Name: Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Öğrenin, karaciğer kanseri dokusundan küçük hücre dışı vezikülleri zenginleştirmek için optimize edilmiş diferansiyel ultrasantrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, klasik yöntemlere göre daha yüksek saflıkta vezikül izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'ne bu çalışmayı destekledikleri için teşekkür eder. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe numaraları 82260422).

İnsan karaciğer kanseri dokusu, Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde karaciğer malignitesi teşhisi konan hastalardan toplandı. Tüm hastalar bilgilendirilmiş onam formu imzaladı ve insan doku örneklerinin toplanması Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nin etik komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Hazırlık
<ol><li>Aktarım renk giderici çalkalayıcıyı inkübatöre yerleştirin ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın. Gerekli diğer tüm ekipmanlar için Şekil 1'e bakın.</li>
	<li>Neşter ve forsepsleri %75 alkol püskürterek temizleyin.</li>
	<li>6 mg kollajenaz D (4 mg / mL) ve 24 μL DNaz Ι (80 U / mL) ölçerek ve bunları 1.5 mL RPMI-1640 bazik ortama ekleyerek sindirim çözeltisini hazırlayın. Katkı maddeleri tamamen çözünene kadar nazik ters çevirme ile karıştırın.</li>
	<li>Önceden, 70 μm ve 0.22 μm hücre süzgeçlerini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile nemlendirin.</li>
	<li>Buz çözüldükten sonra karaciğer dokularını tutmak için buz kutusunun üzerine 100 mm'lik steril bir hücre kültürü kabı yerleştirin.</li>
	<li>Hepatosellüler karsinom doku izolasyonundan sonraki 15 dakika içinde, doku bloğunun yüzeyindeki kanı PBS ile durulayın, dokuyu steril dondurulmuş bir tüpe aktarın ve deneye kadar 2 haftadan fazla olmamak üzere -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. Doku ayrışması
<ol><li>Doku örneğini -80 °C dondurucudan çıkarın ve 2 mm x 2 mm x 2 mm parçalar halinde kesilmiş mendilin yaklaşık 400 mg'ını buz kutusundaki 10 cm'lik hücre kültürü kabına yerleştirin.</li>
	<li>Dokuyu 1.5 mL sindirim çözeltisi ile 6 delikli bir plakaya taşıyın; Daha sonra, karaciğer kanseri dokusunun tamamen ayrışması ve sEV'lerin salınması için 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe etmek için plakayı transfer renk giderici çalkalayıcıya (20 rpm / dak) yerleştirin.</li>
	<li>6 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve buz kutusuna yerleştirin. Sindirimi durdurmak için 80 μL fosfataz inhibitörü ve 200 μL tam proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Sindirim solüsyonunu 70 μm hücre süzgecine aktarın ve büyük doku kalıntılarını gidermek için yavaşça filtreleyin. Filtreyi toplayın ve 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
</ol>3. Diferansiyel ultrasantrifüjleme
NOT: Tüm santrifüjleme adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin.
<ol><li>Filtratı 10 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir 2 mL santrifüj tüpünde toplayın. Küçük doku kalıntılarının çoğu daha sonra çıkarılabilir.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını gidermek için süpernatantı 20 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj edin. Pipetin ucu yüzeydeki beyaz maddeye temas etmek üzere olana kadar süpernatantı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Kalan sıvıyı 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin; Daha sonra, veziküllerin toplanmasını kolaylaştırmak için süpernatantı aspire edin. EV'lerin saflığını sağlamak için, beyaz maddenin aspire edilmediğinden emin olun.</li>
	<li>Toplanan süpernatantı 20 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatantın 900 μL'sini 4.7 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Kalan sıvıyı 3 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin ve ardından her iki süpernatantı da aynı ultrasantrifüj tüpünde toplayın ve karıştırın. Tüpü tamamen PBS ile doldurun.</li>
	<li>Süpernatantları 60 dakika boyunca 100.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve ultra santrifüj tüpünü PBS ile doldurarak ve 60 dakika boyunca 100.000 × g'da tekrar santrifüj yaparak peleti yeniden askıya alın. Pelet 50 μL PBS ile tekrar askıya alın.</li>
	<li>1 mL steril şırınga kullanarak sEV süspansiyonunu aspire edin ve 0,22 μm membran filtresinden filtreleyin. Filtratı 600 μL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Zenginleştirme kalitesinin değerlendirilmesi
<ol><li>Bir transmisyon elektron mikroskobu altında sEV'lerin morfolojisini gözlemleyin.<ol><li>Ardından, 10 μL sEV numunesini bakır bir ağ üzerine bırakın, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve fazla sıvıyı gidermek için emici kağıt kullanarak steril damıtılmış suyla temizleyin.</li>
		<li>1 dakika boyunca negatif boyama için bakır ağın üzerine 10 μL% 2 uranil asetat damlatın. Bakır ağın yüzeyindeki sıvıyı emmek için filtre kağıdı kullanın ve bir akkor lamba altında 2 dakika kurutun.</li>
		<li>Bakır ağı bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemleyin ve 80 kV'de görüntü alın.</li>
	</ol></li>
	<li>sEV'lerin boyut dağılımını ve saflığını belirlemek için bir nanopartikül akış sitometresi kullanın.<ol><li>Makine çalışmaya başlamadan önce, 200 μL kalite kontrol, 200 μL silika nanosfer, 2 x 200 μL ultra saf su, 2 x 200 μL temizleme çözeltisi ve 200 μL PBS içeren tüpler hazırlayın. NOT: sEV numunelerini test etmeden önce, cihaz üzerinde kalite kontrolü yapmak ve partikül boyutu standardını test etmek gerekir (boyut dağılımı, aynı algılama koşulu altında farklı çaplarda [68-155 nm] birkaç nanomikrosfer ile oluşturulan standart eğriler kullanılarak hesaplanmalıdır). QC boncukları ve silika nanosferleri, toplam 200 μL hacimde ultra saf su ile 100x seyreltildi.</li>
		<li>Temizleme çözeltisinin hacmini (>10 mL) kontrol edin ve kılıf sıvısının seviyeleri ile atık sıvının (20-30 cm) seviyeleri arasındaki farkı not edin.</li>
		<li>Cihazın ana güç kaynağını kapatın; 20 saniye sonra, bilgisayarı açın ve yazılımı çalıştırmak için cihazın düzgün bir şekilde bağlandığını gösteren bip seslerini bekleyin.</li>
		<li>Kamerayı, lazeri ve hava pompasını açmak için Başlat'a tıklayın.</li>
		<li>Sheath Flow-Start Up'a tıklayın ve yükleme platformuna ultra saf su yerleştirin. 4 dakika sonra (cihazın geri sayımı), Numune Artırma | Numune-Boşaltma.</li>
		<li>30 saniye sonra, boş tüpü yükleme platformuna yerleştirin ve Numune Artırma | Numune-Boşaltma. Ardından, ultra saf suyu tutan tüpü yükleme platformuna yerleştirin ve aynı anda Numune Güçlendirme | Kılıf Akış-Temizleme.</li>
		<li>Manuel Çalıştırma'ya tıklayın ve partikül konsantrasyon tüpünü yükleme platformuna yerleştirin. Ardından, 1 dakika boyunca Sample-Boosting'e tıklayın ve aynı anda "SAMP . İnf."</li>
		<li>Numune Örnekleme'ye tıklayın ve SPCM'ye tıklayarak dedektörü açın. NOT: Bu noktada, gerçek zamanlı sinyal dalga formu görülebilir.</li>
		<li>Otomatik Örnekleme'ye tıklayın ve basıncı 1 KPa'da sabitlemek için Örnekleme SET'ine 1.0 girin. Araç çubuğuna tıklayın ve Büyük Sinyal'i seçin.</li>
		<li>Lazerin yatay konumunu ayarlayın ve lazeri 2 μm'ye ayarlayın; Ardından, sinyalin güçlü ve düzgün olduğundan emin olmak için L veya R'ye tıklayın.</li>
		<li>Tamamlandığında otomatik olarak Arabelleğe atlayacak olan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri bir Naf Dosyasına kaydedin ve Sample-Unload'a tıklayın.</li>
		<li>Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin, Numune Artırma'ya tıklayın ve 1 dakika sonra Numune Boşaltma'ya tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.</li>
		<li>Partikül boyutundaki standart tüpü yükleme platformuna yerleştirin ve 1 dakika boyunca Numune Güçlendirme'ye tıklayın.</li>
		<li>"SAMP. Inf" ve Sample-Sampling'e (Örnek-Örnekleme) tıklayın. Ardından, araç çubuğuna tıklayın ve Küçük Sinyal'i seçin.</li>
		<li>Tamamlandığında otomatik olarak Arabelleğe atlayacak olan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri bir Naf Dosyasına kaydedin ve Sample-Unload'a tıklayın.</li>
		<li>Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin, Numune Güçlendirme'ye tıklayın ve 1 dakika sonra Numune Boşaltma'ya tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.</li>
		<li>PBS tüpünü yükleme platformuna yerleştirin; 1 dakika boyunca Numune Artırma'ya tıklayın.</li>
		<li>"SAMP. Inf" ve Sample-Sampling'e (Örnek-Örnekleme) tıklayın. Ardından, araç çubuğuna tıklayın ve Küçük Sinyal'i seçin.</li>
		<li>Veri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın, bu da bittiğinde otomatik olarak Arabelleğe atlayacaktır. Verileri bir Naf Dosyasına kaydedin ve Sample-Unload'a tıklayın.</li>
		<li>Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin, 1 dakika sonra Numune Artırma ve Numune Boşaltma'ya tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.</li>
		<li>Örnek bilgileri daha önce 4.2.17-4.2.20 adımlarında açıklandığı gibi kontrol edin; PBS'yi (adım 4.2.17) sEV örneği olarak değiştirin ve verileri analiz edin.</li>
	</ol></li>
	<li>EV'leri batı lekesi ile daha fazla tanımlayın.<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre BCA protein niceleme kitini kullanarak sEV'lerin ve dokuların protein konsantrasyonlarını belirleyin.</li>
		<li>Bu nicel sonuçlara dayanarak sEV'lerin yükleme hacmini hesaplayın (örneğin, kuyu başına 5 μg protein için). 1:4 oranında yükleme tamponu ekleyin ve karışımı vorteksleyin.</li>
		<li>100 ° C'lik bir metal banyosunda (kuru termostat) 10 dakika boyunca denatürasyondan sonra, proteini 80 dakika boyunca 60 V'ta% 12'lik bir poliakrilamid jel üzerinde ayırın.</li>
		<li>Jeli, transfer tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 metanol) kullanarak 2 saat boyunca 220 mA'da 0.22 μm poliviniliden diflorür membran üzerine aktarın.</li>
		<li>Membranı Tris tamponlu salin Arasında (TBST) oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız kuru sütle bloke edin ve 4 ° C'de bir gecede birincil antikor (tavşan monoklonal anti-insan CD9 antikoru, tavşan monoklonal anti-insan CD63 antikoru, tavşan monoklonal anti-insan TSG101 antikoru, fare monoklonal anti-insan GM130 antikoru) ile inkübe edin. Birincil antikorları %5 yağsız sütte 1:1.000'de seyreltin.</li>
		<li>TBST ile üç yıkamadan sonra, zarı yaban turpu peroksidaz (HRP) - konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
		<li>ECL lekeleme substratını kullanarak HRP'ye bağlı antikoru tespit edin ve ardından görüntüleri toplayın ve analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu protokol, karaciğer kanseri dokusundan sEV'leri çıkarmak için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar. Yüksek kaliteli sEV'ler keskin doku izolasyonu, sindirim enzimleri ile tedavi, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm filtre membranı filtrasyonu ve saflaştırılması ile elde edilir. Aşağı akış analizi için, sEV'lerin yüksek saflığını sağlamak son derece önemlidir. Diferansiyel santrifüjleme sürecinde, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası (bilinmeyen bileşim) görünecektir. Bu tabaka sEV'leri kirleteceğinde...

Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) yaklaşık 30 nm ila 150 nm çapındadır ve çeşitli hücreler tarafından salgılanır1. Doku hücreleri ile iletişim kurabilir ve lipitler, proteinler, DNA ve RNA gibi önemli biyolojik molekülleri çeşitli organlara, dokulara, hücrelere ve hücre içi parçalara taşıyarak yerel veya uzak mikro ortamı düzenleyebilirler. Böylece, alıcı hücrelerin davranışını da değiştirebilirler 2,3. Belirli sEV'lerin izolasyonu ve saflaştırılması, hastalığın gelişimi ve seyri sırasında biyolojik davranışlarını incelemek için gerekli bir ön koşuldur. Altın standart olarak kabul edilen diferansiyel ultrasantrifüjleme, sEV'leri normalde bulundukları dokulardan ayırmak için yaygın olarak kullanılır4. Doku kalıntıları, hücre kalıntıları, büyük veziküller ve apoptotik cisimler bu teknikle çıkarılabilir ve sadece sEV'ler bırakılabilir.
Kollajenaz D ve DNaz I'in, hücrelerin veya veziküllerin moleküler özelliklerini etkilemediği, her iki enzimin özelliklerinin hücre dışı matris 5'teki veziküllerin salınımına katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu enzimler, insan metastatik melanom dokusundan, kolon kanseri dokusundan ve kolonik mukozal dokudan sEV'leri çıkarmak için kullanılmıştır 5,6,7. Bununla birlikte, bu yöntemlerde kollajenaz D ve DNaz I'in konsantrasyonu ve sindirim süresi farklılık göstermekte ve tutarsız sonuçlara yol açmaktadır. Diğer sEV alt tiplerinin kopyalanmasını önlemek için, araştırmacılar filtrasyon ve / veya diferansiyel santrifüjleme8 ile daha büyük hücre dışı vezikülleri (0.1 μm veya 0.2 μm çapında) çıkardılar. Kaynak dokuya bağlı olarak, farklı izolasyon ve saflaştırma yöntemleri gerekebilir 9,10.
Karaciğer dokusundan sEV'leri çıkarmak için geleneksel diferansiyel ultrasantrifüjleme yönteminin kullanılması, özelliklerini belirlemenin herhangi bir yolu olmadan, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası ile sonuçlanır. Önceki bir çalışmada11, bu beyaz madde tabakasının sEV'lerin saflığını etkilediği bulunmuştur. Geleneksel yöntemle izole edilen numunelerin partikül sayısı ve protein konsantrasyonu mevcut yöntemden daha yüksek olmasına rağmen, varyasyon katsayısı büyüktü, çünkü muhtemelen birçok kirletici sonuçların zayıf tekrarlanabilirliğine yol açabilir. Yani, deterjan kullanarak (yani,% 1 Triton X-100'deki parçacıkların çözünürlüğünü tespit ederek), bu yöntemle elde edilen sEV'lerin saflığının daha büyük olduğunu bulduk. Bu nedenle, proteomik araştırmalar için kolorektal kanser dokusundan türetilen sEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için bu yöntemi kullanıyoruz.
Şu anda, karaciğer kanserinde sEV'ler üzerine yapılan araştırmalar esas olarak serum, plazma ve hücre kültürünün süpernatantı12,13,14'e odaklanmıştır. Bununla birlikte, karaciğer kanseri dokusundan türetilen sEV'ler, fizyolojik patolojiyi ve karaciğer kanserinin çevresindeki mikro ortamı daha doğru bir şekilde yansıtabilir ve diğer EV'lerin bozulmasını ve kirlenmesini etkili bir şekilde önleyebilir15,16. Diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanımı ile, bu yöntem verimi zenginleştirebilir ve yüksek kaliteli sEV'ler elde edebilir ve karaciğer kanserinin daha ileri çalışmaları için önemli bir temel sağlar. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokusunun keskin bir ayırma ile ayrılmasını ve kollajenaz D ve DNaz I ile ayrışmasını sağlar. Daha sonra, hücresel enkaz, büyük veziküller ve apoptotik cisimler filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile daha da uzaklaştırılır. Son olarak, sEV'ler daha sonraki çalışmalar için izole edilir ve saflaştırılır.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m Membran Filtre</td><td>Ünitesi Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Steril şırınga</td><td>Hubei Xianming Tıbbi Alet Şirketi</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>%2 Uranil Asetat</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4.7 mL Santrifüj Tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu Hücre kaplama plakası</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Beher</td><td>Tianjin Kangyiheng Deneysel Enstrüman Satış Şirketi</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 & m Hücre süzgeci</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Hücre kültürü kabı</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 & mikro; L Santrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein miktar tayin kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antikor</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Temizleme Çözeltisi</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Bakır ağ</td><td>Henan Zhongjingkeyi Teknoloji Şirketi</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Kuru Termostat</td><td>Hangzhou allsheng aletleri şirketi</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti İnsan CD9 Antikoru</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Keçi yaban turpu peroksidaz (HRP) ile bağlanmış ikincil anti-fare antikoru&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Keçi yaban turpu peroksidaz (HRP) ile bağlanmış ikincil anti-tavşan antikoru&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Şanghay Zhenxing Kimya Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopartikül akış sitometresi</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitörleri (PhosSTOP)</td> <td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Poliviniliden Diflorür Membran</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC Boncuklar</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 temel ortam</td><td>Biyolojik Endüstriler&nbsp;</td><td></td><td></td>C11875500BT</tr><tr><td>Neşter</td><td>Guangzhou Kehua Ticaret Şirketi</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>Silika Nanoküreler</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>Aktarım Renk Giderici Çalkalayıcı TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>Termo Bilimsel</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 Antikor</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Guangzhou Lige Teknoloji Şirketi</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküller İçin bir zenginleştirme yöntemi

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Dokudan türetilen küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler), kaynak hücrelerin fonksiyonel durumunu ve dokunun interstisyel boşluğunun özelliklerini yansıtabilir. Bu sEV'lerin verimli bir şekilde zenginleştirilmesi, biyolojik işlevlerinin incelenmesi için önemli bir önkoşuldur ve klinik tespit tekniklerinin ve terapötik taşıyıcı teknolojisinin geliştirilmesinin anahtarıdır. SEV'leri dokudan izole etmek zordur, çünkü genellikle ağır kirlenirler. Bu çalışma, karaciğer kanseri dokusundan yüksek kaliteli sEV'lerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem dört aşamalı bir işlem içerir: sindirim enzimlerinin (kollajenaz D ve DNaz Ι) doku ile inkübasyonu, 70 μm hücre süzgecinden filtrasyon, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm membran filtresi ile filtrasyon. Diferansiyel ultrasantrifüjleme adımının optimizasyonu ve bir filtreleme adımının eklenmesi sayesinde, bu yöntemle elde edilen sEV'lerin saflığı, klasik diferansiyel ultrasantrifüjleme ile elde edilenden daha yüksektir. Doku kaynaklı sEV'lerin incelenmesi için önemli bir metodoloji ve destekleyici veriler sağlar.

İnsan karaciğer kanseri dokularından elde edilen sEV'ler, karaciğer kanserli hastaların tanı, tedavi ve prognozunda çok önemli bir rol oynamıştır. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokularından türetilen sEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için yaygın laboratuvar araçlarını kullandı; bu, sEV'lerin incelenmesi için metodolojik destek sağlayabilir. Şekil 2, karaciğer kanseri dokularından sEV'leri zenginleştirmenin genel sürecini göstermektedir. Dokuların hücreler arası boşluklarındaki sEV'ler, dok...

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Bu yöntem, karaciğer kanseri dokusundan türetilmiş küçük hücre dışı veziküllerin, klasik, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile elde edilenden daha yüksek bir saflıkta izole edilmesine izin verir. Bu teknoloji basit, kullanışlı ve kullanımı kolaydır, bu da küçük hücre dışı veziküllerin incelenmesi için metodolojik destek sağlayabilir. Başlamak için, doku örneğini 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın.Yaklaşık 400 miligram dokuyu buz kutusunun üzerindeki 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve dokuyu bir neşterle ince ince kıyın. Dokuyu 1.5 mililitre sindirim çözeltisi ile altı kuyucuklu bir plakaya aktarın. Daha sonra, plakayı transfer renk açma çalkalayıcısına yerleştirin ve karaciğer kanseri dokusunun tamamen ayrışması ve küçük hücre dışı veziküllerin veya sEV'lerin salınması için 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, altı kuyucuklu plakayı buz kutusuna yerleştirin. Sindirimi durdurmak için 80 mikrolitre fosfataz inhibitörü ve 200 mikrolitre tam proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin. Ardından, sindirim çözeltisini iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine aktarın ve büyük doku kalıntılarını gidermek için yavaşça filtreleyin.Küçük doku kalıntılarını gidermek için filtratı 10 dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir iki mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın. Hücre kalıntılarını gidermek için süpernatantı 20 dakika boyunca 3.000 g'da santrifüj edin. Pipetin ucu alttaki beyaz döküntüye temas etmek üzere olana kadar süpernatantı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.Kalan sıvının santrifüjlemesini tekrarladıktan sonra, süpernatantı enkazı rahatsız etmeden tüpün içine toplayın. Toplanan süpernatantı 20 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüj edin ve süpernatantın 900 mikrolitresini 4.7 milimetrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Kalan sıvının santrifüjlemesini tekrarlayın ve ardından her iki süpernatantı da aynı ultrasantrifüj tüpünde toplayın ve karıştırın.Tüpü tamamen PBS ile doldurun. Süpernatantı 60 dakika boyunca 100.000 g'da santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, ultrasantrifüj tüpünü PBS ile doldurarak pelet yeniden askıya alın.Santrifüjlemeyi 60 dakika boyunca 100.000 g'da tekrarladıktan sonra, peleti 50 mikrolitre PBS ile askıya alın. Bir mililitrelik steril bir şırınga kullanarak sEV süspansiyonunu aspire edin ve 0,22 mikrometrelik bir membran filtresinden 600 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Daha fazla analiz için filtratı 80 santigrat derecede saklayın.sEV'lerin boyut dağılımını ve saflığını belirlemek için bir nanopartikül akış sitometresi kullanın. Temizleme çözeltisinin hacmini kontrol edin. Ardından, kılıf seviyeleri ile atık sıvı arasındaki farkı not edin.Cihazın ana güç kaynağını açtıktan 20 saniye sonra bilgisayarı açın. Yazılımı çalıştırmak için cihazın düzgün bağlandığını gösteren bip seslerini bekleyin. Kamerayı, lazeri ve hava pompasını açmak için Başlat'a tıklayın.Ardından, Sheath Flow'a tıklayın ve Start Up'ı seçin.Yükleme platformuna ultra saf su yerleştirin. Dört dakika sonra Numune ve Güçlendirme'ye tıklayın ve ardından Örnek'te Boşalt'ı seçin. 30 saniye sonra, boş tüpü yükleme platformuna yerleştirin.Örnek'e tıklayın, Öne Çıkarma'yı seçin ve ardından Örnek'te Boşalt'ı seçin. Ardından, ultra saf su içeren tüpü yükleme platformuna yerleştirin. Aynı anda, Numune ve Artırma'ya, ardından Kılıf Akışı ve Temizleme'ye tıklayın.Manuel Çalışma'ya tıklayın ve partikül konsantrasyon tüpünü yükleme platformuna yerleştirin. Ardından, Numune'ye tıklayın, bir dakika boyunca Güçlendirme'yi seçin ve aynı anda Numune Bilgileri'nde 250 nanometre Standart Floresan Silika Nanospheres kalite kontrolünü seçin. Numuneden Örnekleme'yi seçin ve SPCM'ye tıklayarak dedektörü açın.Ardından, Otomatik Örnekleme'ye tıklayın ve basıncı bir kilopaskalda sabitlemek için Örnekleme Kümesi'ne 1.0 girin. Araç çubuğuna tıklayın ve Büyük Sinyal'i seçin. Lazerin yatay konumunu ayarlayın ve lazeri iki mikrometreye ayarlayın.Ardından, sinyalin güçlü ve düzgün olduğundan emin olmak için sürekli olarak L ve R'ye tıklayın. İşiniz bittiğinde otomatik olarak Arabelleğe atlayan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri Nfa Dosyasına kaydedin ve Kaldır'ı seçmek için Örnek'e tıklayın.Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin. Örnekle'ye tıklayın, Öne Çıkarma'yı seçin ve bir dakika sonra Örnekle ve Boşalt'a tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.Partikül boyutu standart tüpünü yükleme platformuna yerleştirin ve bir dakika boyunca Numune Artırma'ya tıklayın. Numune Bilgileri'nde 68 - 155 S16M-Exo kalite kontrolünü seçin ve Numune'ye ve ardından Örnekleme'ye tıklayın. Ardından, araç çubuğuna tıklayın ve Küçük Sinyal'i seçin.İşiniz bittiğinde otomatik olarak Arabelleğe atlayan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri bir Nfa dosyasına kaydedin ve Kaldır'ı seçmek için Örnek'e tıklayın. Kalıntıları temizleme çözeltisi ile çıkardıktan sonra, PBS tüpünü yükleme platformuna yerleştirin ve partikül boyutu standart tüp için gösterilen adımları uygulayın.Ardından, kılcal ucu daha önce gösterildiği gibi temizleyin ve parçacık boyutu standart tüp için daha önce açıklanan verileri analiz etmek için sEV örneğini yükleyin. Saflaştırılmış sEV'ler, fincan şeklinde bir morfolojiye sahip sEV'lerin varlığını ortaya çıkaran bir transmisyon elektron mikroskobu altında incelendi. sEV'ler için akım sitometrisi yapıldı.Ve parçacık boyutu 40 ila 200 nanometre arasında değişiyordu ve ortalama parçacık boyutu 89 nanometre idi. Zenginleştirilmiş sEV'lerin saflığı %68.32 olarak bulunduCD63, CD9 ve TSG101 gibi sEV'lerin protein belirteçleri western blot ile tespit edildi. GM130, doku hücrelerinde bulunan ancak sEV'lerde bulunmayan sEV'lerin negatif kontrol belirteci olarak kullanıldı.Küçük hücre dışı veziküllerin saflığını sağlamak için enzimatik sindirim, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve membran filtrasyonu adımlarını büyük bir özenle gerçekleştirmek çok önemlidir.

an-enrichment-method-for-small-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Plazma izole eksozomlar, erken teşhis ve hastalığın ilerlemesi için biyobelirteçlerin tespiti ve takibi için invaziv olmayan ve tekrarlanabilir bir yol olarak kullanılabilir. Bu video, DNA ve protein ekstraksiyonları için kullanılabilecek küçük hücreli dışı akciğer kanseri hastalarının plazma örneklerinden eksozomların ayrılması için protokolü açıklamaktadır.

Eksozom İzolasyonu: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hastalarının Plazmasından Eksozomları Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Öğrenin, karaciğer kanseri dokusundan küçük hücre dışı vezikülleri zenginleştirmek için optimize edilmiş diferansiyel ultrasantrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, klasik yöntemlere göre daha yüksek saflıkta vezikül izolasyonu sağlar.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Daha fazla video keşfet