Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

Bu protokol, numune çıktısı, otomatik elleçleme ve numuneleri görselleştirirken mekanik gerilimi hassas bir şekilde uygulama yeteneğindeki deneysel avantajlardan yararlanmak için mikroakışkan teknolojilerinin nasıl üretileceğini ve kullanılacağını açıklamaktadır. Bu teknik, embriyolar ve organoidler gibi çok hücreli biyolojik organizmaların immobilizasyonları, hizalamaları ve canlı görüntülemeleri için manuel olarak kullanılmasını en aza indirir. Ayrıca mekanobiyoloji çalışmaları için mekanik sıkıştırmanın onlara uygulanmasını sağlar.

Bu mikroakışkan çip için yüksek en boy oranı özelliklerine sahip kalıpların üretimi, geleneksel mikrofabrikasyon teknikleriyle zor olabilir. Bu video makalesinde açıklanan ipuçları bu zorlukların üstesinden gelebilir. Başlamak için, silikon gofreti önce asetonla, sonra izopropil alkolle temizleyin.

Silikon gofreti 30 dakika boyunca 250 santigrat derecelik bir sıcak plakaya yerleştirin. dehidrasyon fırını için. Silikon gofreti bir buhar asal fırında hekzametildisiloksan ile kaplayın.

Viskozitesini azaltmak için bir şişe SU-8 2100 Fotodirenci 60 santigrat derece fırına 15 dakika koyun. Photoresist yüzeyin çoğunu kaplayana kadar sıcak plakaya yerleştirilen silikon gofretin her bir inç için ısıtılmış Fotodirencin bir mililitresini dökün. Ön spini önce 30 saniye boyunca dakikada 250 rotasyonda, ardından 30 saniye boyunca dakikada 350 rotasyonda uygulayın ve her ikisi de saniyede 100 RPM hızlanma ile 30 saniye daha uygulayın.

Ardından, önce saniyede 100 RPM hızlanma ile 15 saniye boyunca dakikada 500 dönüşte ve ardından saniyede 300 RPM hızlanma ile 30 saniye boyunca dakikada 1.450 dönüşte bir spin uygulayın. Kenar boncuğu temiz oda çubuğu ile çıkarın ve kusurları gidermek ve düzgün kaplamayı teşvik etmek için gofret üzerine aseton püskürtün. Silikon gofreti, fotoğraf maskesi aracılığıyla santimetre kare başına 350 milijoule UV ışığına maruz bırakın.

Kontak maskesi hizalayıcısını kullanarak, silikon gofrete maruz kalma sonrası fırını uygulayın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Beheri başka bir büyük kabın içine yerleştirin ve daha büyük beheri yeni bir geliştirici çözümüyle doldurun. Beher üzerine metal bir ağ yerleştirin.

Silikon gofreti metal ağın üzerine baş aşağı yerleştirin. Silikon gofreti, karıştırıcı açıkken 30 dakika boyunca geliştiriciye batırılmış halde bırakın. Silikon gofreti, 40 kilohertz'de bir saat boyunca taze geliştirici ile doldurulmuş bir ultrasonik banyo sonicator'a aktarın.

Ardından gofreti beherden çıkarın ve yeni bir geliştirici çözümüyle yıkayın. PDMS tabanını kürleme maddesi ile 10'a bir oranında karıştırarak önceden kürlenmiş PDMS çözeltisini hazırlayın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g için bir santrifüje yerleştirerek gazdan arındırın.

Önceden kürlenmiş PDMS'yi bir silikon gofret üzerine dökün ve tekrar gazını çözün. Son olarak, kürlenmemiş PDMS'yi kürleme için 60 santigrat derece fırına yerleştirin. Mikroakışkan çip geometrisine karşılık gelen kürlenmiş PDMS bölgesinin sınırlarını kesmek için bir neşter kullanın.

PDMS'deki giriş ve çıkış deliklerini biyopsi zımbasını veya künt uçlu bir iğneyi kullanın. PDMS'yi, plazma işleminden sonra desenli yüzeyi cam slayta bakacak şekilde cam slaytın üzerine yerleştirin ve mikrokanalları kovalent yapıştırma yoluyla kapatın. Oregon-R yetişkin sineklerinin elma suyu agar plakalarına yumurta bırakmasına izin verin ve verilen deney için yumurtlamadan sonra plakaları istenen gelişim zamanında toplayın.

Agar'ı embriyo yumurtası yıkama ile doldurun ve embriyoları agardan çıkarmak için bir boya fırçasıyla hafifçe çalkalayın. Embriyoları, ara sıra karıştırarak, 90 saniye boyunca% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine aktarın. Embriyoları bir doku eleğinden süzün ve ağartıcı çözeltisini suyla iyice yıkayın.

Embriyoları, embriyoları tamamen örtmek için yeterli embriyo yumurta yıkama ile 90 milimetrelik bir cam Petri kabına aktarın. Embriyoları diseksiyon mikroskobunda transillumination ile inceleyin ve mikroakışkan cihaza yüklenmek üzere istenen gelişim aşamasındaki embriyoları seçin. Yedi embriyo mikrokanalının tümünü, ana embriyo giriş portundan 0.4 mikrometre filtrelenmiş IPA ile doldurarak astarlayın.

IPA'yı 0,4 mikrometre filtrelenmiş deiyonize su ile değiştirin. Daha sonra DI suyunu embriyo yumurta yıkama çözeltisi ile değiştirin. Cam pipet kullanarak cam Petri kabından yaklaşık 100 önceden seçilmiş embriyo toplayın.

Daha sonra, embriyoları embriyo giriş portuna pipetleyin ve embriyo mikrokanallarını açmak için portatif bir vakum pompası kullanarak gaz girişine yaklaşık üç PSI negatif basınç uygulayın. Ardından, embriyoların otomatik olarak hizalanması ve embriyo mikrokanallarına yerleşmesi için mikroakışkan çipi aşağı doğru eğin. Embriyo mikrokanal girişleri aynı anda giren birden fazla embriyo tarafından tıkanırsa, mikroakışkan çipi yukarı doğru eğin ve ardından tıkanmayı temizlemek için tekrar aşağı doğru eğin.

Gerekli verime dayanarak, embriyo mikrokanallarına 300 kadar embriyo sokuldu. Embriyo yüklemesi tamamlandıktan sonra, embriyoları hareketsiz hale getirmek için vakumu çıkarın. Ardından mikro akışkan çipi yatay konuma geri eğin.

Üç PSI sıkıştırması uygulamak için gaz girişine basınç göstergesine sahip taşınabilir bir pozitif basınç kaynağı bağlayın. Mekanik olarak uyarılan embriyolar üzerinde canlı görüntüleme deneyleri yapılacaksa, mikroakışkan çipi, basınç kaynağına bağlı gaz girişi ile standart bir mikroskop sahne cam slayt tutucusuna yerleştirin. Embriyoları mikroakışkan kanalların içindeki floresan mikroskop altında inceleyin.

Sıkıştırma deneyi tamamlandıktan sonra, embriyolar aşağı akış analizi için toplanabilir. Bunu yapmak için, önce embriyoları serbest bırakmak için vakumu gaz girişine uygulayın. Ardından, embriyoların embriyo giriş portuna doğru aşağı doğru hareket etmesi için mikroakışkan çipi yukarı doğru eğin.

Bir cam pipet kullanarak embriyoları mikroakışkan çipten toplayın. Mikroakışkan cihazın işlevselliği, Drosophila embriyolarının sıkıştırma kanallarına yüklenmesi ve gaz kanallarına pozitif basınç uygulanması ile deneysel olarak belirlendi. Embriyolar vakum altında veya nötr basınç durumlarında önemli bir sıkıştırma yaşamaz.

Pozitif basınç uygulandığında sıkıştırılırlar. Mikroskop altında embriyoların azalan genişliğinin ölçümleri, gaz basıncının hedef sıkıştırma seviyesini elde etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu şekilde yapılan mikroakışkan cihazlar, hareketsiz numunelerin kimyasal olarak uyarılmasına izin verir.

Stimülasyon, yüksek uzaysal zamansal görüntülemeye izin verir. Gelişim biyolojisindeki temel bir soru, mekanik kuvvetlerin gelişim sırasında protein ve gen ekspresyonunu nasıl düzenlediğidir? Bu teknoloji, aynı anda çok sayıda embriyoya mekanik stimülasyon uygulamamıza izin verir, böylece karşılaştırmalı proteomik veya transkriptomik deneyler yapmak için yeterli miktarda protein ve RNA'yı izole edebiliriz.

Bu, araştırmacıların mekanik kuvvetlere duyarlı proteinler ve genler hakkında daha fazla bilgi edinmelerini sağlayacaktır.