Name: Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Öğrenin, doğuştan immün hücre ölümünde kaspaz aktivasyonunu değerlendirmek için basit bir teknik kullanarak piroptoz, apoptoz ve necroptoz gibi hücre ölümü yollarını incelemeyi. Bu yöntem, enfeksiyon ve kanser modellerinde hastalık mekanizmalarını anlamak için kritik bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kanneganti laboratuvarı üyelerine yorum ve önerileri için teşekkür ederiz ve bilimsel düzenleme desteği için J. Gullett, PhD'ye teşekkür ederiz. Laboratuvarımızdaki çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 ve CA253095 (T.-D.K.) ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Hayır Kurumları (T.-D.K.) tarafından desteklenmektedir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

T.-D.K. Pfizer'in danışmanıdır.

Kaspaz bölünmesi ve aktivasyonunun izlenmesi, doğuştan gelen immün yanıtın bir parçası olarak doğuştan gelen immün PCD aktivasyonunun en kapsamlı resimlerinden birini sağlar. Burada açıklanan protokol, IAV, HSV1 ve F. novicida enfeksiyon...

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, enfeksiyon sırasında ve doku hasarı ve homeostazdaki değişiklikler gibi steril uyaranlara yanıt olarak ilk savunma hattı olarak işlev görür. Hücre yüzeyindeki ve sitoplazmadaki doğuştan gelen bağışıklık sensörleri, enflamatuar sinyal yollarını ve hücresel yanıtları tetiklemek için patojen veya hasarla ilişkili moleküler paternlere (sırasıyla PAMP'ler veya DAMP'ler) yanıt verir. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin kilit süreçlerinden biri, enfekte olmuş veya hasarlı hücreleri çıkarmak ve daha fazla doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini yönlendirmek için hücre ölümünün indüklenmesidir. Programlanmış hücre ölümü (PCD), türler arasında oldukça korunmuş bir süreçtir ve doğuştan gelen bir bağışıklık mekanizması olarak evrimsel önemini vurgulamaktadır.
Tüm hücre tiplerinde aktive edilebilen birkaç doğuştan gelen immün PCD yolu vardır. Kaspazlar, geleneksel olarak enflamatuar olmayan apoptoz yolunun yanı sıra pirotoz, nekroptoz ve PANoptosis 1,2,3,4,5 gibi enflamatuar PCD yolları da dahil olmak üzere birçok PCD yolunda kritik olan, yüksek oranda korunmuş, hücre içi, sistein bağımlı proteazların önemli bir ailesidir. . İyi tanımlanmış 11 insan ve 10 murin kaspazı ve fonksiyonel olabilen psödo-kaspazlar vardır ve çoğu aktivasyon için bölünme gerektiren inaktif monomerik veya dimerik pro-kaspazlar olarak yapısal olarak ifade edilir 6,7. Kaspazlar ayrıca multiprotein komplekslerinin işe alınması ve oluşumu için önemli alanlar içerir. Bunlar arasında kaspaz-1, kaspaz-2, kaspaz-4, kaspaz-5, kaspaz-9 ve kaspaz-11'de bulunabilen kaspaz aktivasyon ve işe alım alanı (CARD) veya kaspaz-8 ve kaspaz-10'da bulunan ölüm efektör alanı (DED) bulunur. Hem proteolitik aktiviteleri hem de multiprotein kompleksleri oluşturma yetenekleri sayesinde, kaspazlar doğuştan gelen immün PCD'nin kritik itici güçleridir.
Doğuştan gelen immün PCD'de kaspazların rolü ilk olarak apoptozda tanımlanmıştır; burada başlatıcı kaspazlar, kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10, cellat kaspazları, kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7'yi aktive ederekhücre ölümünü 8,9,10,11,12 olarak yönlendirmiştir. Başlatıcı kaspazlar çeşitli sinyal kaskadları ile aktive edilebilir; ekstrinsik yolak, hücre dışı ligandın neden olduğu ölüm reseptörü sinyallemesi yoluyla kaspaz-8'i aktive eder ve intrinsik yolak, mitokondriyal bütünlüğün bozulması yoluyla kaspaz-9'u aktive eder13. Aktif başlatıcı kaspazlar, aktif formlarını üretmek için cellat kaspazlarının büyük ve küçük katalitik alt birimlerini ayıran bağlayıcıyı ayırır. Cellat, daha sonra hücreyi parçalamak için substratlarını parçalara ayırır, bu da DNA bozulmasına, zar ağartmasına, nükleer parçalanmaya ve apoptotik cisimlerin salınmasına neden olur14,15. Bu süreç tipik olarak, ölmekte olan hücrelerin efferositoz16 ile derhal temizlenmesiyle birleştiğinde, litik olmayan ve enflamatuar olmayan bir hücre ölümü formunda sona erer. Bununla birlikte, efferositozdaki kusurlar veya fagositik hücrelerin eksikliği, apoptotik hücrelerin birikmesine neden olabilir ve bu da daha sonra litik ve enflamatuar hücre ölümüne maruz kalır17,18.
Kaspaz-1 (insan ve fare), kaspaz-4 ve kaspaz-5 (insan) ve kaspaz-11 (fare) dahil olmak üzere enflamatuar kaspazların, pirotoz adı verilen bir inflamatuar doğuştan gelen immün PCD (iii-PCD) formu sırasında aktive olduğu keşfedilmiştir. Kaspaz-1 aktivasyonu, sitozolik doğuştan gelen bir bağışıklık sensörü, bir adaptör molekülü (bir CARD [ASC] içeren apoptozla ilişkili leke benzeri protein) ve kaspaz-1 içeren multiprotein kompleksleri olan enflamatuarların oluşumu ile ilişkilidir. Bu kompleksin oluşumu, kaspaz-1'in aktif formunu serbest bırakmak için yakınlık aracılı otoproteolize maruz kalmasına izin verir, bu da pro-inflamatuar sitokinler interlökin (IL)-1β ve IL-18 ve gözenek oluşturan molekül gasdermin D (GSDMD) 19,20,21,22,23 dahil olmak üzere hedef substratları parçalayabilir. . Kaspaz-11, kaspaz-4 ve kaspaz-5, lipopolisakkarit (LPS) 19,20 gibi PAMP'leri algıladıktan sonra enflamatuarın yukarı akış oluşumu olmadan GSDMD'yi aktive edebilir. Bu kaspazlar dimerizasyona uğrar, ardından oligomerizasyon ve sitozolik LPS'ye bağlandıktan sonra aktivasyon için kendi kendine bölünmeye uğrar, bu da IL-1β ve IL-18 olgunlaşmasını indüklemek için kanonik olmayan enflamatuar aktivasyon24,25,26 ve hücreye özgü bir şekilde kaspaz-1 aktivasyonuna yol açar 20. Bu pro-inflamatuar sitokinlerin olgunlaşması ve salınması, bu kaspazları "enflamatuar" olarak karakterize eder. Ek olarak, apoptotik kaspaz-8'in enflamatuar lokalize olduğu ve apoptotik ve piroptotik süreçler arasında bir bağlantı sağladığı bulunmuştur. Çalışmalar, apoptotik kaspaz-8'in nekroptoz adı verilen başka bir PCD formunu düzenlemek için de kritik olduğunu bulmuştur. Kaspaz-8 kaybı, nekrotozun III-PCD yolunu 27,28,29,30,31,32,33,34,35 yönlendirmek için spontan reseptör ile etkileşime giren serin-treonin kinaz 3 (RIPK3) aracılı karışık soy kinaz etki alanı benzeri psödokinaz (MLKL) aktivasyonu ile sonuçlanır.
Kaspazlar tarihsel olarak başlattıkları hücre ölümünün türüne göre "apoptotik" veya "enflamatuar" olarak sınıflandırılmış olsa da, artan kanıtlar, doğuştan gelen immün PCD yolları arasında kaspazlar 3,4 yoluyla kapsamlı bir çapraz konuşma olduğunu göstermektedir. Örneğin, enflamatuarlardan gelen inflamatuar kaspaz-1, apoptotik kaspaz-7'yi kanonik aktivasyon bölgesi34'te ayırır. Kaspaz-1 aktivasyonu ayrıca poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP1) 36 gibi apoptotik substratların bölünmesine de yol açabilir. GSDMD'den yoksun hücrelerde, kaspaz-1 ayrıca kaspaz-3 37,38'i de parçalayabilir. Ek olarak, kanonik olarak apoptotik kaspaz-3, PCD17,18'i indüklemek için gasdermin E'yi (GSDME) parçalayabilir ve ayrıca GSDM'yi inaktif bir form40'a işleyebilir. Ayrıca, enflamatuar komplekse kaspaz-8 alımı 39,40,41,42,43,44,45 olarak gözlemlenmiştir ve kaspaz-8, kanonik ve kanonik olmayan enflamatuar aktivasyonun önemli bir düzenleyicisidir39. Birçok enflamatuar durumda kaspaz-8 ve kaspaz-1 için örtüşen ve gereksiz roller de vardır ve piroptotik, apoptotik ve nekroptetik bileşenlerin aktivasyonu ile karakterize doğuştan gelen immün PCD, hastalık spektrumunda 39,46,47,48,49,50 oranında ortaya çıkar.
Enflamatuar ve apoptotik kaspazlar arasındaki bu çapraz konuşmaya dayanarak, doğuştan gelen bağışıklık ve PCD'nin mekanik anlayışında önemli bir boşluk tespit edildi ve PANoptozun keşfine yol açtı. PANoptoz, patojenlere, PAMP'lara, DAMP'lere ve homeostazdaki değişikliklere yanıt olarak aktive olan ve PANoptozomlar tarafından düzenlenen benzersiz bir III-PCD şeklidir - diğer hücre ölüm yollarından bileşenleri entegre eden çok yönlü makromoleküler kompleksler 44,50,51,52,53,54,55 . PANoptozdaki biyolojik etkilerin toplamı tek başına piroptoz, apoptoz veya nekroptoz ile tek başına 3,4,35,36,39,46,47,48 ile açıklanamaz, çünkü PANoptoz, kaspaz-1, kaspaz-11, kaspaz-8, kaspaz-9, kaspaz-3 ve / veya kaspaz-7 dahil olmak üzere çoklu kaspazların aktivasyonu ile karakterize edilir. bağlama bağlı olarak 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptoz, bulaşıcı ve enflamatuar hastalıkların yanı sıra kanserler ve kanser tedavilerinde giderek daha fazla rol oynamaktadır 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Apoptoz, piroptoz, nekroptoz ve PANoptoz dahil olmak üzere hücre ölüm yolakları boyunca kaspazların temel rolü göz önüne alındığında, aktivasyonlarını karakterize etmek ve PCD yollarının tam karmaşıklığını anlamak için teknikler geliştirmek önemlidir. Buradaki protokol, hücreleri uyarmak ve kaspazların sonraki aktivasyonunu ölçmek için bir yöntemi detaylandırmaktadır (Şekil 1). Bu yöntem, genellikle aktivasyonları için gerekli olan kaspazların proteolitik bölünmesini, onları incelemek için bir araç olarak kullanır. Batı lekelenmesi yoluyla, protein boyutları belirlenebilir, bu da inaktif pro-kaspazların ve bunların aktif, parçalanmış formlarının net bir şekilde görselleştirilmesine ve farklılaştırılmasına izin verir.
Bu protokolün başlıca avantajları, 1) PCD aktivasyonunu daha doğru bir şekilde belirlemek için tek bir endojen hücre popülasyonundan paralel olarak çoklu kaspazların aktivasyonunu değerlendirme yeteneği ve 2) kapsamlı eğitim veya pahalı ekipman gerektirmeyen nispeten basit laboratuvar tekniklerinin kullanılmasıdır. Önceki protokoller, kültür süpernatantlarında, hücre ve doku lizatlarında, mikroskopi yoluyla tüm hücrelerde ve in vivo 67,68,69,70,71'de kaspaz aktivasyonunu izlemek için batı lekeleme, floresan muhabirleri veya antikor boyama yöntemini kullanmıştır, ancak bu teknikler genellikle bir numunede sadece bir veya iki kaspazı izler. Ayrıca, bölünme üzerine floresan kaspaz bölünme bölgeleri içeren sentetik peptit substratları, hücre veya doku lizatlarında kaspaz aktivasyonunu izlemek için kullanılmış olsa da, bu substratlar genellikle birden fazla kaspaz tarafından parçalanabilir ve bu da bu sistemdeki bireysel kaspazların spesifik aktivasyonunu belirlemeyi zorlaştırır. Ek olarak, floresan muhabirlerin veya diğer etiket tabanlı yöntemlerin kullanımı yerine batı lekelenmesinin kullanılması, araştırmacıların muhabir genleriyle spesifik hücre çizgileri oluşturmak yerine endojen hücreleri kullanmalarına izin verir. Endojen hücrelerin kullanılmasının, birçok ölümsüzleştirilmiş hücre çizgisinin anahtar hücre ölüm molekülleri72,73'te eksik olması da dahil olmak üzere sonuçları etkileyebilecek birçok avantajı vardır. Ek olarak, endojen hücrelerin kullanılması, tek bir soy yerine makrofajlar, epitel hücreleri ve endotel hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinin değerlendirilmesine izin verir. Batı lekelemesi aynı zamanda büyük, pahalı ekipmanlara veya karmaşık kurulumlara ihtiyaç duymadan dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlarda gerçekleştirilebilen nispeten basit ve uygun maliyetli bir tekniktir.
Bu protokol, diğer enflamatuar sinyal yolaklarındaki iskele rolleri ve işlevleri de dahil olmak üzere kaspazların hem hücre ölümüne bağımlı hem de hücre ölümünden bağımsız işlevlerini anlamak için biyoloji genelinde yaygın olarak uygulanabilir74. Bu yöntemin uygulanması, doğuştan gelen immün PCD yolaklarının ve hastalıklar ve koşullar arasında enflamatuar sinyalleşmenin incelenmesinde birleşik bir yaklaşıma izin verir ve bu protokol, gelecekteki terapötik stratejilerin gelişimini bilgilendirecek kritik düzenleyici süreçleri ve mekanik bağlantıları tanımlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; m filtre</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>10 kuyucuklu %12 poliakrilamid jel;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18 G iğne&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G iğne&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M hücre süzgeci&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm doku kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182 cm2 doku kültürü şişesi</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Aksesuar beyaz trans tepsi</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; kaspaz-1 antikoru</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Antindash; kaspaz-11 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; kaspaz-3 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; kaspaz-7 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; kaspaz-8 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; kaspaz-9 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; parçalanmış kaspaz-3 antikoru&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; parçalanmış kaspaz-7 antikoru&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; parçalanmış kaspaz-8 antikoru&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare HRP konjuge ikincil antikor&nbsp;</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan HRP konjuge ikincil antikor&nbsp;</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anti-sıçan HRP konjuge ikincil antikor&nbsp;</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; &beta;-Aktin antikoru (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Triptikaz Soya Suyu</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk banyosu</td><td>Chemglass Yaşam Bilimleri</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biyofotometre D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcılar</td><td>CellTreat Scientific Ürünler</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesans görüntüleyici (Amersham 600)&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; hazne</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>Küvetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Eelektroforez cihazı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (U112 suşu)</td> <td>BEI Kaynakları</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>Jel serbest bırakıcı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>Herpes simpleks virüsü 1 (HF suşu)</td> <td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek glukoz DMEM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>İnsan anti&ndash; kaspaz-1 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>İnsan anti&ndash; kaspaz-8 antikoru</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş inkübatör&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>Hoffmann ve ark. tarafından inşa edilmiştir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L929 hücreleri L929</td><td>ile koşullandırılmış ortam</td>L-sistein oluşturmak için <td>ATCC</td><td>CCL-1</td> hücre hattı</tr><tr><td>;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP substrat</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>standart hassasiyetli HRP substrat</td></tr><tr><td>MDCK hücreleri</td><td>IAV viral titresini belirlemek için</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td> hücre hattı</tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kurutulmuş süt tozu</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör tablet</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membranı&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan çalkalayıcı</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat ve nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Kare Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Sıyırma tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Süper Sinyal Femto HRP alt tabaka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td>yüksek hassasiyetli HRP alt tabaka</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot yarı kuru sistem&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td>Vero hücrelerinden ultra saf lipopolisakkarit (LPS),</tr><tr><td></td><td>HSV1 viral titresini belirlemek için</td> <td>ATCC</td><td>CCL-81</td> hücre hattı</tr></tbody></table>

doğuştan İmmün hücre Ölümünü değerlendirmek için kaspaz aktivasyonunun değerlendirilmesi

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Doğuştan gelen bağışıklık, patojenlere ve steril hakaretlere yanıt olarak kritik ilk savunma hattını sağlar. Bu yanıtın önemli bir mekanik bileşeni, enfekte olmuş veya hasar görmüş hücreleri ortadan kaldırmak ve bağışıklık tepkilerini yaymak için doğuştan gelen immün programlanmış hücre ölümünün (PCD) başlatılmasıdır. Bununla birlikte, aşırı PCD inflamasyon ve patoloji ile ilişkilidir. Bu nedenle, PCD'nin aktivasyonunu ve düzenlenmesini anlamak, doğuştan gelen immün yanıtları karakterize etmenin ve hastalık spektrumunda yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinin merkezi bir yönüdür.
Bu protokol, genellikle apoptoz, pirotoz, nekroptoz ve PANoptoz dahil olmak üzere çeşitli PCD yolaklarıyla ilişkili bir sistein bağımlı proteaz ailesi olan kaspazları izleyerek doğuştan gelen immün PCD aktivasyonunu karakterize etmek için yöntemler sağlar. İlk raporlarda kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10 apoptozda başlatıcı kaspazlar ve kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7 efektör kaspazlar olarak karakterize edilirken, daha sonraki çalışmalarda inflamatuar kaspazlar, kaspaz-1, kaspaz-4, kaspaz-5 ve kaspaz-11 pirotozu tetiklemektedir. Daha önce tanımlanmış PCD yolları boyunca kaspazlar ve diğer doğuştan gelen bağışıklık ve hücre ölümü molekülleri arasında kapsamlı bir çapraz konuşma olduğu, doğuştan gelen bağışıklık ve PCD'nin mekanik anlayışında önemli bir bilgi boşluğunu tanımladığı ve PANoptozun karakterizasyonuna yol açtığı bilinmektedir. PANoptoz, diğer hücre ölüm yollarından kaspazlar da dahil olmak üzere bileşenleri entegre eden PANoptozom kompleksleri tarafından düzenlenen benzersiz bir doğuştan gelen immün inflamatuar PCD yoludur.
Burada, çeşitli uyaranlara yanıt olarak kaspazların aktivasyonunu değerlendirmek için yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, PCD yolaklarının hem in vitro hem de in vivo karakterizasyonuna izin verir, çünkü aktif kaspazlar, optimal antikorlar ve lekelenme koşulları kullanılarak batı lekelenmesi ile görselleştirilebilen proteolitik bölünmeye uğrar. Aynı hücresel popülasyondan çoklu kaspazların aktivasyonunun değerlendirilmesine izin veren ve PCD süreçlerinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlayan bir protokol ve batı lekeleme iş akışı oluşturulmuştur. Bu yöntem, sağlık ve hastalıktaki hücresel süreçler boyunca PCD yollarını değerlendirmek için gelişim, homeostaz, enfeksiyon, inflamasyon ve kanserdeki araştırma alanlarına uygulanabilir.

PANoptoz, çok sayıda bakteriyel, viral ve fungal enfeksiyona ve diğer enflamatuar uyaranlara ve ayrıca kanser hücrelerinde 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 yanıt olarak gözlenmiştir.</...

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Bu protokol, hücre ölüm süreçlerinin aktivasyonunun çok yönlü bir şekilde anlaşılmasını sağlar, bu da hastalık mekanizmaları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir ve terapötik stratejileri bilgilendirebilir. Bu protokol, daha basit bir tekniğin kullanılmasına ve aktivasyonu büyük ölçüde belirlemek için endojen hücrelerin tek bir popülasyonundan zorunlu olan çoklu kaspazların aktivasyonuna erişmeye dayanır. Doğuştan gelen bağışıklık hücresi ölümü, enfeksiyonlardan enflamatuar hastalıklara ve kanserlere kadar hastalık spektrumunda rol oynamıştır.Kaspaz aktivasyonu yoluyla hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını anlamak, hastalık süreçlerine kritik bilgiler sağlayabilir. Bir laboratuvardan doktora sonrası araştırma görevlisi olan Dr. Julieann, prosedürü gösterecek. Kemik iliğini izole ettikten ve BMDM'leri ayırt ettikten sonra, hücreleri influenza A virüsü ile enfekte edin.20 plak oluşturan birimin enfeksiyon çokluğunda ihtiyaç duyulan virüs hacmini hesaplayın. Ortamı BMDM'lerden çıkarın ve hücreleri bir kez 500 mikrolitre PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa ısı inaktive FBS olmadan yüksek glikozlu DMEM'e 450 mikrolitre İnfluenza A virüsü ekleyin ve emilime izin vermek için plakaları n

evaluation-of-caspase-activation-to-assess-innate-immune-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bimoleküler floresan tamamlama raportör proteinleri kullanılarak insan makrofajlarındaki kaspaz proteinlerinin aktivasyonunu göstermektedir. Kaspaz-1'in pro alanları, inflamatuar kompleksler için işe alınan Venüs proteinlerinin floresan olmayan fragmanları ile kaynaştırılır. İnflamatuarların yakınlığı, Venüs parçalarının yeniden katlanmasını ve floresansını indükleyerek makrofajlarda kaspaz aktivasyonunu doğrular.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda Kaspaz Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Bu video, influenza virüsü ile stimülasyon yoluyla kemik iliği kaynaklı makrofajlarda çoklu kaspaz aktivasyonlarının değerlendirmesini göstermektedir. Makrofaj lizizi, lizatın ısıyla inaktivasyonu ve santrifüjlemeyi takiben, sonraki immünolojik analizler için hücre içi kaspazlar toplanır.

Makrofajlarda Multipl Kaspazların Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Burada, doğrudan ölüme neden olan sinyal kompleksinde (DISC) caspase-8 işlemenin algılanmasını sağlayan ve bu kompleksin bileşimini belirleyen deneysel bir iş akışı sunulmaktadır. Bu metodoloji, hücre ölüm yollarının moleküler mekanizmalarının çözülmesinden apoptoz ağlarının dinamik modellemesine kadar geniş uygulamalara sahiptir.

CD95 Ölüme Neden Olan SinyalIzasyon Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Procaspase-8'in Bu Komplekste İşleniş

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

İnfluenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, konakçı ve viral proteinleri parçalayan kaspazları aktive eder ve bunlar da pro- ve antiviral fonksiyonlara sahiptir. İnhibitörler, RNA girişimi, bölgeye yönelik mutagenez ve batı lekelenme ve RT-qPCR teknikleri kullanılarak, konakçı kortaktin ve histon deasetilazları parçalayan enfekte memeli hücrelerinde kaspazlar tanımlandı.

İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Öğrenin, doğuştan immün hücre ölümünde kaspaz aktivasyonunu değerlendirmek için basit bir teknik kullanarak piroptoz, apoptoz ve necroptoz gibi hücre ölümü yollarını incelemeyi. Bu yöntem, enfeksiyon ve kanser modellerinde hastalık mekanizmalarını anlamak için kritik bilgiler sağlar.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet