Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yetişkin Fare Kalbinden Tek Hücreli RNA Dizilimi için Kardiyomiyosit Olmayan Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Protokolümüz, nispeten düşük maliyetlerle tek hücreli süspansiyonun hem hücre canlılığını hem de izolasyon verimliliğini sağlar. Laboratuvar ekipmanı için nispeten düşük maliyetler ve gereksinimler bu tekniğin temel avantajlarıdır. Tek hücre dizilimi, kardiyak patofizyolojide kardiyomiyosit olmayanların heterojenliğini ortaya koymakta ve ayrıca kalp hastalığı için temel ve klinik çalışmalar için fikir vermektedir.

Bu protokol, bağışıklık hücrelerinin tutulumu gibi MI sonrası kardiyovasküler çevre üzerine yapılan bu çalışmalarda kullanılabilir. İlk kez hazırlıklar için, örnek pepsin ve sindirim süresine ekstra dikkat gösterilmesini öneririm. Tamponlar ve çözeltiler makalede açıklandığı gibi hazırlandıktan sonra, iki hafta önce miyokard enfarktüsü olan ötenazi yapılmış bir fareyi cerrahi masaya sırtüstü pozisyonda yerleştirin.

Arka bacaklarını yapışkan bant kullanarak sabitleyin. Kalbi tüketmek için, vücudunuza% 70 etanol püskürtün. Karaciğerden kaçınırken karın derisi ve kaslardan dikey bir kesi yapın.

Kalbi delmeden, göğüs kafesini dikkatlice açın ve perfüzyon sıvısı renksiz çalışana kadar sol ventrikülü önceden soğutulmuş PBS çözeltisi ile doldurun. Forseps kullanarak, kalbi yavaşça kaldırın ve dış kısmına tutturulmuş fazla dokuları oftalmik makasla kesin. Kalbi, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin.

Kalbi buz üzerine yerleştirilmiş 24 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Kardiyak ayrışma tamponunun 150 mikrolitresini kuyuya pipet edin ve makas kullanarak kalbi bir milimetre büyüklüğünde parçalara ayırın. Kıyılmış kalp dokusunu, beş mililitre doku ayrışma tamponu içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü termostatik pistonlu bir çalkalayıcıya yerleştirin. Süspansiyonu her 20 dakikada bir 10 kez yukarı ve aşağı doğru borulayın. Kümeleri ve sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için, hücre süspansiyonunu 25 mililitre hücre yıkama tamponu kullanarak 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.

Santrifüj tüpünü ve hücre süzgecini durulayın. Ardından, daha fazla hücre kümesini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 300 x g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.

Hücre örneğini beş hacim RBC lizis tamponunda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Şimdi, daha önce gösterildiği gibi hücre süspansiyonuna ve santrifüje dört hacim hücre yıkama tamponu ekleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri hücre yıkama tamponunun 10 mililitresinde yeniden askıya alın ve bir kez daha santrifüj yapın.

Santrifüjlemenin sonunda, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre hücre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Başka bir santrifüj tüpünde süspansiyonun 18 mikrolitresini alın ve iki mikrolitre akridin turuncu propidyum iyodür boyama çözeltisi ekleyin. Bu lekeli çözeltinin 10 mikrolitresini bir sayım odası slaytına ekleyin.

Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayılarını ve canlılığını değerlendirin. Tek hücreli kardiyak süspansiyonda hücre fragmanları gözlendi. Floresan aktive hücre sıralama, hücre parçalarının oranını ve hücre kümelenmesini etkili bir şekilde azalttı ve ortalama hücre boyutunun azalmasına neden oldu.

RNA dizilimi, denetimsiz kümeleme ve azaltılmış T-dağılmış stokastik komşu gömme ile gösterildiği gibi yedi tip bağışıklık hücresinin belirgin bir şekilde ayrıldığını kanıtladı. Her bağışıklık hücresi, klasik belirteçlerin yüksek bir ekspresyonunu gösterdi. Kalp dokusunun eksik sindirimi önlemek için yeterince küçük kesilmesi gerekir, bu da hücre süspansiyonunda çok sayıda hücre topaklanmasına neden olur.

Bu protokol ile elde edilen tek hücreli süspansiyon, birincil hücre kültürünün akış analizinde daha fazla uygulanabilir. Bu protokol, araştırmacıların kalp dokularının ötesine bakmalarına ve miyokard enfeksiyonunu sistematik bir problem olarak görmelerine yardımcı olabilecek miyokard enfeksiyonunun mikro ortamı üzerine yapılan çalışmalara fayda sağlar.