In Vitro Konjonktival Goblet Hücrelerinde Cinsiyete Dayalı Farklılıkları İnceleme Yöntemi

Birincil kültürde goblet hücresi fonksiyonunu inceleyerek, oküler yüzey sağlığındaki cinsiyete dayalı farklılıkların arkasındaki mekanizmalar hakkında değerli bilgiler ediniyoruz. Hormonları ve östrojenik maddeleri sistemden çıkararak, seks hormonu seviyelerinin daha hassas kontrolünü sağlayarak, halihazırda kurulmuş olan konjonktival goblet hücre birincil kültür yöntemini değiştirdik. Bu değişiklik, bulgularımızın doğruluğunu ve güvenilirliğini artırır.

Hücre içi kalsiyum ölçümü, çeşitli uyaranlar altında goblet hücre fonksiyonunu ve her uyaran tarafından tetiklenen hücre içi sinyal yollarını incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Teknik, oküler alerji, kuru göz hastalığı veya konjonktivit gibi oküler yüzey hastalıkları için ilaç geliştirmeye genişletilebilir. Bu teknik, belirli hormon seviyeleri altında çeşitli moleküllerin goblet hücreleri üzerindeki etkisinin taranmasını kolaylaştırır.

Bu tekniğe yeni başlayan insanlar genellikle konjonktival dokuyu bağ dokusundan ayırmakta zorlanırlar. Tavsiyemiz, dokunun dokusuna ve malzeme özelliklerine çok dikkat etmenizdir. Konjonktiva elastik ve yarı saydam olmalı, bağ dokusu ise genellikle daha açık renkli ve pamuk lifi benzeridir.

Başlamak için, steril bir neşter kullanarak, insan konjonktival dokusunu bir milimetre küp parçalar halinde doğrayın. Altı oyuklu bir plakada, her bir oyuğa bir milimetre tam RPMI ortamı içeren dört parça tohumlayın. Parçaları plakaya sabitlediğinizden emin olun.

Doku parçalarını 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 havada inkübe edin. Kültür ortamını her iki günde bir yenileyin. Tohumlamadan 72 saat sonra, doku tıkacını çıkarın ve kadeh hücreleri% 70 ila 80 birleşmeye ulaşana kadar inkübasyona devam edin.

Daha sonra, hücreleri PBS ile durulayın ve hücreleri plakanın altından ayırmak için% 0.05 Tripsin EDTA ekleyin. Mikroskop altında hücre ayrılmasını gözlemleyin. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini devre dışı bırakmak için tam bir RPMI ortamı ekleyin.

Hücre süspansiyonunu 150 G'de beş dakika santrifüjleyin ve peleti fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ölçümü için hücre süspansiyonunu bir cam tabanlı kültür kabına yeniden tohumlayın. Fura-2 yüklemesi için, kadeh hücreleri içeren cam tabanlı tabağa %0,5 HEPES, %0,5 BSA ve 0,5 mikromolar Fura-2, sekiz mikromolar pluronik asit F127 ve 250 mikromolar sülfinpirazon içeren Krebs-Ringer bikarbonat tamponu ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin ve onları ışıktan koruyun. İnkübasyondan sonra, hücreleri 250 mikromolar sülfinpirazon içeren Krebs-Ringer bikarbonat tamponu ile yıkayın. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ölçümü için, Fura-2 yüklü hücrelerin bulunduğu kabı mikroskop altına yerleştirin.

Ardından 200 kat büyütme ekleyin. 20 ila 50 hücre içeren temsili bir alan bulun. Serbest el işlevini kullanarak, arka plan floresansından ayırt etmek için her hücrenin etrafına bir anahat çizin ve yazılımın arka plan floresansını ölçümden otomatik olarak çıkarmasını bekleyin.

Tıkla Deneyi Başlat düğmesine basın ve hücrelerdeki temel kalsiyum seviyelerini belirlemek için sekiz ila 15 saniye bekleyin. Daha sonra kolinerjik agonist karbakol'ü dikkatlice ekleyin ve en az 120 saniye veya kalsiyum seviyeleri taban çizgisine dönene kadar ölçmeye devam edin. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki pik değişikliği kullanarak, ölçümlerin ilk sekiz ila 15 saniyesi arasında her hücredeki ortalama bazal kalsiyum seviyesini hesaplayın.

Ortalama bazal kalsiyum seviyesi 500 nanomolara eşit veya daha yüksek olan hücreleri veri kümesinden çıkarın. Ardından, her hücre için maksimum hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra bazal kalsiyum seviyesi değerini, aynı hücre için ölçülen maksimum hücre içi konsantrasyondan çıkarın.

Son olarak, bir tabaktaki tüm hücreler için en yüksek hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişimin ortalamasını alın. İnsan konjonktival goblet hücrelerinin saflığı, goblet hücresi belirteçleri, sitokeratin ve Helix pomatia lektin 1'e özgü antikorlar kullanılarak immünofloresan boyama yoluyla doğrulandı. Fura-2 testinin sonuçları,% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI'de inkübe edilen hücreler ve tam RPMI ortamı arasında önemli bir fark göstermedi.

Bununla birlikte, gelişmiş RPMI orta grubu ile tam RPMI orta grubu karşılaştırıldığında, karbakole hücre içi kalsiyum yanıtında önemli bir artış gözlenmiştir. En önemli şey, yeterli hücre yoğunluğuna sahip birincil insan goblet hücre kültürünü elde etmektir. Büyüme sırasında, etkili büyüme için doku parçalarının kültür plakasına yapıştığından emin olun.

Araştırmacılar, çeşitli inhibitörler uygulayarak, reseptörleri hedefleyerek veya stimülasyondan önce hücrelere sinyal molekülleri göndererek spesifik yolların katılımını keşfedebilirler. Müsin sekresyonu ve mitojenle aktive olan protein kinazların deaktivasyonu gibi goblet hücre fonksiyonunu gösteren diğer parametreler de değerlendirilebilir. Ücretsiz ölçümler, goblet hücrelerinin farklı uyaranlara verdiği tepkinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.