Tasarlanmış Kardiyak Dokuların Veri Toplamasını ve Model Verimini İyileştirmek için Bir Biyoreaktör Tasarlama
2 Haziran 2023
Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak biyomühendislik yapılan üç boyutlu kalp dokuları, doğal kardiyak nişin temel yönlerini özetlerken, sağlıklı ve hastalıklı insan miyokardını in vitro incelemek için umut verici modeller olarak ortaya çıkmıştır. Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden üretilen yüksek içerikli tasarlanmış kardiyak dokuların üretilmesi ve analiz edilmesi için bir protokolü açıklamaktadır.
Üç boyutlu kök hücre kaynaklı insan kalp kasının invitro modelimiz, laboratuvar hayvanı testleriyle ilişkili türler arası farklılıkları ortadan kaldırırken, geleneksel iki boyutlu hücre kültürünün biyolojik doğruluğunu geliştirir. Stabil post izleyicilere sahip çok dokulu biyoreaktör tasarımımız, doku başarısını en üst düzeye çıkarır ve tasarlanmış kalp dokusu fonksiyonunun derinlemesine karakterizasyonunun doğruluğunu artırır. Kalp yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam ederken, tasarlanmış kalp dokularımız araştırmacıların insan kalp hastalıklarını modellemesine ve potansiyel tedavileri taramasına olanak tanır.
Başlamak için, direk delikleri üçgen rafların karşısındaki ölü alanla aynı hizaya gelecek şekilde döküm tutucuya dört alüminyum negatif ana döküm yerleştirin. Cihazı iki paralel braket arasına yerleştirin ve cl sıvı PDMS'nin sızmasını önlemek için conta olarak 0,5 milimetre kalınlığında silikon kaplamadan oluşan dikdörtgen bir parça kullanarak kenarları birbirine bağlayın. Sığ bir kapta, 0,5 mililitre PDMS sertleştirme maddesini beş mililitre PDMS elastomer tabanı ile bire 10 oranında karıştırın ve beş dakika kuvvetlice karıştırın.
PDMS karışımını, kabarcıklar kaybolana kadar güçlü bir vakum altında bir vakum odasında gazını alın. Ardından, PDMS karışımını döküm aparatına dökün ve her bir yuvanın tam olarak kaplanmasını sağlamak için aşırı doldurun. PDMS raflarının gövdesine, her bir rafın benzersiz bir şekilde tanımlanması için direklerin karşısındaki tarafa küçük renkli cam boncuklar ekleyin.
Yatay olarak tesviye edilmiş döküm aparatını en az 12 saat boyunca güçlü bir vakum altında vakum odasına yerleştirin. Hassas direklerin tam kürlenmesini ve maksimum mukavemetini sağlamak için PDMS'nin oda sıcaklığında 48 saat boyunca tozdan uzakta kürlenmesine izin verin. cl'yi çıkarınamp, braketler ve silikon kaplama döküm aparatından.
Paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı kullanarak, döküm aparatının ve çerçeve desteklerinin üstündeki PDMS filmini kesin. PDMS raflarını döküm tutucunun kenarlarından ayırmak için parmaklarınızı kullanın. Döküm ile döküm tutucu arasındaki ölü boşluğa körelmiş bir paslanmaz çelik tıraş bıçağı sokun ve ölü alanı dolduran PDMS'nin döküm tutucuda kalmasını sağlayarak bunları kaldırın.
Ardından, keskin bir paslanmaz çelik bıçak kullanarak, kalan PDMS filmlerini ve ölü boşluk PDMS'yi direklerin uçlarından kesin. Parmaklarınızı kullanarak, PDMS rafını direklerin karşısındaki taraftaki kalıptan yavaşça ayırın. Direkler ana dökümlerden kurtulana kadar taraf değiştirmeye devam edin.
Daha önce gösterildiği gibi tüm PDMS raflarını ve direklerini serbest bırakın ve raflarda kalan fazla PDMS'yi kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın. Termoplastik kaynaşmış biriktirme modelleme 3D yazıcı kullanarak, sabit post tracker veya SPoT döküm aparatının bileşenlerini yazdırın. 3D baskılı parçalar arasında ve PDMS rafları ile üç uçlu aparat arasında güvenli bir pres oturduğundan emin olun.
Ayrıca, PDMS raflarının, direklerin bükülmeden kuyuların dibine ulaşmasıyla sıkıca oturduğunu onaylayın. 0,5 mililitre siyah PDMS A kısmı ile 0,5 mililitre B kısmını küçük bir tartı teknesinde veya sığ bir kapta, çözeltinin rengi homojen olana kadar karıştırın. Karışık siyah PDMS'yi bir vakum odasında 20 dakika boyunca güçlü bir vakum altında gazdan arındırın.
Delikleri doldurmak için gazı alınmış siyah PDMS'yi 3D baskılı tabana dökün ve kabarcık kalmadığından emin olmak için hafifçe vurun. Tabandan mümkün olduğunca fazla PDMS'yi kazıyın. Üç uçlu parçayı tabana oturtun ve PDMS raflarını üç uçlu jig üzerindeki oluklara yerleştirin, böylece direklerin uçlarının dairesel kuyulardaki siyah PDMS'ye dalmasını sağlayın.
Siyah PDMS'nin oda sıcaklığında 48 saat tozdan uzakta kürlenmesine izin verin. Direklerdeki gerilimi en aza indirerek üç uçlu parçayı dışarı kaydırın. Küçük forseps kullanarak, her bir SPoT'yi çevreleyen ince siyah PDMS filmini kazıyın, ardından 3D baskılı tabandan kurtarmak için ince uçlu, bükülmüş forsepsleri SPoT kuyusuna yerleştirin.
SPoT'leri inceleyin ve ince vannas makası kullanarak döküm işleminden kalan siyah PDMS filmini kesin. PDMS raflarını polys cep telefonu çerçevesine takarak ve ardından bunu siyah taban plakasına kaydırarak bitmiş direklerin doğru uzunlukta olduğundan emin olun. Biyoreaktörü otoklavladıktan ve hücre karışımını hazırladıktan sonra, hECT'leri üretmeye devam edin.
Steril eldivenler giyerek, biyoreaktör parçalarını içeren otoklavlanmış torbadan siyah taban plakasını çıkarın ve kuyucukları yukarı bakacak şekilde 60 mililitrelik bir tabağa yerleştirin. Kabarcıkların oluşmasını önlemek için 44 mikrolitre hücre karışımını her bir kuyucuğa yavaşça pipetleyin. Yeni bir çift steril eldiven giyerek, PDMS rafları ile polisülfon çerçeveyi otoklav torbasından çıkarın.
Çerçeveyi, çerçevenin uçları taban plakasının ucundaki oluklara oturacak şekilde taban plakasına indirin. Direklerin düz olduğundan ve çerçevenin eğilmediğinden emin olarak, biyoreaktörü 60 milimetrelik bir çanağa yerleştirin. HEKT'ler katılaştıkça nemi artırmak için 60 mililitrelik tabağa kardiyomiyosit bakım ortamında bir mililitre% 10 FBS ekleyin.
Çanağı kapaksız olarak yüksek profilli 100 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve 100 milimetrelik bir tabak kapağıyla örtün, ardından kollajenin süspansiyondaki hücrelerle bir jel oluşturmasını sağlamak için biyoreaktörü 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne geri koyun. İki saat sonra, çanağı inkübatörden çıkarın. Kardiyomiyosit bakım ortamına 13 mililitre %10 FBS ekleyin, ortamın PTFE taban plakası ile PDMS rafları arasında akmasına izin vermek için çanağı eğin.
Biyoreaktörde hava kabarcığı olup olmadığını yandan kontrol edin ve çanağı inkübatöre geri koyun. Hava sıkışırsa, kabarcığın kırılmasına izin vermek için biyoreaktörü ortamdan dışarı eğin ve yavaşça tekrar indirin veya direkleri rahatsız etmeden havayı sifonlamak için jel yükleme uçlu bir mikro pipet kullanın. Çerçevedeki pencereden hECT sıkıştırmasını kontrol edin.
24 ila 96 saat boyunca, hECT'ler sıkışır ve opak hale gelir. hECT'ler orijinal çapa kıyasla en az %30 sıkıştırıldığında taban plakasını çıkarın. Biyoreaktörü içeren 60 milimetrelik kabı, sıvı çanağın dudağı ile akana kadar kardiyomiyosit bakım ortamı ile doldurun ve 60 milimetrelik yeni bir kaba 14 mililitre ekleyin.
Steril eldiven giyerken, biyoreaktörü, taban plakası üstte olacak şekilde çanağında ters çevirin. Sıkışmış hava kabarcıklarını kontrol ettikten sonra, taban plakasını düz tutarak yavaşça kaldırın. Gönderi ipuçlarının odakta olduğundan emin olun.
Eşik anahtarını açın ve SPoT'ler güzel bir şekilde ayrılana ve hECT daraldıkça şekil değiştirmeyene kadar kaydırıcıyı ayarlayın. SPoT'lerden birinin çevresine bir dikdörtgen çizmek için dikdörtgen aracını kullanın ve SPoT'nin her zaman dikdörtgenin sınırları içinde kalmasını sağlamak için SPoT'nin etrafındaki dikdörtgen konumunu ayarlamak için yazı sınırları kutusunun içindeki bir tane ayarla düğmesine tıklayın. İşlemi diğer gönderiye tekrarlayın ve ikinci setin altına kaydedin.
Programın daha küçük nesneleri izlemesini önlemek için nesne boyutu ayarlarını yapın ve her dikdörtgende izlenen nesne sayısının sabit kalmasını sağlayın. Arayüz, izlenen nesneler arasındaki ölçülen mesafeyi gerçek zamanlı olarak gösterir. Gürültüyü izlemek için bu grafiği kullanın.
Pacing frekansı hertz başlığı altında, istenen frekans aralığını ve minimumdan maksimuma adım atmak için istenen aralığı belirtin. Sağdaki kutularda, hECT'nin yeni ilerleme hızı frekansına uyum sağlamasına izin vermek için istediğiniz ayar süresini seçin, ardından kayıt süresini ve ilerleme hızı voltajını belirtin. Programı başlat düğmesine tıklayarak programı başlatın.
Bir frekanstan gelen veriler kaydedildikten sonra, maksimum frekansa ulaşılana kadar yeni bir kayıt için stimülatör frekansını istenen aralıkta artırın. HKT'lerin temsili görüntüleri, SPoT'ler olmadan ve SPoT'lerle oluşturulmuş, alttan görüntülendiği gibi burada gösterilmektedir. SPoT'ler, veri toplama sırasında izlenecek tek bir tanımlanmış şekil sağladı.
Bazı aşırı durumlarda, izleme nesnesi bile gizlendi. Optik izleme ve gürültü azaltma için daha güvenilir bir şekil, zayıf dokuların bir mikro Newton kadar düşük bir kuvvetle ölçülmesini sağladı. SPoT'ler, hECT kaybını önleyen bir kapak geometrisi sağladı.
Ölçülen hECT fonksiyonu, ısıtılmış aşama ile mevcut pacing kurulumunda uzatılmış kültür süresi boyunca stabildi. Fizyolojik sıcaklıktaki ölçümlerle karşılaştırıldığında, hEKT'ler oda sıcaklığında daha yavaş kasılma ve gevşeme oranları ile değişen kasılma dinamikleri gösterdi. Daha yüksek frekanslarda, hEKT'ler oda sıcaklığında daha zayıf olma eğilimindeydi.
Daha düşük frekanslarda, hECT'ler oda sıcaklığında daha güçlü olma eğilimindeydi. 36 santigrat derecede tempolu olduğunda, hECT'ler daha yüksek bir spontan vuruş hızına ve daha geniş bir yakalama frekansı aralığına sahipti. Sıcaklık kontrollü ortam, ölçülen hECT fonksiyonunun fizyolojik uygunluğunu sağlar.
Ek olarak, çok dokulu biyoreaktörün paylaşılan ortam banyosu, farklı hücresel bileşimlerin hEKT'leri arasında parakrin sinyalleme çalışmalarını kolaylaştırır. SPoT'lerin çok dokulu biyoreaktörümüze eklenmesi, araştırmacıların anormal derecede yüksek veya düşük gerilimli hastalıklı miyokardları verimli bir şekilde incelemelerine olanak tanır, aksi takdirde kapaksız direklerin uçlarından kayar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak üç boyutlu kalp dokularının oluşturulması için bir protokol sunar. Bu mühendislik dokuları, insan kalp rahatsızlıklarını in vitro çalışmak için gelişmiş modeller olarak hizmet eder ve doğal kalp ortamını yakından taklit eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyomühendislik
- Kardiyoloji
- Kök Hücre Araştırması
Arka Plan
- Geleneksel iki boyutlu hücre kültürleri biyofideliteden yoksundur.
- Hayvan modellerindeki türler arası farklılıklar araştırma sonuçlarını etkileyebilir.
- Kalp yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerindendir.
- İnsan kalp hastalıklarını incelemek için daha iyi in vitro modellere ihtiyaç vardır.
Çalışmanın Amacı
- Yüksek içerikli mühendislik kalp dokularını üretmek.
- Bu dokuların işlevselliğini analiz etmek.
- İnsan kalp hastalıklarını modellemek ve tedavileri taramakta platform sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çok dokulu biyoreaktör tasarımının kullanımı.
- Doku başarısı için stabil post takipçilerin uygulanması.
- Doku üretimi için PDMS elastomer tabanı ve kürleme maddesinin karıştırılması.
- Mühendislik yapılmış kalp dokusu işlevinin karakterizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Geleneksel kültürlere kıyasla geliştirilmiş biyofidelite.
- Kalp dokusu işlevini karakterize etmede daha yüksek doğruluk.
- İnsan kalp hastalıklarını etkili bir şekilde modelleme potansiyeli.
- Kalp rahatsızlıkları için terapötik seçeneklerin taranmasını kolaylaştırma.
Sonuçlar
- Mühendislik yapılmış kalp dokuları, kalp araştırmalarında önemli bir ilerlemeyi temsil eder.
- Bu modeller, in vitro çalışmalar ve klinik uygulamalar arasındaki boşluğu doldurabilir.
- Gelecek araştırmalar, kalp hastalıklarının daha iyi anlaşılması ve tedavisi için bu dokuları kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Robust engineered cardiac tissue models are critical for improving predictive confidence in preclinical cardiac research and drug discovery. The described bioreactor system with stable post trackers enhances data acquisition fidelity and throughput, directly addressing the need for scalable, physiologically relevant human cardiac models. This capability supports earlier, more reliable decision-making at key inflection points in cardiovascular R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of human cardiac tissue function under controlled, physiologically relevant conditions.
- Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative force measurements from engineered tissues.
- Supports functional target validation and de-risking of cardiac disease hypotheses.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized, reproducible 3D cardiac tissue assays for compound evaluation.
- Improves assay throughput and data quality via parallel culture and stable optical tracking.
- Enables reliable measurement of contractile force and tissue viability across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cardiac models with human physiological parameters, enhancing translational relevance.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by enabling longitudinal functional assessment.
- Allows investigation of paracrine signaling and disease-relevant tissue responses in a shared media environment.
Pipeline & Workflow Integration
This bioreactor system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a scalable platform for functional cardiac tissue analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through quantitative contractility measurements.
- Screening: Delivers reproducible, high-content readouts suitable for compound screening and assay development.
- Analytics: Provides real-time, quantitative force data and stable tracking outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by maintaining physiological temperature and tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Modular SPoT design allows adaptation to existing PDMS post-based systems, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in cardiac target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of engineered tissue assays.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cardiac assets through robust functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering and quantitative functional assessment.
- Needs access to PDMS fabrication, 3D printing, and optical tracking instrumentation.
- Demands cross-team standardization of tissue preparation and data acquisition protocols.
- Adaptable to various cardiac cell sources and disease models with minimal bioreactor modification.
- Practical limitations include tissue fragility and the need for precise environmental control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:43
Bioreactor Fabrication: Casting of the PDMS Rack from the Aluminum Negative Masters
2:14
Bioreactor Fabrication: PDMS Rack Removal from the Aluminum Negative Master Casts
3:28
Bioreactor Fabrication: Stable Post Tracker (SPoT) Fabrication
5:39
Human Engineered Cardiac Tissue (hECT) Fabrication
7:52
Baseplate Removal
8:44
Human Engineered Cardiac Tissue (hECT) Functional Characterization
10:27
Results: Data Acquisition from the Bioreactor
11:53
Conclusion
