaşımı, immünohistokimyasal okumalarla yeni bir inhibitör ve genetik yaklaşımlar kullanarak tanımladık. Spesifik olarak, retinal nöronal dokuyu kaspazların varlığını ve işlevini tanımlamak ve doğrulamak için bir model olarak kullandık. Bu yaklaşım, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlar ve ilgilenilen diğer karmaşık dokulara ve kaspazlara uygulanabilir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri tanımlamak için avantajlı olabilir.

Tanımlanan protokol, kullanıcının retina dokusundaki kaspaz-9 seviyelerini analiz etmesini ve ölçmesini sağlar. Ek olarak, kaspaz-9 ve aşağı akış substratlarını daha fazla tanımlamak, doğrulamak ve özellikle hedeflemek için araçlar sunar. Özetlenen adımlar, floresan fotomikrograflarda kaspaz seviyelerinin ve hücresel özgüllüğün ölçülebilir analizini sağlar. Tüm rakamlar, yaralanmamış ve 1 günlük P-RVO retina kesitlerinde toplam retina, endotel hücreleri ve nöronlarda belirtilen kaspaz seviyelerinin temsili fotomikrografl...

Burada, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimya protokolü sunulmaktadır.

Retina Dokusunda İmmün Boyalı Kaspaz-9'un Miktarının Belirlenmesi

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Bu protokol, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimyasal yöntem sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlaması ve ilgilenilen diğer kompleks dokulara ve kaspazlara uygulanabilmesidir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için avantajlı olabilir.Lekeli retina kesitlerinin konfokal mikroskopi görüntülerini kullanarak kaspaz seviyelerini ölçmeye başlayın. Bunu yapmak için 405, 470, 555 ve 640 kanallarının görüntü dosyalarını Fiji'nin konsoluna sürükleyin. Dosyalara renk atamak için resim, renk ve kanalları birleştir sekmelerini tıklatın.Ardından, görüntü yığınını ve Z projesini tıklatarak Z yığınını sıkıştırın. Projeksiyon türünü maksimum yoğunluk olarak seçin. Resmin ardından renk kanalının aracını tıklayarak kanalın arayüzünü açın.Ardından, parlaklık ve kontrast arayüzünü açın. Kanal başına parametreleri seçmek için kanalın sekmesine gidin ve bir kanal seçin. İmleci arka planın üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin.Ardından imleci kaspaz ifade edilen hücrenin üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin. Parametreleri test etmek için parlaklık ve karşıtlık arabirimine gidin ve seç'i tıklatın. Görüntülenen minimum değeri veya kaspaz ifade edilen hücrenin piksel değerini takın.Ardından, Tamam'ı tıklamadan önce görüntülenen maksimum değeri veya arka plan pikseli değerini takın. Kör dokudan rastgele görüntüleri seçin ve tüm kanalların parametrelerini test etmek için kanal başına parametre seçimini tekrarlayın. Parametreler ayarlandıktan sonra, görüntü dosyalarını açın ve Z yığınını sıkıştırın.Kaspaz kanalı için parlaklık ve kontrast parametrelerini ve vasküler belirteç kanalı için izolektini ekleyin. Nokta aracını kullanın ve pozitif alanların okunması olarak vasküler belirtecin kaspaz ekspresyonu ile kolokalizasyonunu kullanarak pozitif vasküler alanların sayısını sayın. Daha sonra kancaları pozitif nöronal alanların belirteci olarak kullanarak, pozitif vasküler alanların sayısını ölçün.Resim başına e-tablodaki değerlere açıklama ekleyin ve değerlerin ortalamasını bölüme göre alın. Bölüm değerlerinin ortalaması, göz başına okuma olacaktır. Protokol, kaspazların hücresel lokalizasyonunu ve kaspazların eksprese edildiği nöronal retinal tabakaları tanımladı.Retinal kesit, retinal ganglion tabakasında veya RGL, Internuclear tabakasında veya INL'de retina çekirdeklerinin ve kancalarla boyandığında dış nükleer tabakanın veya ONL'nin görüntülenmesine izin verdi. Enine kesitte, retinal kan damarlarının bağlantısı kesilmiş ve RGL ile INL arasındaki ve INL ile ONL arasındaki pleksiform tabakaları besleyen ayrı görünüyordu. Retinal kesitler ayrıca retinal ven tıkanıklığından bir gün sonra yüksek oranda düzenlenmiş kaspaz-9'u da tanımladı.Kaspaz-9 inhibisyonu, endotel hücreli nakavt farelerde nöronal kaspaz-7 ekspresyonunu azaltmada daha etkiliydi ve bu da endotel kaspaz-9'un fonksiyonel uygunluğunu doğruladı. Temsili analiz, kaspaz-9 aktivitesinin inhibisyonunun, retinal ven tıkanıklığı sonrası kaspaz-7 ekspresyonunu farmakolojik olarak bloke ettiğini göstermiştir. Tekniğin başarısı, verilerin tutarlılığını, geçerliliğini ve güvenilirliğini sağlamak için dikkatli doku hazırlığının yanı sıra IHC ve mikroskobik görüntülemeye dayanmaktadır.Bu yöntem, kaspaz sinyallemesinin yarı kantitatif karşılaştırması için batı blotlama analizi ile birleştirilebilir. Teknik, RVO'da aktif kaspaz-9'u hedef alan terapötik bir yaklaşımın etkinliğini sorgulamak için adımlar sağlamıştır. Bu yaklaşım beyin de dahil olmak üzere diğer dokulara da uygulanabilir.

quantification-of-immunostained-caspase-9-in-retinal-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Katarakt dünyada körlüğün en önde gelen nedenidir. Güneş ultraviyole radyasyon (UVR) katarakt gelişimi için en önemli risk faktörüdür. Kadar UVR-B ile indüklenen katarakt bir hayvan modeli geliştirilmiştir. UVR, kantitatif RT-PCR ve immünohistokimyasal maruziyet: Bu yazıda katarakt oluşumu soruşturma yöntemleri açıklanmaktadır.

Moleküler Mekanizmalarının Karakterizasyonu<em&gt; In vivo</em&gt; UVR İsteyerek Katarakt

Kaynak: Lani-Louzada, R.,  et al. Kemirgenlerde cerrahi olarak indüklenen glokom için limbal vasküler pleksusun tam daire koterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2022). Bu video, limbal vasküler pleksusun tam daire koterizasyonuna tabi tutulan kimyasal olarak sabitlenmiş sıçan retinalarından retinal ganglion hücrelerinin nicelleştirilmesini göstermektedir. İşlem, geçirgenlik, antikor boyama ve nükleer karşı boyamayı içerir, ardından yüksek göz içi basıncının retinal ganglion hücresi canlılığı üzerindeki...

Koterizasyona Bağlı Oküler Hipertansiyon Sonrası Retinal Ganglion Hücreli Somaların Miktar Tayini 

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Miyokard enfarktüsü (MI) sadece bozulmuş kardiyak fonksiyon tarafından değil, aynı zamanda MI'nın davranışsal sonuçlarında yer alan bir beyin bölgesi olan amigdalada apoptoz ile de takip edilir. Bu protokol, MI'nın nasıl indükleneceğini, amigdala dokusunun nasıl toplanacağını ve burada bir apoptoz belirteci olan kaspaz-3 aktivitesinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Retina damar sisteminin oksidatif stres ve sitokinler gibi diyabet/diyabetik retinopati ile ilişkili hakaretlerden ölüme karşı direncini izlemek için bir koruma testi geliştirilmiştir.

Farelerde Retina Damar Sisteminin Diyabete Bağlı Ölümden Korunmasını Saptamak İçin Bir Test

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Öğrenin, retina dokusunda immünohistokimya ile kaspaz-9 ekspresyonunu belirleme ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, apoptoz ve hücre biyolojisi araştırmalarında terapötik hedeflerin tanımlanmasına katkı sağlar.

Retina Dokusunda İmmün Boyalı Kaspaz-9'un Miktarının Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet