Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici
7 Nisan 2023
Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.
Protokolümüz, makroskopik nesnelerde, özellikle canlı hayvan dokusunda ve tüm hayvanlarda, özel problar ve algılama malzemeleri aracılığıyla fosforesans ömrünün ve oksijen konsantrasyonunun ayrıntılı 2D haritalanmasını sağlar. Bu bilgi birçok araştırma alanı için önemlidir. Protokolümüz, TCSPC modunda çalışan entegre ve kompakt bir görüntüleme modülü kullanır ve yaşam dokusu gibi karmaşık biyolojik numunelerde kullanım ömrünün ve oksijen dağılımının kolay ve doğru bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
Kriket adaptörünü alın ve farklı yönlerden inceleyin. Kriket'e yerleştirilmiş Photonis PP0360EF yoğunlaştırıcısını göstermek için ön taraftaki C-mount adaptörünü çıkarın ve ardından C-mount adaptörünü geri takın. Cricket'in ön taraf C-mount adaptörünü çıkarın ve 650 artı/eksi 50 nanometre emisyon filtresini takın.
C montajını geri koyarak düzeltin. Ardından, TPX üç kameralı kamera modülünü halka adaptörleri aracılığıyla Kriket modülünün arka tarafına bağlayın. Lensi, C-mount adaptörü aracılığıyla Kriket modülünün ön tarafına bağlayın.
LED'i bir güç kaynağına ve bir darbe jeneratörüne bağlayın. Şimdi, 390 nanometre süper parlak LED'i kara kutunun içindeki bir breadboard'a bağlı bir direğe monte edin. LED'i açın ve görüntülenen numunenin etkili ve homojen bir şekilde uyarılmasını sağlamak için odaklayın.
Kamera tertibatını, örneklerin görüntüleneceği sahneye doğru aşağı bakacak şekilde optik kara kutunun üzerine monte edin. Fotoğraf makinesini ve LED'i iki darbeli jeneratörlere ve dört kanallı bir osiloskoba bağlayın. Osiloskop ve darbe jeneratörlerindeki ayarları kullanarak, kameraya ve LED'e gönderilen darbeleri senkronize edin.
Yoğunlaştırıcıyı standart bir güç kaynağına bağlamak ve kazancı 2,7 volta ayarlamak için Kriket ünitesindeki özel kabloyu ve soketi kullanın. Örneği kamera lensinin önüne yerleştirin. Ardından, kamerayı ve yoğunlaştırıcı hariç tüm elektrik modüllerini açın.
Odaklama ve numune hizalama gibi operasyonel parametreleri ayarlamak için SOFI yazılımını etkinleştirin. Modüllerde, kare pozlamasını 0,01 saniyeye ayarlayın. Sonsuz kareler'i seçin ve piksel çalışma modunu eşiğin üzerinde zamana ayarlayın.
Ardından, Önizleme'ye gidin ve Medipix / Timepix kareleri penceresini açmak için Etkin modül'ü seçin. Bir sonraki adımda, kayda başladıktan sonra, renk ölçeğini ayarlayın ve görüntüyü istediğiniz yöne döndürün. Bundan sonra, odadaki ışıkları kapatın ve yoğunlaştırıcıyı açın.
İyi kontrast ve parlaklığa sahip örneklerin net görüntülerini oluşturmak için lensin ve Kriket adaptörünün odaklama özellikleriyle kamera optiklerini örnek sahne alanına odaklayın. Netleme tamamlandıktan sonra SOFI yazılımını kapatın. Ardından, terminale gidin, ham verileri ikili biçimde almak ve terminali kapatmak için özel tasarım yazılımının komutlarını yürütün.
Alınan verileri işlemek için yeni bir terminal açın. Veri dosyasını yükleyin ve veri düşürücüyü çalıştırın. İşlem sonrası verileri, verileri bir ICS görüntü dosyasına yazacak C dilinde yazılmış özel bir programla analiz edin.
Daha sonra, serbestçe kullanılabilen Time Resolved Imaging yazılımını kullanarak ICS görüntü dosyalarını açın ve fosforesans bozunumlarına uymak için iki üstel işlev kullanın. Son olarak, Fitted'i açın. ICS görüntü dosyaları, mevcut görüntü analiz yazılımına sahiptir.
Arama tablolarını kullanarak fosforesans ömrü görüntüleri oluşturun ve bunları sahte renk ölçeğinde kodlayın. Tüm görüntünün veya ilgilenilen bölgelerin ortalama yaşam boyu değerlerini hesaplamak için Ölçüm işlevini kullanın. Fosforesans yoğunluğu ve fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu görüntülerinde platin oktaetilporfirin boya sensörünün oksijenli ve oksijensiz haldeki noktaları gösterilmiştir.
Doğru emisyon filtresinin Kriket'in içine monte edildiğinden ve doğru LED'in, kablo bağlantılarının ve darbe ayarlarının kullanıldığından emin olun. Şu anda, bu protokol hayvan modelleriyle sınırlıdır, ancak potansiyel olarak kanser, felç ve iltihaplanma gibi doku hipoksisi ile ilişkili patolojik durumları teşhis etmek ve tedavi etmek için uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, özellikle canlı hayvan dokusu gibi biyolojik örneklerde yararlı olan makroskopik fotolüminesans ömür görüntüleme için tasarlanmış yeni bir optik görüntüleyici sunmaktadır. Protokol, çeşitli biyolojik süreçlerin anlaşılması için kritik öneme sahip olan fosforesans ömrünün ve oksijen konsantrasyonunun detaylı haritalanmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Biyolojik görüntüleme
- Fosforesans ömür analizi
- Oksijen konsantrasyonu ölçümü
Arka Plan
- Makroskobik görüntüleme, karmaşık biyolojik örneklerin incelenmesi için gereklidir.
- Mevcut yöntemler, uzun süre bozunan örnekleri verimli bir şekilde analiz edemeyebilir.
- Bu araştırma, canlı dokulardaki görselleştirme tekniklerini geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- Zaman çözümlü tek foton sayma (TCSPC) modlu optik görüntüleme
- Canlı hayvan dokularında uygulama
- Özel tasarlanmış görüntüleme modüllerinin ve veri işleme yazılımının kullanımı
Ana Sonuçlar
- Yaşam süresinin ve oksijen dağılımının etkili görselleştirilmesi
- Yüksek kontrastlı fosforesans yaşam süresi görüntüleri oluşturma yeteneği
- Dokudaki hipoksik koşulların gözlemlenmesinde başarılı uygulama
Sonuçlar
- Çalışma, biyolojik araştırmalar için yenilikçi bir görüntüleme yaklaşımı sunmaktadır.
- Doku hipoksisi ile ilişkili durumların teşhisi ve tedavisi için potansiyel uygulamalar.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Fosforesans ömür görüntüleme kullanılarak doku oksijenasyonunun kantitatif haritalanması, preklinik araştırmalarda doğru hipoksi değerlendirmesi için kritik bir ihtiyaca cevap vermektedir. Bu yetenek, hastalık modellemesindeki öngörü güvenini artırır ve onkoloji ile metabolik araştırmalarda hedef doğrulaması için mekanistik risk azaltmayı destekler. Platformun hızlı ve yüksek hassasiyetli görüntülemesi, doku mikroçevrelerinin sağlam bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak erken aşama portföy kararlarına ışık tutar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalık modellerinde fonksiyonel bir biyobelirteç olarak doku oksijenasyonunun doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- Canlı ve ex vivo dokularda mekânsal olarak çözünür hipoksi verileri sağlayarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Oksijen dağılımını biyolojik yolak aktivitesiyle ilişkilendirerek hedef doğrulamayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Kontrollü oksijenasyon durumları altında, sonraki bileşik taramaları için valide edilmiş doku modelleri hazırlar.
- Deney standardizasyonu için tekrarlanabilir, kantitatif yaşam süresi ölçümleri sağlar.
- Örnek başına görüntüleme süresini 20 saniyenin altına indirerek yüksek kapasiteli analizlere uygunluk sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel süreklilik için preklinik modelleri, hastalıkla ilgili hipoksi imzalarıyla hizalar.
- Hem ex vivo hem de canlı hayvan sistemlerinde metabolik görüntülemeyi destekler.
- Terapötik adayların riskle uyumlu ilerletilmesi için kantitatif son noktalar sağlar.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu görüntüleme platformu, erken keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan süreci entegre ederek hedef doğrulaması, öncü bileşik tanımlama ve translasyonel araştırma iş akışlarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Doku modellerinde oksijene bağımlı mekanizmaların hipotez testlerini yapmaya olanak tanır.
- Tarama: Assay geliştirme ve bileşik değerlendirmesi için standartlaştırılmış, kantitatif sonuçlar sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analiz için uzaysal olarak çözümlenmiş, kantitatif ömür ve oksijen konsantrasyon haritaları oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Görüntüleme çıktılarını hastalıkla ilgili hipoksi biyobelirteçleriyle hizalayarak keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli problara ve doku sistemlerine uyarlanabilen modüler, yeniden yapılandırılabilir bir görüntüleme kapasitesi sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hipoksi kaynaklı hastalık modellerinde öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış protokoller ve esnek prob uyumluluğu ile hızlı ve tekrarlanabilir görüntüleme sağlar.
- Stratejik Değer: Güçlü kantitatif son noktalar sağlayarak go/no-go karar verme sürecini ve sermaye tahsisini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış doku oksijenasyon verilerine dayalı olarak adayların riskle ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Optik görüntüleme ve fosforesans ömür analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- TCSPC özellikli kameralar ve görüntü şiddetlendiriciler dahil olmak üzere özel cihazlara erişim gereklidir.
- Görüntüleme protokollerinin ve veri analizi iş akışlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Uygun konfigürasyon ile çeşitli doku modellerine ve prob kimyalarına uyarlanabilir.
- Şu anda hayvan modelleri ile sınırlıdır; diğer sistemlere genişletilmesi daha fazla doğrulama gerektirir.
