Name: Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Keşfedin, Leishmania major kullanarak gözenek oluşturan toksinlerin bağlanma, sitotoksisite ve sinyal mekanizmalarını inceleyen bu protokolü. Sitotoksisite analizi ile hücre canlılığını gerçek zamanlı değerlendirin ve toksin direnci mekanizmalarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Keyel ve Zhang laboratuvarlarının üyelerine makaleyi eleştirel incelemeleri için teşekkür eder. Yazarlar, tesislerin kullanımı için Sanat ve Bilim Koleji Mikroskopisine teşekkür eder.

<ol><li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins%3A+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531(2020).</li>
<li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li>
<li>Farrand, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholesterol-dependent+cytolysin+membrane-binding+interface+discriminates+lipid+environments+of+cholesterol+to+support+beta-barrel+pore+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).</li>
<li>Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+elements+of+the+cholesterol-dependent+cytolysins+that+are+responsible+for+their+cholesterol-sensitive+membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).</li>
<li>Schoenauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+acid+sphingomyelinase+and+neutral+sphingomyelinase-2+inversely+determines+the+cellular+resistance+to+plasmalemmal+injury+by+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins.</a> FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).</li>
<li>Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+triggered+by+cholesterol-dependent+cytolysins+is+activated+by+mixed+lineage+kinases+and+MEK%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK.</a> Science Advances. 8 (11), (2022).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+annexin+A1+reveals+dynamics+of+ceramide+platforms+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells.</a> Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).</li>
<li>Jimenez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT+machinery+is+required+for+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ESCRT machinery is required for plasma membrane repair.</a> Science. 343 (6174), 1247136(2014).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>Wolfmeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%29%28%2B%29-dependent+repair+of+pneumolysin+pores%3A+A+new+paradigm+for+host+cellular+defense+against+bacterial+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).</li>
<li>Bravo, F., Sanchez, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+re-emerging+cutaneous+infectious+diseases+in+Latin+America+and+other+geographic+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas.</a> Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Manfredi, M., Iuliano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+leishmaniasis+with+long+duration+and+bleeding+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer.</a> Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+are+essential+for+differentiation+but+not+growth+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania.</a> EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+de+novo+synthesis+and+salvage+of+lipids+by+Leishmania+amastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes.</a> Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).</li>
<li>Kaur, P., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+of+mitogen+activated+protein+kinases+in+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites.</a> Biochimie. 193, 78-89 (2022).</li>
<li>Wiese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+MAP+kinases--Familiar+proteins+in+an+unusual+context%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context.</a> International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).</li>
<li>Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+mitogen-activated+protein+kinases+as+drug+discovery+targets+to+treat+human+protozoan+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Signal+Transduction%22%5BJournal%5D)">Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens.</a> Journal of Signal Transduction. 2011, 971968(2011).</li>
<li>Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+involved+in+flagellar-length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase involved in flagellar-length control.</a> Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).</li>
<li>Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential%2C+putative+MEK+kinase+of+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biochemistry+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">An essential, putative MEK kinase of Leishmania major.</a> Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).</li>
<li>Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+parameters+beyond+lipid+binding+affinity+drive+cytotoxicity+of+cholesterol-dependent+cytolysins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins.</a> Toxins. 11 (1), (2018).</li>
<li>Beneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Cas9+high-throughput+genome+editing+toolkit+for+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids.</a> Royal Society Open Science. 4 (5), 170095(2017).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+synthesis+through+cholinephosphate+cytidylyltransferase+is+dispensable+in+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major.</a> Scientific Reports. 9, 7602(2019).</li>
<li>Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227(2012).</li>
<li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li>
<li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li>
<li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death & Disease. 10 (4), 326(2019).</li>
</ol>

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, PAK ve KZ'ye (co-I) R21AI156225 ve KZ'ye (co-I) R01AI139198 hibe verdi. CH, bu çalışma sırasında sağlanan Öğretim Asistanlığı için Biyolojik Bilimler Bölümü'ne teşekkür etmek ister.
Finansman kuruluşlarının çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; ne de sonuçların yayınlanması kararında. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve finansman kuruluşlarının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar, rakip çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışmada, PFT'lerin moleküler mekanizmalarını ve fonksiyonlarını incelemek için kullanılan yöntemler, insan patojeni Leishmania major'u model bir sistem olarak kullanarak tanımlanmıştır. Tek hücreli canlılığı ölçmek için orta verimli bir akış sitometrisi tabanlı sitotoksisite testi geliştirilmiştir. LC50 değerleri lojistik modelleme kullanılarak doz-yanıt eğrisinden hesaplanabildiğinden, canlılık popülasyon düzeyinde nicelikseldir. Bir ilke kanıtı olarak, ortam seçiminin SLO'ya karşı vahşi tip ve ...

Gözenek oluşturan toksinler (PFT'ler), bakteriyel toksinlerin en büyük ailesidir1, ancak hücreleri deldikleri ve yok ettikleri mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. En iyi çalışılan gözenek oluşturan toksinler ailesi, kolesterole bağımlı sitolisinlerdir (CDC'ler). CDC'ler öncelikle nekrotizan fasiitin etken maddesi Streptococcus pyogenes2 dahil olmak üzere gram-pozitif bakteriler tarafından sentezlenir. S. pyogenes , konakçı hücrelerin plazma zarındaki sterollere monomerler olarak bağlanan, oligomerize olan ve membran1'e ~ 20-30 nm gözenekler ekleyen CDC streptolizin O'yu (SLO) salgılar. Lipitlerin bu süreçte oynadığı rol zayıf bir şekilde belirlenmiştir.
Lipid-CDC etkileşimlerini incelemeye yönelik bir yaklaşım, kimyasal olarak tanımlanmış lipozomların kullanılmasıdır. Tanımlanmış lipozomlar, toksin bağlanmasını vegözenek oluşumunu sürdürmek için gerekli lipit eşikleri hakkında bilgi sağlarken, hücresel fonksiyonları tam olarak özetlemezler. Örneğin, yeniden yapılandırılmış lipozomlar, memeli konakçılarının lipit asimetrisinden ve toksinlere yanıt olarak lipit modifikasyonlarından yoksundur5. Lipozomlara bir alternatif, memeli hücre hatlarını kullanmaktır. Bu hücre hatları fizyolojik olarak daha alakalı olsa da, toksin algılama ve direnç mekanizmalarında büyük ölçüde fazlalık vardır2. Sonuç olarak, CDC'lere direnmek için kullanılan onarım yolları zayıf bir şekilde belirlenmiştir. Özellikle, Ca2+ akışı, membran onarımı1'in birincil aktivatörüdür. Ca2+ akışının aşağı akışında, seramid bağımlı onarım 6,7 ve MEK'e bağımlı onarım yolu6 dahil olmak üzere birden fazla yoldevreye girer. Bu yollar, taşıma için gerekli endozomal sıralama kompleksi (ESCRT)8 ve ek 6,9,10 dahil olmak üzere diğer protein efektörleri ile etkileşime girer. Bu yolakların memeli hücrelerinde diseke edilmesi, veri yorumlamasını karıştıran fazlalık nedeniyle zordur.
Onarım yollarını incelemek için karmaşıklığı basitlikle dengelemenin bir yolu, Leishmania cinsindeki protozoan patojenler gibi daha basit organizmaların kullanılmasıdır. Leishmania sp. insanlarda ve diğer hayvanlarda leishmaniasis'e neden olur. Leishmaniasis, türlere ve diğer faktörlere bağlı olarak kutanöz leishmaniasis'ten (kendi kendini sınırlayan cilt lezyonları) ölümcül viseral leishmaniasis'e (hepatosplenomegali) kadar değişir11. Kutanöz leishmaniasisin etken maddesi olan Leishmania major, insanlara bir kum sineği vektörü aracılığıyla bulaşır ve Leishmania fonksiyonunu ve enfeksiyonunu anlamak için kullanılır12. Ek olarak, Leishmania sp. dijenik12'dir. Amastigotlar olarak adlandırılan hücre içi memeli makrofaj parazitleri ve kum sineği12'de serbest yüzen, kamçılı promastigotlar olarak bulunurlar. L. majör promastigotlar, M199 gibi serum takviyeli ortamlarda yüksek yoğunluklu13'e kadar kültürlenebilir. Promastigotlar ayrıca genetik olarak da izlenebilir; lipid biyosentez yollarını hedefleyenler de dahil olmak üzere birçok gen nakavtı vardır13. Bu nakavtlar, Balb / c farelerinin enfeksiyonu yoluyla büyüme ve enfeksiyon ve lezyon gelişimindeki farklılıklar açısından değerlendirilebilir13.
Leishmania kültürünün göreceli kolaylığına ve lipit biyosentez nakavtlarının aralığına ek olarak, parazit memelilerden daha basit bir genoma sahiptir. Leishmania'nın en iyi karakterize edilen türü, kusurlu lipit metabolizmasına sahip mutantlar gibi birçok mevcut genetik araca sahip olan L. major'dur 14. Özellikle, birçok onarım proteini yoktur. L. major, ekler gibi önemli memeli onarım proteinleri için bugüne kadar tanımlanmış homologlara sahip değildir. Bu, memeli sistemlerinin karmaşıklığı olmadan evrimsel olarak korunmuş onarım yollarının karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, Leishmania'da onarım yolları bugüne kadar karakterize edilmemiştir. Aynı zamanda, MEK yolu6 gibi onarımla ilgili anahtar sinyal yolakları Leishmania sp.15,16'da korunmaktadır, ancak homologların doğrulanması gerekmektedir. Mitojenle aktive edilen protein kinaz (MAPK) yolu, memeli hücrelerinde hücre içi sağkalım ve termostabiliteye katkıda bulunduğu ve metasiklogenezi kontrol ettiği L. mexicana'da iyi çalışılmıştır16. Leishmania sp.'de, 15 MAPK'dan 10'u17 olarak karakterize edilmiştir. LmMAPK9 ve LmMAPK13'ün, korunmuş fosforilasyon dudak dizisindeki kimliğe dayanarak memeli ERK1/2'ye en çok benzeyen olduğu tahmin edilmektedir. Fosforilasyon dudak dizisi hem memeli ERK1/2 hem de LmMAPK9 ve LmMAPK13 için TEY'dir. Bununla birlikte, Leishmania MAPK'ların sekizinde TDY fosforilasyon motifi15 vardır. Leishmania sp., LmxMKK18 ve MEKK ile ilişkili kinaz (MRK1)19'da en az iki MEK homologu tanımlanmıştır. Bu, Leishmania'da tanımlanan içgörülerin memeli sistemlerine dönüşebileceğini düşündürmektedir. Memeli sistemlerine tercüme edilmedikleri yerlerde, leishmaniasis tedavisi için terapötik hedefleri temsil ederler.
L. majör promastigotların membran onarımını ve toksinlerle etkileşimlerini incelemek için kullanılması için, orta verimli tekniklere ihtiyaç vardır. Yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme, etiketli proteinlerin ve membranların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlarken, düşük verimdir ve hücresel sağkalımı ölçmeyebilir. Orta verimli canlılık testleri, akış sitometrisi ile ölçülen boya alımını, mitokondriyal aktivitenin ölçümünü veya laktat dehidrogenaz (LDH) gibi hücresel proteinlerin salınımını içerir. Memeli hücrelerinde, LDH analizleri hücre ölümünü nicel olarak ölçmez20. Ayrıca, LDH salınımı veya mitokondriyal aktivite gibi popülasyon bazlı tahliller, sağlam tek hücreli veya multiparametrik analize izin vermez20. Buna karşılık, akış sitometrisine dayalı analizler multiparametrik tek hücreli analizi mümkün kılar20. Bununla birlikte, bu testler toksin biyolojisini veya L. majör promastigotlardaki toksinlere verilen yanıtları anlamak için uygulanmamıştır.
Bu çalışmada SLO, L. majör'ün sfingolipid null mutantının plazma membran pertürbasyonunu iki farklı tamponda anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır - L. majör promastigotları ve daha basit Tyrode tamponunu kültürlemek için rutin olarak kullanılan M199 ortamı . Orta verimli bir akış sitometri testi tarif edilir ve toksin doz-yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Akış sitometrik tahlilinden elde edilen veriler, LC50 değerlerini belirlemek için lojistik bir eğriye modellenir. Bu bilgiyle, MAPK antikorlarının batı lekelenmesi kullanılarak doğrulanabilmesi için sublitik bir SLO dozu belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>1.2 mL mikrotitre (Marsh) tüpleri</td><td>Fisher</td><td>02-681-376</td><td>Sitotoksisite deneyi</td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Toksin dilüsyonları</td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü ve nbsp;</td><td>Avantor VWR (Radnor, PA)</td><td>89039-666</td><td>Hücreleri ve ortamı tutmak için</td></tr><tr><td>1x Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399</td><td>Hücre işleme için</td></tr><tr><td>%3 H2O2&nbsp;</td><td>Walmart ve nbsp; (Fayetteville, AR)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL 5x M199</td><td>için Cell-gro</td><td>11150067</td><td>L. major promastigotlar için bazal büyüme ortamı</td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini</td><td>Baker</td><td></td><td>Steril koşullarda hücreleri kültürlemek için</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605-100</td><td>Fraksiyon V kabul edilebilir saflık</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510-100</td><td>Stok konsantrasyonu 100 mM</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Termo Fisher&nbsp;</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Kültürden hücreleri peletlemek için</td></tr><tr><td>Cy5 Mono-reaktif boya paketi</td><td>Cytiva (Marlborough, MA)</td><td>PA25031</td><td>Toksinler için florofor etiketi</td></tr><tr><td>Dijital kuru banyo</td><td>Benchmark</td><td>BSH1002</td><td>Protein örneklerini denatüre etmek için</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-100G</td><td>Stok konsantrasyonu 0.5 M</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft (Redmond, VA)</td><td></td><td>Veri analizi yazılım</td></tr><tr><td>Akış sitometresi (4 lazerli Attune NxT)</td><td>Veri toplama için Fisher</td><td></td><td></td> Sitometre</tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD (Ashland, OR)</td><td></td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td>Hücreleri saymak için fiksatif</td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>BP673-1</td><td>Hücreler için seçim maddesi</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td>Seyreltik 1:4 sitometreyi temizlemek için</td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>Fisher</td><td>0267151B</td><td>Hücreleri saymak için</td></tr><tr><td>İnsan kırmızı kan hücreleri</td><td>Zen-bio (Durham, NC)</td><td>SER-10MLRBC</td><td>Toksin aktivitesini doğrulamak için</td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 55i</td><td>Hücreleri görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Fisher</td><td>88018</td><td>Sondalama için antikorlar yoluyla proteinler</td></tr><tr><td>Pipetatörler ve uçlar</td><td>Avantor VWR</td><td></td><td>Reaktifleri dağıtmak için</td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>SDS-PAGE'i çalıştırmak ve transferler için</td></tr><tr><td>Propidyum iyodür</td><td>Biotium</td><td>40016</td><td>Stok konsantrasyonu 2 mg/mL su içinde</td></tr><tr><td>Protein merdiveni</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td>Proteinlerin moleküler ağırlığını belirlemek için</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Koşusu Aparat (Mini Protean III)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-3302</td><td>Proteinleri boyutlarına göre ayırmak için</td></tr><tr><td>Sızdırmazlık bandı</td><td>R& D</td><td>DY992</td><td>Plakaları hücrelerle kapatmak için</td></tr><tr><td>Streptolizin O C530A plazmit eki</td><td></td><td></td><td>pBAD-gIII vektörüne klonlanmış (Referans: 7)</td></tr><tr><td>Streptolizin O C530A toksin</td><td>Laboratuvarı saflaştırılmış</td><td></td><td>Spesifik aktivite&nbsp; 4.34 x 105 HU/mg</td></tr><tr><td>Sallanan kova rotoru</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>75003607</td><td>Hücreleri santrifüjlemek için</td></tr><tr><td>V-alt plaka</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651206</td><td>Sitotoksisite deneyi için</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Benchmark</td><td>BV1000</td><td>Hücreleri karıştırmak için</td></tr><tr><td>Western blot görüntüleme sistemi (Chemi-doc)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Western blot ile proteinleri görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Western Blot Transfer Aparatı (Mini Protean III)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3930</td><td>Transferi proteinlerden nitroselüloza</td></tr><tr><td>Whatman Filtre kağıdı</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-700</td><td>Proteinlerin nitroselüloza transferinde kullanılır</td></tr><tr><td><güçlü>Antikor</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK antikoru</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojileri&nbsp;</td><td>Kedi # 9102S</td><td>Tavşan (1:1000 seyreltme)</td></tr><tr><td>Anti-lipofosfoglikan (LPG) antikoru</td><td>CreativeBioLabs&nbsp;</td><td>Cat# WIC79.3</td><td>Mouse (1: 1000)</td></tr><tr><td>Anti-MEK antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojileri&nbsp;</td><td>Kedi # 9122L</td><td>Tavşan (1:1000)</td></tr> <tr><td>Anti-fare IgG, HRP eşleniği</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>Kedi # 715-035-151</td><td>Eşek (1:10000)</td></tr> <tr><td>Anti-fosfoERK antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojileri&nbsp;</td><td>Cat# 9101S</td><td>Rabbit (1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-pMEK antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojileri&nbsp;</td><td>Kedi # 9121S</td><td>Tavşan (1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG, HRP eşleniği</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>Kedi # 711-035-152</td><td>Eşek (1: 10000)</td></tr> <tr><td>Anti-tubulin antikoru</td><td>Sigma Kedi</td><td># T5168</td><td>Fare (1: 2000)</td></tr> <tr><td>Leishmania majör Genotipler&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Reference: 13</td></tr><tr><td>Epizomal geri dönüş (spt2-/+SPT2)</td><td></td><td></td><td>&Delta; spt2::HYG/&Delta; spt2: PAC / + pXG-SPT2</td></tr><tr><td>Serin palmitoiltransferaz alt birim 2 nakavt (< güçlü>spt2 < / güçlü >)</td><td></td><td></td> <td>& Delta; spt2::HYG/&Delta; spt2::P AC&nbsp;</td></tr><tr><td>Vahşi tip (<güçlü>WT</güçlü>)</td><td></td><td></td><td>LV39 klonu 5 (Rho/SU/59/P)</td></tr></tbody></table>

leishmania major kullanarak gözenek oluşturan toksinlerin moleküler mekanizmasını ve İşlevini deşifre etmek

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

Gözenek oluşturan toksinlerin (PFT'ler) işlevini ve mekanizmasını anlamak zordur, çünkü hücreler PFT'lerin neden olduğu membran hasarına direnir. Biyofiziksel yaklaşımlar gözenek oluşumunu anlamaya yardımcı olurken, genellikle membran lipitlerinin ve proteinlerinin tam tamamlayıcısından yoksun indirgemeci yaklaşımlara güvenirler. Kültürlenmiş insan hücreleri alternatif bir sistem sağlar, ancak onarım mekanizmalarındaki karmaşıklıkları ve fazlalıkları, spesifik mekanizmaların tanımlanmasını zorlaştırır. Buna karşılık, kutanöz leishmaniasis'ten sorumlu insan protozoan patojeni Leishmania major, karmaşıklık ve fizyolojik ilişki arasında optimal bir denge sunar. L. major genetik olarak izlenebilir ve in vitro olarak yüksek yoğunluğa kadar kültürlenebilir ve pertürbasyonların enfeksiyon üzerindeki herhangi bir etkisi yerleşik murin modellerinde ölçülebilir. Ek olarak, L. major , membran dinamiklerini değiştirebilen memeli meslektaşlarından farklı lipitleri sentezler. Membran dinamiğindeki bu değişiklikler, en iyi karakterize toksin ailesinden, kolesterole bağımlı sitolisinlerden (CDC'ler) PFT'lerle araştırılabilir. CDC'ler Leishmania membranındaki ergosterol'e bağlanır ve L. majör promastigotları öldürebilir, bu da L. major'un PFT fonksiyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarını belirlemek için uygun bir model sistem olduğunu gösterir. Bu çalışma, parazit kültürü, lipit duyarlılığını değerlendirmek için genetik araçlar, membran bağlama testleri ve hücre ölümü tahlilleri dahil olmak üzere L. majör promastigotlarda PFT fonksiyonunu test etme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu analizler, L. major'un bir dizi evrimsel olarak farklı organizma ve lipit organizasyonundaki ortaklıklar arasında PFT fonksiyonunu anlamak için güçlü bir model sistem olarak hızlı bir şekilde kullanılmasını sağlayacaktır.

Tyrode tamponunda SLO'ya karşı promastigot hassasiyetinin M199'a kıyasla artması L. majör promastigotların SLO duyarlılığı farklı tahlil tamponları arasında karşılaştırıldı. Vahşi tip, spt2- ve spt2-/+SPT2 promastigotları, bir akış sitometresinde analizden önce 30 dakika boyunca serumsuz M199 veya Tyrode tamponunda SLO ile 30dakika boyunca zorlandı. Analiz için uygun parazitler ileri/yan saçılma profilleri ile tanımlanan tek hücrelerdi (<stro...

Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major'da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.

Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Understanding the function and mechanism of pore-forming toxins (PFTs) is challenging because cells resist the membrane damage caused by PFTs. While ...

Gözenek oluşturan toksinlere karşı direnç mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Protokolümüz, genetik olarak izlenebilir ve fizyolojik olarak ilgili bir sistem olan Leishmania major'u kullanarak gözenek oluşturan toksinlere işlev ve mekanizma sağlar. Sitotoksisite testinin temel avantajı, gerçek zamanlı olarak toksinlerle mücadele edildiğinde orta verimli bir tahlilde tek hücre seviyesinde çoklu fenotiplerin hücre canlılığını karşılaştırmaktır.Amfoterisin B gibi membran pertürbasyon ajanları Leishmania için ön cephe tedavileridir. Bu tahlil, amfoterisin B'yi ve/veya membrana zarar veren yeni ajanları güçlendiren ajanların tanımlanmasını sağlar. Bu tahlil, onarım yanıtlarıyla ilgili onarım yanıtı ve sinyal yolları gibi alanlar hakkında fikir verir.Bu tahlil, Trypanosoma ve Naegleria fowleri gibi protozoanlara uygulanabilir. İnsanlar toksin seri seyreltme serisini anlamakta zorlanırlar. Bu yüzden verebileceğim en iyi tavsiye, deneyi kurmadan önce seri seyreltme serisinin bir şemasını çizmektir.Başlamak için, lekesiz kontrol olarak ayrı bir tüpte 0,5 mililitre işlenmiş promastigot ayırın. Kalan promastigotlara mililitre başına 10 mikrogramlık bir son konsantrasyona mililitre propidium iyodür veya PI başına iki miligram ekleyin. Üç saniye boyunca vorteks.V tabanlı, 96 delikli plaka veya Marsh tüplerinin her bir kuyucuğuna işlenmiş promastigotlar ekleyin ve plakayı veya tüp rafını buzun üzerine yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Her toksinsiz kontrole propidium iyodür içeren 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Renkli olarak daha koyu görünen toplam hacmi 200 mikrolitre olan tüpleri görsel olarak tanımlayarak kontrolün doğru şekilde eklendiğini doğrulayın.En yüksek seyreltmeye toksin hacmini ekleyin. Ardından, toksini seri olarak seyreltin. Pipet, karıştırmayı sağlamak için en az sekiz kez yukarı ve aşağı pinetleyin.En düşük toksin konsantrasyonundan başlayarak, doğru sıraya hızlı bir şekilde 100 mikrolitre toksin ekleyin ve tüm toksin hücrelere eklenene kadar devam edin. Plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatın. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, plakayı paketleyin ve akış sitometresine taşıyın.Veri toplama için, akış sitometresini ve edinme yazılımını üreticinin talimatlarına göre ve tesis politikasına göre kurmakla başlayın. Lekesiz L.major promastigot numunesini kullanarak, ileri ve yan saçılma için kapıları ve seçilen boyalara göre ilk floresan parametrelerini ayarlayın. Tek lekeli kontrolleri kullanarak, canlılık boyası ve floresan olarak etiketlenmiş toksinler için kapıları ayarlayın.Mikrotıklar için zamana karşı ileri saçılımı izleyin ve sitometredeki her örnek için 10.000'den fazla kapılı olay elde edin. Veri analizi için, toplam tek hücreli L.major promastigotları, gerektiğinde ileri ve yan saçılma ve zamana geçit vererek kapılayın. Akış sitometresi için önerilen yükseklik veya alanı kullanın.Ölü hücreleri PI yüksekliğinde tanımlayın ve kapılayın. Analiz için Excel'de doz-yanıt eğrisini düzenleyin. İki teknik çoğaltma arasındaki her koşul için ortalama PI yüksek yüzdesini belirleyin.Toksin konsantrasyonu ve ortalama yüzde spesifik lizisin yanı sıra deneysel detaylar ve / veya ham yüzde PI yüksek hesaplamaları içerir. Dört sütunu daha Modellenmiş, Artıklar, Parametreler ve Parametre Değerleri olarak etiketleyin. İlk sütunların deneysel parametrelere, toksin konsantrasyonuna ve yüzde spesifik lizise karşılık geldiğini doğrulayın.Parametre Değerleri sütununa değerleri girerek L, k ve c parametrelerini başlatın. Modellenmiş sütununda, lojistik modeli oluşturun. Artıklar sütununda, modellenen sayı ile gerçek spesifik lizis arasındaki farkın karesini hesaplayın.Parametre Değerleri sütununda, TOPLA'nın yanında, Artıklar sütunundaki tüm değerleri toplayın. LC50'nin yanındaki Parametre Değerleri sütununda, LC50'yi belirlenen değerlerden hesaplamak için denklemi başlatın. Veri sekmesinden Çözücü'yü açın.Hesaplanan artıkların toplamını içeren hücre olmak üzere ayarlanan hedefi seçin. L, k ve c parametre değerleri için değişken hücrelerini değiştirin.Negatif k değerleri için, k'yi pozitife değiştirmek için negatif olanı k'den faktoring yaparak denklemleri değiştirin. GRG Doğrusal Olmayan Çözme yöntemini kullanın ve Çözümle'yi tıklatın. Eğriyi ve LC50'nin otomatik olarak hesaplandığını kontrol edin.Hem yüzde spesifik lizis hem de toksin konsantrasyonuna karşı modellemeyi grafiksel olarak çizerek uyumu doğrulayın. Sfengolipid eksikliği olan SPT2 nakavt promastigotları, hem serumsuz M199 hem de Tyrode tamponunda SLO'ya duyarlıydı. Wild tip ve SPT2 eklenti geri promastigotlar, serumsuz M199'da SLO'ya dirençliydi, ancak Tyrode tamponunda% 20'den az spesifik lizise sahipti.SPT2 nakavt promastigotları, Tyrode'un tamponundaki SLO'ya M199'dan yaklaşık sekiz kat daha duyarlıydı. Bu veriler, toksin duyarlılığının kullanılan tampona bağlı olarak değişebileceğini göstermektedir. L.major promastigotlarda fosfo-MEK için 120-kilodalton bandı gözlendi.Toplam MEK için, sırasıyla MRK1 ve LmxMKK boyutlarıyla tutarlı olan yaklaşık 120 kilodalton ve 55 kilodalton bantları gözlenmiştir. Fosfo-ERK benzer bantlar tespit ederken, ERK antikor boyaması bu tahlilde sağlam değildi. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, toksinin uygun şekilde kullanılmasını sağlamaktır.Leishmania, plazma membran onarımını incelemek için genetik olarak izlenebilir bir model olarak kullanılabilir ve kum sineği midgutunda Leishmania bakteri etkileşimi sırasında membran onarım mekaniği hakkında yeni bilgiler sağlar.

deciphering-molecular-mechanism-function-pore-forming-toxins-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm...

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Aynı dizide karışık katyonik işlevselliğe sahip peptoidleri sentezlemek için bir protokol sunulmuştur (lizin ve arginin tipi monomerler). Bu bileşiklerin, kutanöz leishmaniasis'e neden olan protozoan parazitler olan Leishmania mexicana'ya karşı daha sonraki testleri de açıklanmaktadır.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada, Leishmania amazonensisile farelerin kutanöz enfeksiyon değerlendirmek için derlenmiş bir protokol sıyoruz. Bu parazit virülans çalışma için güvenilir bir yöntemdir, enfeksiyona omurgalı konak yanıtı sistemik bir görünüm sağlayan.

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.

Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler

Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.

In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi

Keşfedin, Leishmania major kullanarak gözenek oluşturan toksinlerin bağlanma, sitotoksisite ve sinyal mekanizmalarını inceleyen bu protokolü. Sitotoksisite analizi ile hücre canlılığını gerçek zamanlı değerlendirin ve toksin direnci mekanizmalarını keşfedin.

Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Daha fazla video keşfet