Name: İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Keşfedin, iPSC'lerden 2D serebellar hücre monolayeri oluşturma yöntemini. Bu protokol, erken insan serebellar gelişimini ve nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkili değişiklikleri incelemek için maliyet etkin bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jenny Gringer Richards'a, kontrol iPSC'lerini oluşturduğumuz kontrol konularımızı doğrulamadaki kapsamlı çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH T32 MH019113 (D.A.M. ve K.A.K.'ya), Nellie Ball Trust (T.H.W. ve A.J.W.'ye), nih R01 MH111578 (V.A.M. ve J.A.W.'ye), nih KL2 TR002536 (A.J.W.'ye) ve Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. ve A.J.W.) tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender.com ile yaratıldı.

İnsan denekleri araştırması, 201805995 Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu onay numarası ve Iowa Üniversitesi İnsan Pluripotent Kök Hücre Komitesi onay numarası 2017-02 altında onaylanmıştır. Deneklerden deri biyopsileri yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra alındı. Fibroblastlar DMEM'de %15 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 MEM-esansiyel olmayan amino asit solüsyonu ile 37 °C'de ve %5 CO2'de kültürlendi. Fibroblastlar, elektroporasyon için bir nükleofektör kullanılarak üreticinin protokolünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) takiben epizomal bir yeniden programlama kiti kullanılarak yeniden programlandı. Tüm prosedürler Sınıf II Tip A2 biyolojik güvenlik kabininde ("kısaca "başlık") gerçekleştirildi. Tüm hücre kültürü ortamları antibiyotik içermiyordu; bu nedenle, davlumbaza giren her bileşen %70 etanol ile temizlendi. Tüm hücre kültürü ortamları ve bileşenleri, sterilitelerini korumak için steril filtrelenmiş veya davlumbazda açılmıştır.
1. Deneysel hazırlık
<ol><li>Bodrum membran matrisi (BMM) kaplı plakalar hazırlayın. NOT: BMM, daha sıcak sıcaklıklarda daha hızlı katılaşır. Plakalar hızlı bir şekilde hazırlanmalı ve depolanması için hemen 4 ° C'ye yerleştirilmelidir.<ol><li>BMM'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde, 4 °C'de en az 2 saat veya gece boyunca çözün.</li>
		<li>DMEM/F12 ve BMM'yi 80 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar karıştırın. BMM çözeltisini doku kültürü kaplarına dağıtın (35 mm için 1 mL ve 60 mm tabaklar için 2 mL) ve hücreleri kaplamadan önce en az 1 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Kullanılmayan tabaklar 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Poli-L-ornitin/laminin (PLO/laminin) kaplı plakalar hazırlayın.<ol><li>Steril DPBS +/+ içinde 20 μg / mL PLO ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Ertesi gün, FKÖ'yü bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve DPBS + / + ile iki kez yıkayın. Kaputta hava kurutulur. NOT: Havada kurutulmuş plakalar, gelecekte kullanılmak üzere alüminyum folyoya sarılmış olarak 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.</li>
		<li>DPBS +/+ içinde 10 μg / mL laminin (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde en az 3 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Laminini bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 1 mL orta veya steril DPBS + / + ekleyin. NOT: Laminin kaplama kurumamalıdır. Bunu önlemek için PBS veya uygun bir kültür ortamı derhal eklenmelidir. Kaplamalı plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>PSC passaging çözümünü hazırlayın. NOT: PSC geçiş çözeltisi10'u yapmak için bir ozmometre (Malzeme Tablosuna bakınız) gereklidir.<ol><li>11.49 g potasyum klorür (KCl) ve 0.147 g sodyum sitrat dihidrat (HOC (COONa) (CH 2 COONa) 2 * 2H 2 O) 400 mL steril hücre kültürüsınıfı suda çözün (bkz.</li>
		<li>Çözeltinin hacmini ölçün ve başlangıç hacmi (Vi) olarak kaydedin.</li>
		<li>Ozmolariteyi ölçün ve Vi × Oi = Vf × 570 mOsm formülünü kullanarak steril hücre kültürü sınıfı su ekleyerek 570 mOsm'a ayarlayın.</li>
		<li>Çözeltiyi 0.20 μm'lik bir filtre ile filtreleyerek sterilize edin ve 10 mL alikot yapın. Alikotları oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Pluripotent kök hücre (PSC) ortamı hazırlayın. NOT: iPSC'ler, ısıya dayanıklı FGF2 içeren bir ortamda tutulur ( Malzeme Tablosuna bakınız), hafta sonu içermeyen bir besleme programı sağlar. Ticari olarak temin edilebilen diğer PSC ortamları bu protokol için denenmemiştir.<ol><li>PSC orta takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözün.</li>
		<li>500 mL bazal PSC ortamına 10 mL PSC ortam takviyesi ekleyin. 25 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın. NOT: Dondurulmuş alikotlar 6 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Çözülmüş alikotlar 4 ° C'de saklanmalı ve 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Hücreler, %10 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir PSC ortamında uzun süreli depolama için dondurulabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>PSC çözme ortamını hazırlayın.<ol><li>50 nM kroman, 1.5 μM emricasan, 1x poliamin takviyesi ve 0.7 μM trans-ISRIB (CEPT kokteyli11) ile PSC ortamını destekleyin (bkz.</li>
		<li>0,20 μm filtre ile filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çekilmiş cam pipetler hazırlayın.<ol><li>22,9 cm (9 inç) cam Pasteur pipetleri bir Bunsen brülörün üstünde, boynun ~2 cm altında iki parçaya çekerek iki pipet oluşturun, daha ince tarafı diğerinden ~4 cm daha kısadır.</li>
		<li>Alevin yardımıyla, pürüzsüz bir "r" oluşturmak için çekilen tarafın uçlarını bükün.</li>
		<li>Çekilen pipetleri sterilizasyon için otoklav manşonlarına ve otoklavlara yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Serebellar farklılaşma ortamı (CDM) hazırlayın.<ol><li>IMDM ve Ham'ın F12 besin karışımını 1: 1 oranında karıştırın. Karışımı 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi,% 1 (v / v) kimyasal olarak tanımlanmış lipit konsantresi, 0.45 mM 1-tiyo-gliserol, 15 μL / mL apo-transferrin, 5 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 7 μg / mL insülin ile destekleyin (bkz.</li>
		<li>0,20 μm filtre ile filtre sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Serebellar olgunlaşma ortamı (CMM) hazırlayın.<ol><li>1x L-alanin-L-glutamin takviyesi ve 1x N-2 takviyesi ile nörobazal ortamı destekleyin (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>0,20 μm filtre ile filtre sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Besleyicisiz iPSC kültürü
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri çözün.<ol><li>Hücreleri çözmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca jelleşmek için 37 °C inkübatöre bir BMM plakası (adım 1.1) yerleştirin.</li>
		<li>37 °C'de önceden ısıtılmış 10 mL PSC çözme ortamı (adım 1.5).</li>
		<li>Kriyovyali hücrelerle sıvı azottan 37 ° C'de bir su banyosuna aktarın. NOT: Hücre kültürü alanında bir kontaminasyon kaynağı oluşmasını önlemek için, standart bir su banyosu kullanılması önerilmez. Bunun yerine, tatlı su, bir kerelik kullanım su banyosu oluşturmak için küçük bir beherde 37 ° C'ye ısıtılabilir.</li>
		<li>Tüpte küçük bir buz parçası kaldığında, su banyosundan çıkarın, tüpü kurutun ve% 70 etanol ile püskürtün. Tüpü davlumbaza aktarın ve hücreleri nazikçe 15 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için 2 mL veya 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Konik tüpü döndürürken hücrelere damla damla 8 mL PSC çözme ortamı ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Hücreleri 2 mL PSC çözme ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>BMM'yi plakadan aspire edin ve eşit dağılım için yeniden askıya alınmış hücreleri plakanın her yerine damla damla ekleyin.</li>
		<li>Plakayı inkübatöre 37 ° C'de,% 5 CO2'ye yerleştirin. PSC ortamı ile ertesi gün ortamı yenileyin. Bundan sonra, ortamı günlük olarak değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri koruyun.<ol><li>Gerekli PSC ortam hacmini 37 ° C'de önceden ısıtın (örneğin, 35 mm plaka başına 1 mL ortam).</li>
		<li>Diferansiye hücreler veya koloniler için plakaları araştırın ve farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipetle çıkarın (adım 1.6). NOT: iPSC kolonileri, morfolojik olarak aynı hücrelere sahip pürüzsüz kenarlara sahiptir.</li>
		<li>Harcanan ortamı günlük olarak değiştirin ve her 3-4 günde bir veya% 70 akıcılığa ulaşıldığında geçiş yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri geçirin.<ol><li>Gerekli miktarda BMM plakasını, geçmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Gerekli miktarda PSC ortamını (adım 1.3) 37 °C'de önceden ısıtın.</li>
		<li>Çekilmiş bir cam pipet kullanarak, farklılaşmış hücreleri veya kolonileri temizleyin.</li>
		<li>Harcanan ortamı bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 35 mm çanak başına 1 mL PSC ayrışma ortamı ekleyin. 1-3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. NOT: PSC ortamı eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.</li>
		<li>PSC pasaj solüsyonunu aspire edin ve önceden ısıtılmış PSC ortamı ekleyin.</li>
		<li>Steril bir 200 μL pipet ucu kullanarak, çizik çizgilerini bir yönde birbirine paralel hale getirin, plakayı 90° döndürün ve öncekilere dik ikinci bir çizik çizgileri seti yapın (plaka boyunca çapraz taranmış bir desen oluşturur).</li>
		<li>BMM çözeltisini ayarlanmış plakalardan aspire edin. Serolojik bir pipet kullanarak kolonileri toplayın ve yeni BMM plakalarına dağıtın.</li>
		<li>37 °C'de inkübe edin,% 5 CO2. Ortamı günlük olarak değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri dondurun.<ol><li>İçeriği etiketleyerek kriyovyalleri hazırlayın ve 30 dakika boyunca davlumbazda ultraviyole ( UV) ışık altında sterilize edin (bkz.</li>
		<li>PSC ortamını %10 (v/v) DMSO ile destekleyerek PSC dondurma ortamını hazırlayın. 2.3.2-2.3.5 arasındaki adımları izleyin.</li>
		<li>Hücreleri 5 mL'lik serolojik pipetle 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini PSC dondurma ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>Kriyovallere dağıtın. Şişeleri dondurucu bir kaba koyun ve kabı -80 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirin.</li>
		<li>Ertesi gün, kriyovyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Serebellar farklılaşma
NOT: Farklılaştırmaya başlamadan önce, iPSC'ler altı adet 35 mm'lik kalıba geçirilir ve %70 akıcılıkta olduklarında farklılaşmaya hazırdır. Her 35 mm'lik plaka, 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna aktarılacaktır.
<ol><li>0. günde, EB oluşumu için sağlıklı iPSC kolonilerini kaldırın.<ol><li>6 kuyulu ultra düşük ataşman (ULA) plakasının her bir kuyucuğuna 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş 1 mL CDM (adım 1.7) ekleyin ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin.</li>
		<li>Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin. Ortamı aspire edin ve her 35 mm'lik çanak için 1 mL PSC pasaj çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe edin, aspire edin ve 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ile desteklenmiş 2 mL CDM ekleyin. NOT: CDM eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.</li>
		<li>İletilen ışıklı ters çevrilmiş mikroskop altında, 4x büyütme kullanarak çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri yavaşça kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak hepsini 6 delikli ULA plakasının bir kuyucuğuna yavaşça aktarın. Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. NOT: Koloniler çok büyükse veya birleştirilmişse, daha küçük EB'ler oluşturmak için çekilmiş cam pipetin ucuyla dilimlenebilirler.</li>
	</ol></li>
	<li>2. günde, her bir kuyucuğa FGF2'yi 50 ng / mL'lik son konsantrasyona ekleyin. NOT: Serebellar farklılaşma için kullanılan FGF2 ısıya dayanıklı değildir. Bu protokol ısıya dayanıklı FGF2 ile test edilmemiştir.</li>
	<li>7. günde, 1/3 orta bir değişim yapın. Bir kuyucuktaki toplam 3 mL ortam için, 1.000 μL'lik bir pipetleyici ile, 1 mL harcanmış ortamı nazikçe aspire edin ve 1 mL taze CDM ile değiştirin. EB'leri 7 gün boyunca inkübe edin.</li>
	<li>14. günde, 1.000 μL'lik bir pipetör kullanarak harcanan ortamın neredeyse tamamını nazikçe aspire edin. EB'lere minimum hasar verilmesini sağlamak için, plakanın ortasındaki tüm EB'leri toplamak için plakayı döndürün ve ardından plakayı eğin ve kenardan yavaşça aspire edin.<ol><li>Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yerleştirin ve aspirasyona devam edin. EB'lerin kurumasını önlemek için yeterli ortam bırakın. Daha sonra, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL taze CDM ekleyin. EB'leri 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak PLO/laminin kaplı bir kaba aktarın (adım 1.2). NOT: Çıkış yönündeki uygulamaya bağlı olarak, EB'ler 6 delikli bir PLO/laminin plakasına veya tek EB'ler PLO/laminin kaplı 24 delikli plaka veya kapak kaymasının tek bir kuyucuğuna aktarılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>15. günde, ortamı aspire edin ve taze CDM ile değiştirin. NOT: Beslemeler arasında yeterli ortamı sağlamak için kuyucuklara yeterli ortam eklemek önemlidir, çünkü zamanla buharlaşma olacaktır (örneğin, 6 delikli bir plakadaki bir kuyu için 3 mL ortam ekleyin). Ortam asitleşmeye başladıysa (berrak ve sarıya dönerse), protokolün sonuna kadar besleme programında olmasa bile ortamı yenileyin.</li>
	<li>21. günde, harcanan ortamı aspire edin ve CMM ile değiştirin. 28. günde, ortamı taze CMM ile değiştirin. 35. günde, daha fazla uygulama için hücreleri toplayın.</li>
</ol>4. RNA izolasyonu için numune hazırlama
<ol><li>Ortamı aspire edin ve 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Birkaç saniye bekletin ve aspire edin.</li>
	<li>Plakayı, kapağı açıkken, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri ayırmak için plakanın kenarlarına dokunun.</li>
	<li>1 mL CMM ekleyin (adım 1.8) ve hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe toplayın.</li>
	<li>RT'de (maksimum hız 2000 x g) 30 sn için tezgah üstü bir mini santrifüj (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücreleri santrifüjleme yoluyla peletleyin, ortamı atın ve hücre peletini yıkamak için 1 mL 1x PBS pH 7.4 ekleyin.</li>
	<li>RT'de 30 sn'lik masaüstü mini santrifüj kullanarak hücreleri tekrar pelet edin ve PBS ile bir kez daha yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri toplayın ve PBS'yi atın. Reaktif içeren fenol ve guanidin izotiyosiyanat içindeki hücreleri lize edin (bakınız Malzeme Tablosu). NOT: Fenol ve guanidin izotiyosiyanat içeren reaktifte lize edilen hücreler -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Hücreler, RNA izolasyon yöntemine ve kullanılan reaktiflere bağlı olarak doğrudan çanak içinde lize edilebilir. Bir çanaktaki düşük hücre sayısı nedeniyle, RNA'yı silika spin sütunları kullanarak izole etmek ( bakınız Malzeme Tablosu) daha yüksek RNA verimine neden olacaktır.</li>
</ol>5. İmmünofloresan boyama için hücrelerin hazırlanması
NOT: 24 delikli bir plaka için, kuyu başına bir EB yeterlidir.
<ol><li>35. günde, harcanan ortamı aspire edin ve kuyu başına 1 mL DPBS +/+ ekleyerek hücreleri yıkayın (24 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için).</li>
	<li>DPBS +/+ aspire edin ve kuyucuk başına DPBS +/+ içinde hazırlanan 500 μL soğuk% 4 paraformaldehit (PFA, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. RT'de 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>% 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri adım 5.1'de olduğu gibi DPBS +/++ ile iki kez yıkayın. 1 mL DPBS +/+ ekleyin ve boyama yapılana kadar hücreleri 4 ° C'de saklayın. NOT: Hücre dekolmanı ve antijen kaybını önlemek için immünofloresan boyamanın fiksasyondan sonraki 1 hafta içinde yapılması önerilir. Bununla birlikte, antikora ve hedefin hücresel konumuna bağlı olarak, boyama fiksasyondan 4 hafta sonrasına kadar daha sonraki zamanlarda yapılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).</li>
<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li>
<li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).</li>
<li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959(2021).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li>
<li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012(2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li>
<li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li>
<li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li>
<li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Class+III+%CE%B2-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li>
<li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li>
<li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor%2C+Corl2%2C+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li>
<li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li>
<li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li>
<li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li>
<li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li>
<li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia%3A+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li>
<li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li>
<li>Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li>
<li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li>
<li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li>
<li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

İnsan serebellar gelişimini in vitro olarak modelleme yeteneği, hastalık modellemesi için ve normal beyin gelişiminin anlaşılmasını ilerletmek için önemlidir. Daha az karmaşık ve uygun maliyetli protokoller, çoğaltılabilir veri üretimi ve birden fazla bilimsel laboratuvarda geniş uygulama için daha fazla fırsat yaratır. Burada, Muguruma ve ark. tarafından bildirilen büyüme faktörleri kullanılarak, enzimler veya ayrışma ajanları gerektirmeyen EB'ler üretmek için modifiye edilmiş bir yöntem kullanılarak bir serebe...

İnsan serebellar gelişimini ve bu sürecin kritik zaman pencerelerini anlamak, sadece nörogelişimsel bozuklukların olası nedenlerini çözmek için değil, aynı zamanda terapötik müdahale için yeni hedeflerin belirlenmesi için de önemlidir. İnsan serebellar gelişiminin in vitro olarak modellenmesi zor olmuştur, ancak zamanla, insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) veya iPSC'leri serebellar soy kaderleriyle farklılaştıran birçok protokol ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8 . Ayrıca, tekrarlanabilir sonuçlar üreten, nispeten basit (hatayı azaltmak için) ve parasal maliyetler üzerinde ağır olmayan protokoller geliştirmek önemlidir.
Serebellar farklılaşma için ilk protokoller, kaplanmış embriyoid cisimlerden (EB'ler) 2D kültürlerden üretildi ve WNT, BMP'ler ve FGF'ler 1,9 dahil olmak üzere in vivo gelişime benzer çeşitli büyüme faktörleriyle serebellar kaderi indükledi. Daha yeni yayınlanan protokoller, öncelikle FGF2 ve insülin ile 3D organoid kültüründe farklılaşmaya neden oldu, ardından eşkenar dörtgen dudak benzeri yapılar3,4 için FGF19 ve SDF1 izledi veya FGF2, FGF4 ve FGF85'in bir kombinasyonunu kullandı. Her iki serebellar organoid indüksiyon yöntemi de benzer 3D serebellar organoidlerle sonuçlandı, çünkü her iki protokol de aynı zaman noktalarında benzer serebellar belirteç ekspresyonu bildirdi. Holmes ve Heine, 2D serebellar hücrelerin 3D agregalar olarak başlayan hESC'lerden ve iPSC'lerden üretilebileceğini göstermek için 3D protokol5'lerini genişletti. Ek olarak, Silva ve ark.7, 2D'deki olgun serebellar nöronları temsil eden hücrelerin, 3B'den 2B'ye geçmek ve büyüme ve olgunlaşma süresini uzatmak için farklı bir zaman noktası kullanarak, Holmes ve Heine'e benzer bir yaklaşımla üretilebileceğini göstermiştir.
Mevcut protokol, insülin ve FGF2 kullanarak serbest yüzen embriyoid cisimler (EB'ler) üreterek ve daha sonra EB'leri 2D büyüme ve farklılaşma için 14. günde FK / laminin kaplı tabaklara kaplayarak besleyicisiz iPSC'lerde serebellar kaderi indüklemektedir. 35. günde, serebellar kimliğe sahip hücreler elde edilir. Serebellar gelişimin erken aşamalarını, özellikle 2D bir ortamda, özetleme yeteneği, araştırmacıların tek katmanlı bir yapı ile deneyler gerektiren belirli soruları cevaplamalarını sağlar. Bu protokol aynı zamanda istenen hücre popülasyonlarını zenginleştirmek için mikro desenli yüzeyler, aksonal büyüme testleri ve hücre sıralama gibi daha ileri modifikasyonlara da uygundur.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serolojik pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-tiyo-gliserol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Serolojik pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Filtre Ünitesi, 0.2 & m aPES, 50 mm Dia</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kolay Kavramalı Doku Kaplama Kabı</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D Nükleofektör çekirdek ünitesi</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nükleofektör</td></tr><tr><td>5 mL Serolojik pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Kolay Kavramalı Doku Kültürü Kabı</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakaları</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9" Tek Kullanımlık Pastör Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü sınıfı su</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II, Tip A2, Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>NuAire, Inc.</td><td>NU-540-600</td><td>Başlık, UV ışığı</td></tr><tr><td>Costar 24 oyuklu plaka, TC ile muamele</td> edilmiş <td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 oyuklu plaka, TC ile muamele</td><td>edilmiş Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DAPI çözeltisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetik sülfoksit)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 epizomal iPSC yeniden programlama kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>ısıya dayanıklı FGF2</td></tr><tr><td>EVOS XL Çekirdek Görüntüleme sistemine</td> sahip <td>PSC ortamı Yaşam Teknolojileri</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX takviyesi</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanin-L-glutamin takviyesi</td></tr><tr><td>Jambonun F12 Besin Karışımı</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Anti-EN2, fare</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>İnsan anti-Ki67/MKI67, tavşan</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>İnsan anti-PTF1a, tavşan</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>İnsan anti-TUBB3, fare</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Fare Proteini</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrisi</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Temel membran matrisi</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mini Santrifüj</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td><td>Tezgah üstü mini santrifüj</td></tr><tr><td>Monarch RNA Temizleme Kiti (50 ve mikro; g)</td> <td>New England BioLabs</td><td>T2040</td><td>Silika döndürme sütunları</td></tr><tr><td>Monarch Toplam RNA Miniprep Kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>Silika döndürme sütunları</td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA %16</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Poliamin takviyesi</td><td>Sigma</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin (PLO)</td> <td>Sigma</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>Kendinden yapışkanlı poşetlere bakın</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td><td>Otoklav poşetler</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat dihidrat&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtreleri, steril, PES 0.22 ve mikro; m, 30 mm Dia</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>İnvitrojen</td><td>15596018</td><td>Fenol ve guanidin izotiyosiyanat</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1x)</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>Hücre ayrışma reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Buhar basıncı ozmometresi</td><td>Wescor, Inc.</td><td>Model 5520</td><td>Ozmometre</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biyogemler</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan serebellar gelişiminin in vitro in 2d yapının modellenmesi

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Beyinciğin hassas ve zamanında gelişimi sadece doğru motor koordinasyon ve denge için değil, aynı zamanda biliş için de çok önemlidir. Ek olarak, serebellar gelişimdeki bozulma, otizm, dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve şizofreni dahil olmak üzere birçok nörogelişimsel bozuklukta rol oynamıştır. İnsanlarda serebellar gelişimin araştırılması daha önce sadece ölüm sonrası çalışmalar veya nörogörüntüleme yoluyla mümkün olmuştur, ancak bu yöntemler, birçok nörogelişimsel bozukluğun ortaya çıktığı erken gelişim sırasında in vivo olarak meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri anlamak için yeterli değildir. Somatik hücrelerden insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) üretme tekniklerinin ortaya çıkması ve iPSC'leri nöronlara daha fazla yeniden ayırt etme yeteneği, erken beyin gelişiminin in vitro modellemesinin yolunu açmıştır. Bu çalışma, 2 boyutlu (2B) tek katmanlı bir yapı gerektiren uygulamalar için serebellar hücreler üretmeye yönelik basitleştirilmiş adımlar sunmaktadır. Erken gelişim aşamalarını temsil eden serebellar hücreler, aşağıdaki adımlarla insan iPSC'lerinden türetilir: ilk olarak, embriyoid cisimler 3 boyutlu (3D) kültürde yapılır, daha sonra serebellar kader spesifikasyonunu teşvik etmek için FGF2 ve insülin ile muamele edilir ve son olarak, poli-l-ornitin (PLO) / laminin kaplı substratlar üzerinde tek katmanlı olarak terminal olarak farklılaştırılırlar. 35 günlük farklılaşmada, iPSC kaynaklı serebellar hücre kültürleri, ATOH1, PTF1α, PAX6 ve KIRREL2 dahil olmak üzere serebellar belirteçleri eksprese eder, bu da bu protokolün glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncüllerin yanı sıra Purkinje hücre progenitörleri ürettiğini düşündürür. Ayrıca, farklılaşmış hücreler farklı nöronal morfoloji gösterir ve TUBB3 gibi nöronal kimliğin immünofloresan belirteçleri için pozitiftir. Bu hücreler, semaforin-4C, pleksin-B2 ve nöropilin-1 dahil olmak üzere aksonal rehberlik moleküllerini eksprese eder ve nörit büyümesinin ve sinaptik bağlantının moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model olarak hizmet edebilir. Bu yöntem, 2D tek katmanlı formatlar gerektiren gen ekspresyonu, fizyolojik ve morfolojik çalışmalar dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yararlı insan serebellar nöronları üretir.

3B'den 2B'ye serebellar farklılaşmaya genel bakış Serebellar hücreler iPSC'lerden başlayarak üretilir. Şekil 1A , genel iş akışını ve farklılaştırma için ana bileşenlerin eklenmesini göstermektedir. 0. günde, EB'ler, SB431542 ve Y-27632 içeren CDM'de çekilmiş bir cam pipet kullanılarak iPSC kolonilerinin yavaşça kaldırılmasıyla yapılır (Şekil 1B) ve ultra düşük ataşmanlı plakalara yerleştirilir. FGF2, 2. günde eklenir. 7. günde, ortamın üçte ...

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Bu yöntem, erken insan serebellar gelişimini ve nöropsikiyatrik bozukluklarda nasıl değiştirilebileceğini incelemede yardımcı olabilir. Bu yöntemin en önemli avantajı, karmaşık adımlar atmadan 2D katman yapısında gelişimsel olarak erken insan serebellar hücreleri oluşturmaktır. Aynı zamanda uygun maliyetlidir.Başlangıçta çekme pipetleri yapmak zor olabilir, ancak pratik ve zamanla pipetleri çalışmak daha kolay olacak şekilde çekmek kolaylaşır. İki cam pipet oluşturmak için boynun yaklaşık iki santimetre altında, bunsen brülörün üzerinde 22,9 santimetrelik bir Pasteur pipet çekerek deneysel hazırlığa başlayın. Daha ince taraf diğerinden yaklaşık dört santimetre daha kısa olacaktır.Pürüzsüz bir R oluşturmak için çekilen tarafın uçlarını alev üzerinde bükün, ardından çekilen pipetleri otoklav manşonlarına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin. Sıfır gününde, altı kuyucuklu ultra düşük bir ataşman veya ULA, plakanın her bir kuyucuğuna 10 mikromolar Y-27632 ve SB-431542 ile desteklenmiş bir mililitre serebellar farklılaşma ortamı ekleyin ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin. Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin.Ortamı aspire edin ve her 35 milimetrelik çanak için bir milimetre iPSC passaging solüsyonu ekleyin. 37 santigrat derecede üç dakikalık inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve 10 mikromolar Y-27632 ve SB-431542 ile desteklenmiş iki milimetre serebellar farklılaşma ortamı ekleyin İletilen ışık ters çevrilmiş bir mikroskobun 4x büyütülmesi altında, çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak tüm kolonileri altı kuyucuklu ULA plakasının bir kuyucuğuna yavaşça aktarın.Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın ve hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci günde, mililitre başına 50 nanogramlık bir son konsantrasyonu ayarlamak için her bir kuyucuğa FGF2 ekleyin. Yedinci günde, bir mililitre harcanmış ortamı aspire ederek ve bir mililitre taze serebellar farklılaşma ortamı ile değiştirerek ortamın üçte birini değiştirin.Embriyoid cisimleri yedi gün boyunca inkübe edin. 14. günde, tüm embriyoid cisimleri plakanın merkezinde toplamak için plakayı döndürün. Ardından plakayı eğin ve kenardan 1000 mikrolitrelik bir pipetter kullanarak harcanan tüm ortamı aspire edin.Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yerleştirin ve aspire etmeye devam edin, embriyoid cisimleri dışarı çekmekten kaçınmak için yeterli ortam bırakın. Daha sonra, 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş üç mililitre taze serebellar farklılaşma ortamı ekleyin. Daha sonra embriyoid cisimleri 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak Poli-L-Ornitin Laminin kaplı bir kaba aktarın.15. günde, ortamı aspire edin ve taze serebellar farklılaşma ortamı ile değiştirin. Sıfır gününde, iPSC kolonileri temizlendi ve SB-431542 ve Y-27632 içeren serebellar farklılaşma ortamına kaldırıldı ve embriyoid cisimler oluşturmak için ultra düşük bağlantı plakalarına yerleştirildi. İkinci günde FGF2 ilavesi ve yedinci günde 1/3 ortamın değişmesi, embriyoid cisimlerin 14. günde genişleme göstermesine neden oldu.Hücreler, 15. günde kaplanmış yüzey boyunca embriyoid cisimlerden dışarı doğru göç etmeye başladı. Ortamın 21. günden itibaren serebellar olgunlaşma ortamına tamamen değişmesi, 35. güne kadar nöronal benzeri morfolojiye ve karmaşıklığa sahip tek katmanlı bir hücre tabakası ile sonuçlandı. 35. gündeki gen ekspresyon analizi, hücrelerin glutamaterjik progenitörler, ATOH1, GABAerjik progenitörler, PTF1 alfa ve Purkinje progenitör hücre belirteçleri KIRREL2 ve SKOR2 gibi erken serebellar progenitör belirteçleri eksprese ettiğini ortaya koymuştur.Ek olarak, eşkenar dörtgen dudak belirteci OTX2 ve çoğunlukla anterior nörona özgü SIX3'ün ekspresyonu da gözlendi. 35. günde toplanan hücrelerin immünofloresan etiketlemesi, beyincik belirteçleri EN2 ve PTF1 alfa, nöronal belirteç beta tübülin III ve proliferasyon belirteci KI67 için pozitif boyanma gösterdi. 4'6-diamidino-2-fenilindol veya DAPI ile nükleer boyama, hücre çekirdeği gösterdi.Başarılı bir farklılaşma için, sağlıklı ve farklılaşmamış iPSC kolonileri ile başlamak ve mümkün olduğunca taze bir şekilde yeniden oluşturulmuş reaktifler kullanmak çok önemlidir.

modeling-human-cerebellar-development-in-vitro-in-2d-structure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri serebellar progenitörlere ayırmak için bir protokolü göstermektedir. Embriyoid cisimcikleri oluşturmak için kök hücre kolonilerinin ultra düşük bir bağlanma plakasına aktarılmasını, büyüme faktörleri ile farklılaşmanın teşvik edilmesini ve daha sonra embriyoid cisimciklerinin yapışma için matris kaplı bir plakaya aktarılmasını içerir. Sonraki adımlar, hücre göçünü indüklemeyi ve glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncülerin ve...

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden 2D Tek Tabakalı Serebellar Hücreler Oluşturma Tekniği

Bu video, fare primer serebellar granül nöronlarında bir nöronal yaralanma modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Uyarıcı bir nörotransmitter reseptör agonisti olan NMDA ve bir ko-agonist olan glisin kullanarak nöronal hasarın indüklenmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir. NMDA ve glisin, spesifik nöronal reseptörlere bağlanarak aşırı uyarılmasına neden olur ve nöronal hücre hasarına ve ölümüne yol açan büyük bir hücre içi kalsiyum akışına neden olur.

Fare Primer Serebellar Granül Nöronlarında Nöronal Hasarın Modellenmesi

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Biz bir basitleştirilmiş 3D farklılaşma tanımlanan protokolü kullanarak hPSCs, orta tarif ve büyüme faktörleri, erken neuroepithelial yapıları ile hücre toplamları oluşturma yeteneğine ve serebellar ilişkili işaretçileri, hem de bir isteğe bağlı için olumlu azaltılmış Hücreleri işlevsel sinir hücreleri oluşturmak için monolayer ayırt için 2D değişiklik.

İsteğe bağlı 2D değişiklik ile akıcı 3D serebellar farklılaşma Protokolü

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

Burada, fare beyinciğindeki granül nöronların sinaptogenezini, doğum sonrası beyin gelişiminin zaman boyunca, bu hücreler sinaptik yapılarını rafine ettiklerinde ve kendilerini genel beyin devresine entegre etmek için sinapslar oluşturduklarında görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Keşfedin, iPSC'lerden 2D serebellar hücre monolayeri oluşturma yöntemini. Bu protokol, erken insan serebellar gelişimini ve nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkili değişiklikleri incelemek için maliyet etkin bir model sunar.

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

Daha fazla video keşfet