Name: Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin yeni nesil gen terapisi vektörlerinin mühendisliğini ve AAV kapsid varyantlarının yüksek verimli taramasını. Bu yöntem, spesifikliği artırarak viral dozu azaltır ve gen tedavisinin güvenliğini iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.G., DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezleri SFB1129 (Projektnummer 240245660) ve TRR179 (Projektnummer 272983813) aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG) ve Alman Enfeksiyon Araştırma Merkezi'nin (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues%2C+as+pipeline+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li>
<li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).</li>
<li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification%2C+Rational+Design+and+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756(2022).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li>
<li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075(2014).</li>
<li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li>
<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li>
<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
<li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).</li>
<li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li>
<li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li>
<li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).</li>
<li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li>
<li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li>
<li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li>
<li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li>
<li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li>
<li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).</li>
<li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNABarcodes%3A+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).</li>
<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
<li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+design%3A+A+Goldilocks+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
</ol>

D.G., AaviGen GmbH'nin kurucu ortaklarından biridir. D.G. ve K.R., bağışıklıktan kaçan AAV kapsid varyantlarının üretilmesiyle ilgili bekleyen bir patent başvurusunda mucitlerdir. Yazarların geri kalanının açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokolde, peptid gösterimi AAV kapsid mühendisliği ve barkodlu AAV kütüphane taramasının yanı sıra kütüphane kompozisyonunun ve kapsid performansının biyoinformatik analizi için gerekli adımlar özetlenmiştir. Bu protokol, bu tür kütüphanelerin biyoinformatik analizini kolaylaştıran adımlara odaklanmaktadır, çünkü çoğu viroloji laboratuvarı, moleküler biyoloji tekniklerindeki yeterliliklerine uyacak şekilde programlama becerilerinde gecikmektedir. Her iki kütüphane türü de girişte belirtildiği gibi literatürde kapsam...

Gen transfer terapisi, hastalığı önlemek, tedavi etmek, iyileştirmek veya iyileştirmek için hücresel genetik materyali onarmak, değiştirmek veya değiştirmek için hücrelere genetik materyalin sokulmasıdır. Hem in vivo hem de ex vivo gen transferi, viral olmayan ve viral olan farklı dağıtım sistemlerine dayanır. Virüsler, hedef hücrelerini verimli bir şekilde dönüştürmek için doğal olarak evrimleşmiştir ve dağıtım vektörleri olarak kullanılabilir. Gen terapisinde kullanılan farklı viral vektör türleri arasında, adeno ilişkili virüsler, patojenite, güvenlik, düşük immünojenite eksikliği ve en önemlisi uzun vadeli, entegre olmayan ekspresyonu sürdürme yetenekleri nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır 1,2,3. AAV gen tedavisi son on yılda önemli başarılar sağlamıştır; Avrupa İlaç Ajansı ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından insanlarda kullanılmak üzere üç tedavi onaylanmıştır 3,4. Hemofili, kas, kalp ve nörolojik hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için başka yerlerde gözden geçirildiği gibi çeşitli klinik çalışmalar da devam etmektedir3. On yıllardır süren ilerlemeye rağmen, gen terapisi alanı son yıllarda bir dizi aksilik yaşamıştır4, en önemlisi klinik çalışmalarda ölümler5, özellikle kas gibi büyük veya beyin gibi ulaşılması zor dokular için doz sınırlayıcı toksisiteler nedeniyle beklemeye alınmıştır6.
Şu anda klinik çalışmalarda kullanılmakta olan AAV vektörleri, birkaç istisna dışında doğal serotiplere aittir1. AAV mühendisliği, üstün organ veya hücre özgüllüğü ve verimliliğine sahip vektörler geliştirme fırsatı sunar. Son yirmi yılda, peptid gösterimi, döngü değişimi, kapsid DNA karıştırma, hataya eğilimli PCR ve hedefli tasarım gibi çeşitli yaklaşımlar, farklı özelliklere sahip bireysel AAV varyantları veya kütüphaneleri oluşturmak için başarıyla uygulanmıştır7. Bunlar daha sonra, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, istenen özelliklere sahip varyantları seçmek için birden fazla yönlendirilmiş evrim turuna tabi tutulur 1,3. Tüm kapsid evrim stratejileri arasında, peptid görüntüleme AAV kütüphaneleri, bazı benzersiz özelliklerden dolayı en yaygın kullanılanı olmuştur: üretilmeleri nispeten kolaydır ve evrimlerini takip etmelerini sağlayan yüksek çeşitlilik ve yüksek verimli dizileme elde edebilirler.
İlk başarılı peptit yerleştirme AAV kütüphaneleri yaklaşık 20 yıl önce tanımlanmıştır. İlklerinden birinde, Perabo ve ark.8 , rastgele üretilen oligonükleotidlerin bir havuzunun, VP1 kapsid proteininin amino-asit 587'sine karşılık gelen bir pozisyonda, kapsidden çıkıntı yapan üç katlı eksende bir plazmid içine yerleştirildiği modifiye AAV2 kapsidlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmuştur. Adenovirüs ko-enfeksiyonu kullanılarak, AAV kütüphanesi çoklu seçim turları yoluyla geliştirildi ve son yeniden hedeflenen varyantların, ebeveyn AAV28'e dirençli hücre hatlarını dönüştürebildiği gösterildi. Bundan kısa bir süre sonra, Müller ve ark.9 , kütüphane üretimi için protokolde önemli bir gelişme olan iki aşamalı sistemi tanıttı. Başlangıçta, plazmid kütüphanesi, bir adenoviral yardımcı plazmid ile birlikte, kimerik kapsidler içeren bir AAV kütüphanesi üretmek için kullanılır. Bu AAV mekik kütüphanesi, hücre başına bir viral genom tanıtmak amacıyla, düşük enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Adenovirüs ile birlikte enfeksiyon, eşleşen bir genom ve kapsid9 ile AAV'lerin üretimini sağlar. Yaklaşık on yıl sonra, Dalkara10 , 7m8 varyantını oluşturmak için in vivo yönlendirilmiş evrimi kullandı. Bu varyant, üçü bağlayıcı görevi gören 10 amino asit yerleştirmesine (LALGETTRPA) sahiptir ve intravitreal enjeksiyon10'dan sonra dış retinayı etkili bir şekilde hedefler. Bu mühendislik kapsid, olağanüstü bir başarı öyküsüdür, çünkü şimdiye kadar kliniğe ulaşan birkaç mühendislik kapsidinden biridir11.
Alan, yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinin tanıtılmasıyla ikinci bir artış yaşadı. 2014 yılında Adachi ve ark.12'den ve 2015 yılında Marsic ve ark.13'ten iki yayın, barkodlu AAV kapsid kütüphanelerinin dağılımını yüksek doğrulukla izlemek için NGS'nin gücünü sergiledi. Birkaç yıl sonra, barkodlu bölgelerin NGS'si, kapsid evrimini takip etmek için peptit yerleştirme bölgesine uyarlandı. Körbelin ve ark.14, pulmoner hedefli AAV2 bazlı kapsid tanımlamak için NGS rehberliğinde bir tarama gerçekleştirdi. NGS analizi üç derecelendirme puanının hesaplanmasına yardımcı oldu: seçim turları arasındaki zenginleştirme puanı, doku özgüllüğünü belirlemek için genel özgüllük puanı ve son olarak birleşik puan14. Gradinaru laboratuvarı15, aynı yıl içinde hücre tipine özgü bir seçimi kolaylaştıran Cre-rekombinasyon tabanlı AAV hedefli evrim (CREATE) sistemini yayınladı. Bu sistemde, kapsid kütüphanesi Cre-ters çevrilebilir bir anahtar taşır, çünkü poliA sinyali iki loxP bölgesi tarafından çevrelenir. AAV kütüphanesi daha sonra Cre farelere enjekte edilir, burada poliA sinyali sadece Cre + hücrelerinde ters çevrilir ve kapsid geni içindeki ileri astar ile ters PCR primerinin bağlanması için şablon sağlar. Bu son derece spesifik PCR kurtarma, AAV-PHP'nin tanımlanmasını sağladı. Kan-beyin bariyerini geçebilen B varyantı15. Bu sistem ayrıca NGS ve sentetik kütüphane üretiminin boru hattı16'ya entegre edildiği M-CREATE'e (Multiplexed-CREATE) dönüştürüldü.
Maguire lab17'den bu sistemin geliştirilmiş bir RNA tabanlı versiyonu olan iTransduce, hücreleri işlevsel olarak dönüştüren ve genomlarını ifade eden kapsidlerin DNA seviyesinde seçime izin verir. Peptid görüntüleme kütüphanesinin viral genomu, her yerde bulunan bir promotörün kontrolü altındaki bir Cre genini ve p41 promotörünün kontrolü altındaki kapsid genini içerir. Kütüphane, tdTomato'nun yukarı akımında bir loxP-STOP-loxP kasetine sahip farelere enjekte edilir. Viral genomu ve dolayısıyla Cre'yi eksprese eden AAV varyantları ile transdübe edilen hücreler tdTomato'yu eksprese eder ve hücre belirteçleri ile kombinasyon halinde sıralanabilir ve seçilebilir17. Benzer şekilde, Nonnenmacher ve ark.18 ve Tabebordbar ve ark.19, kapsid gen kütüphanesini dokuya özgü promotörlerin kontrolü altına yerleştirmiştir. Farklı hayvan modellerinde enjeksiyondan sonra, kapsid varyantlarını izole etmek için viral RNA kullanıldı.
Alternatif bir yaklaşım, capsid kitaplıklarını etiketlemek için barkodlama kullanmaktır. Björklund laboratuvarı20 , bu yaklaşımı barkod peptit yerleştirme kapsid kütüphaneleri için kullandı ve barkodlu rasyonel AAV vektör evrimini (BRAVE) geliştirdi. Bir plazmidde, Rep2Cap kaseti ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR) ile çevrili, sarı floresan protein (YFP) eksprese eden, barkod etiketli transgenin yanında klonlanır. Kapağın sonu ile barkodun başlangıcı arasındaki loxP bölgelerini kullanarak, bir in vitro Cre rekombinasyonu NGS için yeterince küçük bir parça üretir, böylece peptid yerleştirmenin benzersiz barkodla (arama tablosu, LUT) ilişkilendirilmesine izin verir. AAV üretimi plazmid kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilir ve mRNA'da eksprese edilen barkodlar in vivo uygulamadan sonra yine NGS20 ile taranır. Kapsid kütüphaneleri tüm kapsid geninin varyantlarını (yani, karıştırılmış kütüphaneler) içerdiğinde, uzun okunan dizilemenin kullanılması gerekir. Birçok grup, NGS'nin daha yüksek okuma derinliğine sahip olmasını sağlayan bu çeşitli kütüphaneleri etiketlemek için barkodlar kullandı. Kay lab21 , çok çeşitli kapsid karıştırılmış kütüphaneleri, kapak poliA sinyalinin aşağı yönündeki barkodlarla etiketledi. İlk adımda, barkodlu bir plazmid kütüphanesi oluşturuldu ve karıştırılmış kapsid gen kütüphanesi klonlandı. Daha sonra LUT21'lerini oluşturmak için MiSeq (kısa okuma, daha yüksek okuma derinliği) ve PacBio (uzun okuma, daha düşük okuma derinliği) NGS ve Sanger diziliminin bir kombinasyonu kullanıldı. 2019 yılında, Ogden ve Church lab 22'den meslektaşları, her pozisyonda tek nokta mutasyonları, eklemeleri ve silmeleri olan kütüphaneleri kullanarakAAV2 kapsid uygunluğunu tanımladılar ve sonuçta makine rehberliğinde tasarıma olanak sağladılar. Kütüphanenin oluşturulması için, kapsid geninin daha küçük parçaları sentezlendi, bir barkodla etiketlendi, yeni nesil sıralandı ve daha sonra tam kapsid genine klonlandı. NGS verileri bir LUT oluşturmak için kullanıldı. Kütüphane daha sonra sadece barkodlar ve kısa okuma sıralaması kullanılarak tarandı ve bu da daha yüksek okuma derinliği22'ye izin verdi.
Barkodlu kütüphaneler ağırlıklı olarak, kapsid kütüphanelerinin birkaç tur seçimini takiben veya bir kapsid evrimi çalışmasından bağımsız olarak bilinen, doğal ve mühendislik varyantlarından oluşan bir havuzu taramak için kullanılmıştır. Bu tür kütüphanelerin avantajı, hayvan sayısını azaltırken ve hayvanlar arasındaki çeşitliliği en aza indirirken birden fazla kapsid tarama fırsatıdır. Bu teknolojiyi AAV alanına tanıtan ilk çalışmalar neredeyse on yıl önce yayınlandı. Nakai laboratuvarı 12, AAV9'dan VP1'de 356 ila 736 amino asitleri kapsayan 191 çift alanin mutantını bir çift 12-nükleotid barkodla etiketledi. NGS kullanılarak, kütüphane galaktoz bağlama ve diğer özellikler12 için in vivo olarak tarandı. Marsic ve meslektaşları, AAV varyantlarının biyolojik dağılımını, 1 yıl sonra13 çift barkablolu bir analiz kullanarak tanımladılar. İnsan olmayan primatlarda yapılan daha yeni bir çalışma, farklı doğum yolları kullanarak 29 kapsidin merkezi sinir sistemindeki biyodağılımını karşılaştırmıştır23. Laboratuvarımız yakın zamanda doğal ve mühendislik ürünü AAV'leri içeren 183 varyantın barkodlu AAV kütüphane ekranlarını yayınladı. DNA ve RNA seviyesindeki bu ekranlar, farelerde oldukça miyotropik bir AAV varyantı24'ün tanımlanmasına ve fare beyninde yüksek hücre tipi özgüllük gösteren diğerlerine yol açtı25.
Burada, bu çalışmada kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz ve AAV peptid görüntüleme kütüphanelerinin taranmasını içerecek şekilde genişletiyoruz. Bu, AAV2 peptit görüntüleme kütüphanelerinin oluşturulmasını, niceleme için bir dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini ve son olarak kısmen Weinmann ve meslektaşlarının çalışmalarına dayanan AAV varyantlarını analiz etmek için bir NGS boru hattını içerir24. Son olarak, barkodlu AAV kütüphanelerinin neslinin ve aynı yayında kullanılan NGS boru hattının bir açıklaması verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Amplifikasyon primeri</td><td>ELLA Biotech (Münih, Almanya)</td><td>-</td><td>Oligonükleotid ekinin ikinci iplikli sentezi</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reaktifleri</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)</td><td>5067-1504</td><td>DNA fragmanı doğrulaması</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Biyoanalizör Sistemi</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)</td><td>G2938C</td><td>DNA fragmanı doğrulaması</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Takımı&nbsp;</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>80204</td><td>DNA/RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reaktifleri</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)</td><td>5067-1504</td><td>NGS Kütüphanesi hazırlığı</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Biyoanalizör Sistemi</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)</td><td>G2938C</td><td>NGS Kütüphanesi hazırlığı</td></tr><tr><td>BC-seq fw:&nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, ABD)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&nbsp;</td><td>NGS Kütüphanesi hazırlığı</td></tr><tr><td>BC-seq rv:&nbsp; &nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, ABD)</td><td>ggctggcaactagaaggcaca&nbsp;</td><td>NGS Kütüphanesi hazırlığı</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, ABD)</td><td>44-420-3250ML</td><td>DNA/RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)</td><td>R0143</td><td>Çift sarmallı kesici uç</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad'ın sindirimi (Hercules, CA, ABD)1851196</td><td></td> <td>dd-PCR döngüleyici</td></tr><tr><td>dNTPS&nbsp;</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)</td><td>N0447S</td><td>NGS Kütüphanesi hazırlığı</td></tr><tr><td>Problar için ddPCR Supermix (dUTP yok)</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1863024</td><td>dd-PCR süpermiks</td></tr><tr><td>Problar için Damlacık Oluşturma Yağı</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1863005</td><td>dd-PCR damlacık üretim yağı</td></tr><tr><td>QX100 / QX200 Damlacık Jeneratörü Bio-Rad için DG8 Kartuşları</td><td>(Hercules, CA, ABD)</td><td>1864008</td><td>dd-PCR damlacık oluşturma kartuşu</td></tr><tr><td>DG8 Kartuş Tutucu</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1863051</td><td>dd-PCR kartuş tutucu</td></tr><tr><td>Damlacık Jeneratörü DG8 Conta</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1863009</td><td>kartuş için dd-PCR kapağı</td></tr><tr><td>ddPCR Plakaları 96 Kuyulu, Yarı Etekli Bio-Rad</td><td>(Hercules, CA, ABD)</td><td>12001925</td><td>dd-PCR 96 kuyulu plaka</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME Elektroyetkin Hücreler</td><td>Lucigen (Middleton, WI, ABD)</td><td>60081-1</td><td>Elektroyetkin hücreler</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küvetleri, 1mm</td><td>Biozym Scientific (Oldendorf, Almanya)</td><td>748050</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>GAPDH astar/prob karışımı</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Taqman qPCR primer</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1652660</td><td>Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler (Waltham, MA, ABD)</td><td>4368814</td><td>cDNA ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>ITR_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>ITR_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR probu</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500 sistemi</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, ABD)</td><td>SY-415-1001</td><td>NGS Kütüphanesi Sıralama</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td><td>Roche AG (Basel, İsviçre)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>NGS numune hazırlama</td></tr><tr><td>MagnaBot 96 Manyetik Ayırma Cihazı</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, ABD)</td><td>V8151</td><td>NGS kütüphanesi için numune hazırlama</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 spektrofotometre</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)</td><td>ND-2000</td><td>Çift sarmallı kesici ucun sindirimi</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, ABD)</td><td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td><td>NGS astarı</td></tr><tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, ABD)</td><td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td><td>NGS astarı</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 Yüksek Çıkış Kiti (75 döngü)</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, ABD)</td><td>FC-404-2005</td><td>NGS Kitaplık sıralaması</td></tr><tr><td>Düşük Karmaşıklıklı Örnekler Kiti için Ovation Kitaplık Sistemi&nbsp;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, ABD)</td><td>9092-256</td><td>NGS Kütüphane hazırlığı</td></tr><tr><td>PX1 Plaka Kapatıcı&nbsp;</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1814000</td><td>dd-PCR plaka kapatıcı</td></tr><tr><td>Delinebilir Folyo Isı Yalıtımı</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1814040</td><td>dd-PCR sızdırmazlık folyosu</td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA-Polimeraz</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)</td><td>F530S</td><td>Oligonükleotid ekinin ikinci iplikli sentezi</td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfeksiyon Sınıfı Lineer Polietilamin Hidroklorür (MW 40.000)</td><td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, ABD)</td><td>24765-1G</td><td>AAV kütüphane hazırlığı</td></tr><tr><td>ProNex Boyut Seçici Arıtma Sistemi</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, ABD)</td><td>NG2002</td><td>NGS kütüphanesi için numune hazırlama</td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polimeraz&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)</td><td>F549L</td><td>NGS Kütüphane hazırlığı</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Roche AG (Basel, İsviçre)</td><td>5963117103</td><td>DNA / RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>ITR-Rep2Cap2-ITR vektörü. Laboratuvarda üretilen/hazırlanan Cap2 ORF içindeki peptit yerleştirme bölgesi&nbsp;</td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Jeneratörü</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1864002</td><td>dd-PCR damlacık jeneratörü</td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Okuyucu</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)</td><td>1864003</td><td>dd-PCR damlacık analizi</td></tr><tr><td>QIAquick Nükleotid Temizleme Kiti</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>28306</td><td>Oligonükleotid uç saflaştırmasının ikinci iplikli sentezi</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>28704</td><td>Plazmid vektör saflaştırması</td></tr><tr><td>QIAGEN Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>12162</td><td>Plazmit kütüphanesi DNA hazırlığı</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Saflaştırma kiti</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>28104</td><td>NGS kütüphanesi</td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>Invitrogen için numune hazırlama (Waltham, MA, ABD)</td><td>Q32857</td><td>NGS Kütüphane hazırlığı</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)</td><td>Q32851</td><td>NGS Kütüphane hazırlığı</td></tr><tr><td>QuantiFast PCR Master Mix</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>rep_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>rep_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>dd-PCR probu</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen DNaz</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>79254</td><td>DNA/RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)</td><td>R0123</td> Vektör 5 mm, çelik <td>boncukların sindirimi</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>69989</td><td>DNA/RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>TRİMER-oligonükleotidler</td><td>ELLA Biyoteknoloji (Münih, Almanya)</td><td>-</td><td>Dejenere oligonükleotid</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)</td><td>M0202L</td><td>Plazmid kütüphane ligasyonu</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>85600</td><td>DNA/RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>YFP_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>YFP_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, ABD)</td><td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>dd-PCR probu</td></tr><tr><td>Zymo DNA Temiz & Konsantratör-5 (Kapaklı)</td><td>Zymo araştırması (Irvine, CA, ABD)</td><td>D4013</td><td>Vektör ve Ligasyon saflaştırma</td></tr></tbody></table>

yeni nesil gen terapisi vektörlerinin mühendislik, barkodlama ve adeno-İlişkili virüs (aav) kapsid varyantlarının taranması yoluyla İzolasyonu

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Adeno ilişkili virüsten (AAV) türetilen gen dağıtım vektörleri, klinik verilerin teşvik edilmesi ve çeşitli AAV gen tedavilerinin onaylanmasıyla kanıtlanan genetik hastalıkların tedavisi için en umut verici araçlardan biridir. AAV vektörlerinin başarısının iki ana nedeni, (i) farklı özelliklere sahip çeşitli doğal olarak oluşan viral serotiplerin önceden izole edilmesi ve (ii) moleküler mühendisliği için güçlü teknolojilerin daha sonra kurulması ve yüksek verimde yeniden kullanılmasıdır. Bu tekniklerin potansiyelini daha da artırmak, son zamanlarda DNA ve RNA düzeyinde seçilmiş AAV kapsidlerini barkodlamak için stratejiler uygulanmakta ve tek bir hayvandaki tüm ana organlarda ve hücre tiplerinde kapsamlı ve paralel in vivo tabakalaşmalarına izin vermektedir. Burada, mevcut kapsid mühendisliği teknolojilerinin çeşitli cephaneliğini temsil etmek için AAV peptid ekranını kullanarak, bu tamamlayıcı caddeler kümesini kapsayan temel bir boru hattı sunuyoruz. Buna göre, ilk olarak, istenen özelliklere sahip adayların in vivo seçimi için bir AAV peptid görüntüleme kütüphanesinin oluşturulması için önemli adımları açıklıyoruz, ardından ikincil in vivo tarama için en ilginç kapsid varyantlarının nasıl barkodlanacağının bir gösterimi ile devam ediyoruz. Daha sonra, NGS veri analizi sırasında en kritik adımlara genel bir bakışla bitirmeden önce, barkod amplifikasyonu ve adaptör ligasyonu dahil olmak üzere yeni nesil dizileme (NGS) için kütüphanelerin oluşturulmasına yönelik metodolojiyi örneklendiriyoruz. Burada bildirilen protokoller çok yönlü ve uyarlanabilir olduğundan, araştırmacılar en sevdikleri hastalık modelinde ve gen terapisi uygulamalarında optimal AAV kapsid varyantlarını zenginleştirmek için bunları kolayca kullanabilirler.

AAV2 peptit görüntüleme kitaplığının oluşturulması. Mühendislik AAV'lerinin seçimine yönelik ilk adım olarak, bir plazmid kütüphanesinin oluşturulması açıklanmaktadır. Peptit kesici ucu, dejenere primerler kullanılarak üretilir. 64'ten 20'ye kadar olanlardaki kodonların kombinasyonunu azaltmak, DNA üzerindeki kütüphane çeşitliliğini azaltarak ancak protein seviyesini azaltmayarak durdurma kodonları ortadan kaldırma ve NGS analizini kolaylaştırma avantajlarına sahiptir. Oligonükleotid eki, bir PCR reaksi...

AAV peptit görüntüleme kütüphanesi üretimi ve yeni nesil AAV'lerin oluşturulması için yeni özelliklere sahip adayların barkodlaması yoluyla daha sonra doğrulanması.

Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Bu protokol, virüslerin doğal evrimi ile mühendislik, çeşitlendirme ve tabakalaşmalarını sağlayarak insan gen terapisi için rekombinant vektörler olarak kullanımları arasındaki önemli bir boşluğu kapatmaktadır. Bu teknik, yeni, izole edilmiş veya tasarlanmış adeno ilişkili virüs, kısaca AAV, varyantları için yüksek verimli paralel taramaya izin verir, böylece hayvan sayılarından, işlerden, maliyetten ve zamandan tasarruf sağlar. Tanımlanan AVV kapsid varyantları, terapötik transgenlerin AAV bazlı verilmesinin etkinliğini ve özgüllüğünü artırabilir, böylece gerekli viral dozu azaltabilir.Bu, gen terapisinin güvenliğini ve uygulanabilirliğini artırabilir. Aynı yaklaşım, biyolojilerini ve gen terapisinde kullanımlarını anlamamızı geliştiren diğer gen dağıtım araçlarının kapsid veya promotör mühendisliği için de kullanılabilir. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak doktora öğrencileri Jonas Becker ve Jixin Liu, doktora sonrası Joanna Szumska ve Margarita Zayas'ın yanı sıra laboratuvarımdan araştırma görevlileri Emma Gerstmann ve Ellen Widtke olacak.Python 3 ve Biopython ile NGS sıralama verilerini analiz ederek başlayın. NGS analizi iki adımdan oluşmaktadır. İlk adım için, birinci komut dosyasını ve gereken bilgileri sağlayan bir yapılandırma dosyasını kullanarak yan sıralar, uzunluk ve konum gibi belirli ölçütleri karşılayan diziler için sıra dosyalarında arama yapın.İkinci adım için, AGWGGC dizisinden başlayarak ayıklanan dizileri iki numaralı komut dosyasını, yapılandırmayı ve zuordnung'u kullanarak çevirin. Gerekli bilgileri sağlayan txt dosyaları. İki klasör hazırlayın: komut dosyası ve veri.Sıralamadan kaynaklanan Gzip sıkıştırılmış dosyaları veri klasörüne kopyalayın. Ardından Python ve yapılandırma dosyalarını metin makalesinde açıklandığı gibi komut dosyası klasörüne kopyalayın. Komut dosyalarını çalıştırmadan önce zuordnung'u açın.txt dosyasına kaydedin ve iki sekmeyle ayrılmış sütun ekleyin. Gzip dosyalarının adlarını birinci sütuna ve istediğiniz son adı ikinci sütuna girin. Yapılandırma dosyasındaki değişkenleri metin makalesinde açıklandığı gibi değiştirin.Belirli komutu kullanarak varyant dizisi algılama ve ayıklama işlemini başlatın. Çıktı, çıkarılan DNA dizileri ve okuma sayıları ile TXT dosyaları olacaktır. Bu dosyanın başlığı istatistiksel veriler içerir ve bu veriler aşağıdaki dosyalara aktarılır.Bu TXT verileri, DNA dizilerinin çevrildiği, sıralandığı ve analiz edildiği iki numaralı komut dosyası için giriş dosyası olacaktır. Özel komutu kullanarak, metin makalesinde açıklandığı gibi birinci komut dosyasının PV çevirisini ve metin çıktı dosyalarının analizini başlatın. İki numaralı komut dosyasının çıktı dosyaları, zuordnung'daki arama tablosunun ikinci sütunu kullanılarak adlandırılacaktır.Analiz türüne göre uzantılara sahip TXT. Üç çıktı dosyasının ilk satırlarda istatistiksel veriler içerdiğinden ve giriş metin dosyalarından her DNA dizisinin dizinini içeren bir ilk sütun içerdiğinden emin olun. Kalan sütunlar DNA dizisi, okuma sayısı, ileri veya geri okuma ve çevrilmiş peptid dizisinden oluşmalıdır.Geçersiz diziler NA'ya sahip olmalı ve son iki sütunda geçerli olmamalıdır. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre mevcut yazılımları kullanarak çıktı dosyalarını görselleştirin. Python 3'te özel kod kullanarak NGS sıralama verilerinin analizini gerçekleştirmek için iş akışı, yan diziler, uzunlukları ve konumları tarafından yönlendirilen barkod dizilerinin algılanmasının yanı sıra barkod zenginleştirme ve doku kümesi üzerindeki dağılımın analizini içerir.İki klasör hazırlayın: komut dosyası ve veri. Sıralamadan kaynaklanan Gzip sıkıştırılmış dosyaları veri klasörüne kopyalayın. Ardından python ve yapılandırma dosyalarını metin makalesinde açıklandığı gibi komut dosyası klasörüne kopyalayın.Komut dosyasını çalıştırmadan önce, sekmeyle ayrılmış iki metin dosyası oluşturun: capsidvariance. AAV kapsid varyant adlarına atanan barkod dizilerini ve kontaminasyonu içeren txt dosyası. Olası kontaminasyondan kaynaklanan barkod dizilerini içeren TXT dosyası.Son olarak, yapılandırma dosyasını, sıralama verilerini, barkodların yan bölgelerinin sırasını, konumlarını ve barkod algılama için pencere boyutunu içeren klasör yolunun bilgilerini içerecek şekilde düzenleyin. İlgili komutu kullanarak barkod algılama komut dosyasını sağlanan yollar ve yapılandırma dosyalarıyla yürütün. Bu komut yürütmenin çıktısı, kapsid değişkeni başına yeniden sayımları ve ham verilerden kurtarılan toplam okuma sayısını içeren TXT dosyaları olacaktır.Zuordnung'da barkodlu AAV kapsidin dokular veya organlar arasındaki dağılımını değerlendirmek. txt dosyasında, barkod algılama çalıştırmasından elde edilen her metin dosyasının adını bir doku veya organ adına atayın. İlk sütuna metin dosyalarının adlarını ve sekmeyle ayrılmış atamaya karşılık gelen doku veya organ adlarını ekleyin.Bir organ oluşturun. Zuordnung atamasında verilen adlara karşılık gelen hedef ve hedef dışı organların adlarının listesini içeren txt dosyası. txt dosyası.Ardından normalization_organ oluşturun. txt ve normalization_variant. TXT sekmesi, tüm kapsid varyantları ve tüm organ ve dokular için normalleştirilmiş değerlere sahip metin dosyalarını ayırdı.İlk sütunda normalization_organ. txt dosyasında, her organ için verilen isimleri ve ilgili doku için normalizasyon değerlerini içeren ikinci sütunu yazın. normalization_variant ilk sütununu doldurun.Kapsid adlarının listesini içeren txt dosyası ve havuza alınmış kitaplıktaki her kapsid için okuma sayılarının normalleştirilmiş değerlerini içeren ikinci sütun. Tüm ek dosyaların tam yollarını belirterek yapılandırma dosyasını düzenleyin ve bu özel komutu kullanarak barkod analizi komut dosyasını yürütün. Barkod analizi komut dosyası, daha önce açıklanan çoklu normalleştirme adımlarına dayalı olarak farklı dokulardaki kapsid dağılımının göreceli konsantrasyonuna veya RC değerlerine sahip metin dosyaları ve metin dosyası verilerini birleştirilmiş matris verilerinde birleştiren elektronik tablo dosyası gibi çeşitli dosyaların çıktısını alır.Verileri görselleştirin ve metin makalesinde açıklandığı gibi matris verilerinin küme analizini gerçekleştirin. Komut dosyası göreceli konsantrasyonu girecektir. XLS dosyaları ve hiyerarşik küme ısı haritası ve ana bileşen analizi iki grafik oluşturun.Grafikleri veya PNG parametrelerini değiştirmek için R betiğini açın ve yorum bölümündeki yönergeleri izleyin. AAV2 rep geninin niceliklendirilmiş bölgeleri,% 99.2'sinin ITR için pozitif olduğunu gösterdi, bu da AAV kapsidlerinin tüm viral genomları içerdiğini düşündürdü. Her üç kümede de, kitaplığa özgü imza dizilerine dayalı olarak ayıklanan okumalar, toplam okumaların yaklaşık% 94'ünü temsil ediyordu ve bu da iyi kaliteyi gösteriyordu.Bunların% 99'undan fazlası geçerli PV okumalarıydı ve geçerli PV okumalarının% 99'undan fazlası benzersizdi, bu da kütüphanenin yüksek iç çeşitlilikle dengelendiğini gösteriyordu. Isı haritası hiyerarşisinin iki ana dalı, kapsid varyantlarının transdüksiyon verimliliğindeki farkı yansıtıyordu. Kapsid varyantlarının çoğunluğuna sahip sol dal, çoğu dokuda yüksek bir göreceli konsantrasyon değeri gösteren tüm kapsidleri içeriyordu.Çarpıcı derecede yüksek karaciğer özgüllüğünün yanı sıra, diğer üç kapsid diyafram, iskelet kası, biseps ve beyinde özgüllük sergiledi. Hiyerarşik kümelemenin sağ dalı, duodenum ve pankreasta en belirgin olan genel olarak daha düşük transdüksiyon verimliliğine sahip kapsid varyantlarını içeriyordu. Orijinal alt küme için ana bileşen analizi, yüksek karaciğer özgüllüğüne sahip kapsid varyantları kümesini oluşturur ve VAR60 kapsid olağanüstü kas tropizmini özetler.Bu protokolü denerken, yazım hatalarına dikkat etmeniz gerekir. Sözdizimi, Windows komut istemini Linux ile karşılaştırıldığında kullanıyorsanız da farklıdır. Yeni AAV varyantlarının tanımlanmasını takiben, terapötik ve translasyonel potansiyelin ölen veya daha büyük bir hayvan modelinde doğrulanması gerekir.Bu teknik, AAV varyantlarının aynı koşullar altında doğrudan yan yana karşılaştırılmasını sağlar ve son derece çok yönlüdür, büyük hayvanlarda ve hatta insanlarda çevirisinin yolunu açar.

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt;1 x 1013 vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

Adeno ilişkili virüs, süspansiyon hücre kültüründe üretilir ve çift iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırılır. Toplam virüs verimini artırmak, virüs çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da konsantre etmek için adımlar dahil edilmiştir. Beklenen nihai titreler 1012 viral partikül/mL'ye ulaşır ve klinik öncesi in vivo kullanım için uygundur.

İn Vivo Uygulamalar için İodiksanol Yoğunluk Gradyan Santrifüjü ile Adeno İlişkili Virüsün Süspansiyon Kültürü Üretimi ve Saflaştırılması

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektör genom kopyalarının kesin miktar tayini kritiktir, ancak standart bir protokol henüz oluşturulmamıştır. Bu protokol, saflaştırılmış AAV numunelerinin hazırlanması ve viral genom titresinin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun (dd_PCR) yürütülmesi için doğrulanmış bir yöntemi tanımlar.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Bu protokol, gen tedavisi için mezenkimal kök hücre (MSC) türevli ekstraselülük vezikül biyomimetiklerinin üretilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem tanıtmayı amaçlamaktadır. Nanovezikül, MSC'den türetilen lipid çift katmanlarla sınırlıdır ve lümende ilgi çekici geni taşıyan rekombinant AAV'leri kapsüller. Bu nanovezikül, in vivo gen taşıması için gelişmiş bir vektör sunar.

Gen Taşımayı Artırmak İçin Mezenkimal Kök Hücre Zarı Zarflı Nanoveziküllerin Geliştirilmesi

Keşfedin yeni nesil gen terapisi vektörlerinin mühendisliğini ve AAV kapsid varyantlarının yüksek verimli taramasını. Bu yöntem, spesifikliği artırarak viral dozu azaltır ve gen tedavisinin güvenliğini iyileştirir.

Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu (Video) | JoVE Journal

Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

Daha fazla video keşfet