Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

Bu protokol, virüslerin doğal evrimi ile mühendislik, çeşitlendirme ve tabakalaşmalarını sağlayarak insan gen terapisi için rekombinant vektörler olarak kullanımları arasındaki önemli bir boşluğu kapatmaktadır. Bu teknik, yeni, izole edilmiş veya tasarlanmış adeno ilişkili virüs, kısaca AAV, varyantları için yüksek verimli paralel taramaya izin verir, böylece hayvan sayılarından, işlerden, maliyetten ve zamandan tasarruf sağlar. Tanımlanan AVV kapsid varyantları, terapötik transgenlerin AAV bazlı verilmesinin etkinliğini ve özgüllüğünü artırabilir, böylece gerekli viral dozu azaltabilir.

Bu, gen terapisinin güvenliğini ve uygulanabilirliğini artırabilir. Aynı yaklaşım, biyolojilerini ve gen terapisinde kullanımlarını anlamamızı geliştiren diğer gen dağıtım araçlarının kapsid veya promotör mühendisliği için de kullanılabilir. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak doktora öğrencileri Jonas Becker ve Jixin Liu, doktora sonrası Joanna Szumska ve Margarita Zayas'ın yanı sıra laboratuvarımdan araştırma görevlileri Emma Gerstmann ve Ellen Widtke olacak.

Python 3 ve Biopython ile NGS sıralama verilerini analiz ederek başlayın. NGS analizi iki adımdan oluşmaktadır. İlk adım için, birinci komut dosyasını ve gereken bilgileri sağlayan bir yapılandırma dosyasını kullanarak yan sıralar, uzunluk ve konum gibi belirli ölçütleri karşılayan diziler için sıra dosyalarında arama yapın.

İkinci adım için, AGWGGC dizisinden başlayarak ayıklanan dizileri iki numaralı komut dosyasını, yapılandırmayı ve zuordnung'u kullanarak çevirin. Gerekli bilgileri sağlayan txt dosyaları. İki klasör hazırlayın: komut dosyası ve veri.

Sıralamadan kaynaklanan Gzip sıkıştırılmış dosyaları veri klasörüne kopyalayın. Ardından Python ve yapılandırma dosyalarını metin makalesinde açıklandığı gibi komut dosyası klasörüne kopyalayın. Komut dosyalarını çalıştırmadan önce zuordnung'u açın.

txt dosyasına kaydedin ve iki sekmeyle ayrılmış sütun ekleyin. Gzip dosyalarının adlarını birinci sütuna ve istediğiniz son adı ikinci sütuna girin. Yapılandırma dosyasındaki değişkenleri metin makalesinde açıklandığı gibi değiştirin.

Belirli komutu kullanarak varyant dizisi algılama ve ayıklama işlemini başlatın. Çıktı, çıkarılan DNA dizileri ve okuma sayıları ile TXT dosyaları olacaktır. Bu dosyanın başlığı istatistiksel veriler içerir ve bu veriler aşağıdaki dosyalara aktarılır.

Bu TXT verileri, DNA dizilerinin çevrildiği, sıralandığı ve analiz edildiği iki numaralı komut dosyası için giriş dosyası olacaktır. Özel komutu kullanarak, metin makalesinde açıklandığı gibi birinci komut dosyasının PV çevirisini ve metin çıktı dosyalarının analizini başlatın. İki numaralı komut dosyasının çıktı dosyaları, zuordnung'daki arama tablosunun ikinci sütunu kullanılarak adlandırılacaktır.

Analiz türüne göre uzantılara sahip TXT. Üç çıktı dosyasının ilk satırlarda istatistiksel veriler içerdiğinden ve giriş metin dosyalarından her DNA dizisinin dizinini içeren bir ilk sütun içerdiğinden emin olun. Kalan sütunlar DNA dizisi, okuma sayısı, ileri veya geri okuma ve çevrilmiş peptid dizisinden oluşmalıdır.

Geçersiz diziler NA'ya sahip olmalı ve son iki sütunda geçerli olmamalıdır. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre mevcut yazılımları kullanarak çıktı dosyalarını görselleştirin. Python 3'te özel kod kullanarak NGS sıralama verilerinin analizini gerçekleştirmek için iş akışı, yan diziler, uzunlukları ve konumları tarafından yönlendirilen barkod dizilerinin algılanmasının yanı sıra barkod zenginleştirme ve doku kümesi üzerindeki dağılımın analizini içerir.

İki klasör hazırlayın: komut dosyası ve veri. Sıralamadan kaynaklanan Gzip sıkıştırılmış dosyaları veri klasörüne kopyalayın. Ardından python ve yapılandırma dosyalarını metin makalesinde açıklandığı gibi komut dosyası klasörüne kopyalayın.

Komut dosyasını çalıştırmadan önce, sekmeyle ayrılmış iki metin dosyası oluşturun: capsidvariance. AAV kapsid varyant adlarına atanan barkod dizilerini ve kontaminasyonu içeren txt dosyası. Olası kontaminasyondan kaynaklanan barkod dizilerini içeren TXT dosyası.

Son olarak, yapılandırma dosyasını, sıralama verilerini, barkodların yan bölgelerinin sırasını, konumlarını ve barkod algılama için pencere boyutunu içeren klasör yolunun bilgilerini içerecek şekilde düzenleyin. İlgili komutu kullanarak barkod algılama komut dosyasını sağlanan yollar ve yapılandırma dosyalarıyla yürütün. Bu komut yürütmenin çıktısı, kapsid değişkeni başına yeniden sayımları ve ham verilerden kurtarılan toplam okuma sayısını içeren TXT dosyaları olacaktır.

Zuordnung'da barkodlu AAV kapsidin dokular veya organlar arasındaki dağılımını değerlendirmek. txt dosyasında, barkod algılama çalıştırmasından elde edilen her metin dosyasının adını bir doku veya organ adına atayın. İlk sütuna metin dosyalarının adlarını ve sekmeyle ayrılmış atamaya karşılık gelen doku veya organ adlarını ekleyin.

Bir organ oluşturun. Zuordnung atamasında verilen adlara karşılık gelen hedef ve hedef dışı organların adlarının listesini içeren txt dosyası. txt dosyası.

Ardından normalization_organ oluşturun. txt ve normalization_variant. TXT sekmesi, tüm kapsid varyantları ve tüm organ ve dokular için normalleştirilmiş değerlere sahip metin dosyalarını ayırdı.

İlk sütunda normalization_organ. txt dosyasında, her organ için verilen isimleri ve ilgili doku için normalizasyon değerlerini içeren ikinci sütunu yazın. normalization_variant ilk sütununu doldurun.

Kapsid adlarının listesini içeren txt dosyası ve havuza alınmış kitaplıktaki her kapsid için okuma sayılarının normalleştirilmiş değerlerini içeren ikinci sütun. Tüm ek dosyaların tam yollarını belirterek yapılandırma dosyasını düzenleyin ve bu özel komutu kullanarak barkod analizi komut dosyasını yürütün. Barkod analizi komut dosyası, daha önce açıklanan çoklu normalleştirme adımlarına dayalı olarak farklı dokulardaki kapsid dağılımının göreceli konsantrasyonuna veya RC değerlerine sahip metin dosyaları ve metin dosyası verilerini birleştirilmiş matris verilerinde birleştiren elektronik tablo dosyası gibi çeşitli dosyaların çıktısını alır.

Verileri görselleştirin ve metin makalesinde açıklandığı gibi matris verilerinin küme analizini gerçekleştirin. Komut dosyası göreceli konsantrasyonu girecektir. XLS dosyaları ve hiyerarşik küme ısı haritası ve ana bileşen analizi iki grafik oluşturun.

Grafikleri veya PNG parametrelerini değiştirmek için R betiğini açın ve yorum bölümündeki yönergeleri izleyin. AAV2 rep geninin niceliklendirilmiş bölgeleri,% 99.2'sinin ITR için pozitif olduğunu gösterdi, bu da AAV kapsidlerinin tüm viral genomları içerdiğini düşündürdü. Her üç kümede de, kitaplığa özgü imza dizilerine dayalı olarak ayıklanan okumalar, toplam okumaların yaklaşık% 94'ünü temsil ediyordu ve bu da iyi kaliteyi gösteriyordu.

Bunların% 99'undan fazlası geçerli PV okumalarıydı ve geçerli PV okumalarının% 99'undan fazlası benzersizdi, bu da kütüphanenin yüksek iç çeşitlilikle dengelendiğini gösteriyordu. Isı haritası hiyerarşisinin iki ana dalı, kapsid varyantlarının transdüksiyon verimliliğindeki farkı yansıtıyordu. Kapsid varyantlarının çoğunluğuna sahip sol dal, çoğu dokuda yüksek bir göreceli konsantrasyon değeri gösteren tüm kapsidleri içeriyordu.

Çarpıcı derecede yüksek karaciğer özgüllüğünün yanı sıra, diğer üç kapsid diyafram, iskelet kası, biseps ve beyinde özgüllük sergiledi. Hiyerarşik kümelemenin sağ dalı, duodenum ve pankreasta en belirgin olan genel olarak daha düşük transdüksiyon verimliliğine sahip kapsid varyantlarını içeriyordu. Orijinal alt küme için ana bileşen analizi, yüksek karaciğer özgüllüğüne sahip kapsid varyantları kümesini oluşturur ve VAR60 kapsid olağanüstü kas tropizmini özetler.

Bu protokolü denerken, yazım hatalarına dikkat etmeniz gerekir. Sözdizimi, Windows komut istemini Linux ile karşılaştırıldığında kullanıyorsanız da farklıdır. Yeni AAV varyantlarının tanımlanmasını takiben, terapötik ve translasyonel potansiyelin ölen veya daha büyük bir hayvan modelinde doğrulanması gerekir.

Bu teknik, AAV varyantlarının aynı koşullar altında doğrudan yan yana karşılaştırılmasını sağlar ve son derece çok yönlüdür, büyük hayvanlarda ve hatta insanlarda çevirisinin yolunu açar.