Name: IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Öğrenin, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu hücre dışı matriste kültürleme protokolünü. Bu yöntem, osteogenez ve dentrit oluşumunu gelişmiş görüntüleme teknikleriyle incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IDG-SW3 hücre hattını hediye ettiği için Dr. Lynda F. Bonewald'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070902, 82100935 ve 81700778) ve Şangay "Bilim ve Teknoloji İnovasyonu" Yelken Projesi (21YF1442000) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, 24 oyuklu plakadan oluşan dört kuyucukta hücrelerin kültürlenmesi için uygundur. Birden fazla numune veya plaka hazırlıyorsanız, reaktiflerin miktarları buna göre artırılmalıdır.
1. Kollajen I karışımının hazırlanması
NOT: Kollajen I ve bazal membran matrisi oda sıcaklığında hızlı bir şekilde jelleşir. Bu nedenle, kolajen buz üzerinde (2 °C ila 8 °C) işlenmelidir. Kullanılan tüm uçlar ve tüpler, aksi belirtilmedikçe önceden soğutulmalıdır. Tüm prosedürler bir güvenlik başlığında gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Tüm reaktifleri ve santrifüj tüplerini buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>0.48 mL kollajen I (5 mg/mL) ve 0.1 mL 10x minimum esansiyel ortam (MEM) (fenol kırmızısı ile) buz üzerinde tutulan steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yavaşça pipetleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.</li>
	<li>Fenol kırmızı göstergesinin renk paletine göre, fenol kırmızı göstergesini turuncuya ayarlamak için uygun bir %7,5 (a/h)NaHCO3 (yaklaşık 0,2 mL) hacim kullanın, bu da pH değerinin 7,0-7,4 aralığında olduğunu gösterir. NOT: Ortamın pH'ına bağlı olarak, pH'ı yaklaşık 7.0-7.4'e getirmek için bir hacim NaHCO3 kullanılır. Ek olarak, pH nötralizasyonu için NaOH kullanılır.</li>
	<li>Uygun hacimdeddH2Oekleyerek karışımın son hacmini 1 mL'ye getirin. Kullanıma hazırlamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. NOT: ddH2O'nunson hacmi, adım 1.3'te kullanılan NaHCO3 veya NaOH miktarına bağlı olacaktır.</li>
</ol>2. Hücre-matris karışımının hazırlanması
<ol><li>0.9 mL bazal membran matrisini buz üzerinde yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yavaşça pipetleyin.</li>
	<li>IDG-SW3 hücrelerini, 33 ° C'de 50 U / mL INF-γ ile desteklenmiş 4 mL tam ortam (% 10 fetal sığır serumu [FBS] içeren alfa-MEM) içeren bir T25 şişesinde kültürleyin.</li>
	<li>IDG-SW3 hücreleri %90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın ve hücreleri bir pipetle fosfat tamponlu salinle (PBS, protokol boyunca pH 7.4) yıkayın. Hücreleri 0.5 mL %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 37 °C'de 30 saniye sindirin.</li>
	<li>3.5 mL tam ortam (% 10 fetal sığır serumu [FBS] içeren alfa-MEM) ekleyerek tripsini inaktive edin. 4 mL hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 300 °C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da döndürün. Süpernatanı atın ve hücre peletini buz üzerinde tam ortamın 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve son hücre yoğunluğunu tam ortamla birlikte 4 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın. Adım 2.1'den hücre dışı matrisin 0.9 mL'sine hazırlanan hücre süspansiyonunun 0.1 mL'sini ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. NOT: Hücresiz bir kontrole ihtiyaç duyulursa, negatif kontrol olarak 0.9 mL hücre dışı matrise 0.1 mL tam ortam ekleyin.</li>
</ol>3. Hücre-jel karışımının kaplanması
<ol><li>Adım 2.6 ve adım 1.4 ila 2 mL'deki iki karışımı buz üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça iyice karıştırın. Her bir oyuğa son karışımın 0,5 mL'sini pipetleyin (24 oyuklu bir plakanın dört oyuğu). Bir hücre-jel karışımı oluşturmak için 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>37 ° C'de osteojenik farklılaşmayı başlatmak için her bir oyuktaki hücre-jel karışımına 0.5 mL osteojenik ortam (50 μg / mL askorbik asit ve 4 mM β-gliserofosfat içeren tam ortam) (osteojenik indüksiyon ortamı olarak da bilinir) 4 ekleyin. Bunu Gün 0 olarak düşünün.</li>
	<li>Her 2 günde bir, ortamın yarısını 37 ° C'de tutulan taze osteojenik ortamla değiştirin. 35 gün boyunca kültüre devam edin.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskop kullanarak hücre canlılığını ve hücresel dendritleri tanımlamak
<ol><li>Hücre boyama NOT: Kalsein asetoksimetil ester (kalsein), hücre canlılığını belirlemek için kullanılabilen, hücre tarafından kullanılan bir boyadır. Etidyum homodimer-I (EthD-1), bozulmamış/canlı hücrelerinzarını geçmez 9. Bu nedenle, kalsein / EthD-1, hücre canlılığını ve hücresel dendritleri tanımlamak için kullanılabilir.<ol><li>Kültürün 1. ve 7. günlerinde, kalsein stok çözeltisini (DMSO'da 4 mM) ve EthD-1 stok çözeltisini (DMSO/H2O 1:4 [v/v]'de 2 mM) dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin. NOT: Mineralize matris güçlü bir otofloresan sinyaline sahiptir, bu nedenle kültürlenmeden sonraki 7 gün içinde Dmp1 ekspresyonu olmayan preosteosit aşaması4 hücre lekelenmesinin gözlemlenmesi için daha uygundur.</li>
		<li>2 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (D-PBS) 4 μL 2 μL 2 mM EthD-1 stok çözeltisi ve 5 μL 4 mM kalsein stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Bu, çalışma çözümleri olarak yaklaşık 2 μM kalsein ve 4 μM EthD-1 verir.</li>
		<li>Çalışma çözeltisinin 0,5 mL'sini 24 oyuklu plakadaki kuyucuklara pipetleyin. Hücre-jel matrisini boyamak için oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyondan sonra, 35 mm'lik yeni bir cam tabanlı kültür kabına yaklaşık 0,5 mL taze D-PBS ekleyin. Numunelerin kirlenmesini veya kurumasını önlemek için tabağın üzerini örtün.</li>
		<li>Dirsek uçlu forseps kullanarak, 4.1.3 adımındaki lekeli hücre-jel matrisini 4.1.4 adımındaki 35 mm'lik kültür kabına dikkatlice aktarın. Hücre-jel matrisine zarar vermekten veya kesmekten kaçının.</li>
		<li>Etiketli hücreleri bir lazer konfokal floresan mikroskobu altında görüntüleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroskop tarama seti<ol><li>35 mm'lik çanağı sahneye yerleştirin. 10x objektif kullanarak göz merceğinden taranacak hücre-jel matrisinin bölgelerini seçin. Genişletilmiş dendritlerin boyutu nedeniyle daha yüksek büyütme hedefleri önerilmez.</li>
		<li>Optik filtreleri seçin. Calcein, standart bir floresein bant geçiren filtre ile yeşil olarak görüntülenebilir ve EthD-1, propidyum iyodür veya Texas Red boya filtreleriyle kırmızı olarak görüntülenebilir. Tarama için "çizgi modunu" seçin ve "iğne deliğini" 2 μm'ye ayarlayın.</li>
		<li>8 bit veri derinliği ve 1.024 piksel x 1.024 piksel görüntü çözünürlüğü seçin.</li>
		<li>Optimum lazer ve dedektör ayarlarıyla sıralı çizgi taraması kullanan görüntü (olası foto ağartmayı önlemek için minimum lazer enerjisi tutun). NOT: Optimum dedektör ayarı, son floresan sinyallerine bağlıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntülerden oluşan bir "z-yığını" toplama<ol><li>Yeşil kanal sinyaline göre, sürekli tarama yaparken numuneye odaklanarak taranacak hücre-jel matrisinin üst ve alt konumlarını tanımlayın, .</li>
		<li>Örneğin üst ve alt kısımları belirtildikten sonra, istediğiniz tarama çerçevesini seçin. Taramayı başlatın. Örnek, 4.2. adımdan seçilen ayarlarla yukarıdan aşağıya doğru taranacak ve bir görüntü galerisi oluşturulacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre canlılığının tanımlanması.<ol><li>Adım 4.3'ten bir dilim seçin. Yeşil ve kırmızı kanallar sırasıyla canlı ve ölü hücreleri gösterir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre dendrit tanımlaması.<ol><li>Görüntü alma yazılımıyla 3B rekonstrüksiyonlar oluşturmak için tek yeşil kanalı seçin. Derinlik bilgisi, bir dizi gökkuşağı sahte renkli görüntü olarak görüntülenir. Jelin altında bulunan dendritler kırmızı renkte, üsttekiler ise mavi renkte gösterilir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Stereomikroskop kullanarak görünümü tanımlama
<ol><li>Kültürün 1. gününde, 7. gününde, 21. gününde ve 35. gününde, kültür ortamını çıkarın ve jelleri plakada D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücre-jel matrisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plakaya sabitlemek için kuyuya D-PBS'de 0,5 mL %4 (h/h) paraformaldehit ekleyin.</li>
	<li>Kuyucuktaki paraformaldehiti çıkarın ve hücre-jel matrisini plakadaki D-PBS ile iki kez daha yıkayın. Görüntüleme için her kuyucukta 0,5 mL D-PBS bırakın.</li>
	<li>Plakayı sahneye yerleştirin ve 0,5x objektif kullanarak göz merceğinden en uygun konumu seçin. Parlak alan altında "otomatik pozlama" kullanarak plakadaki hücre-jel matrisinin tam alan görünümünü ayrı ayrı görüntüleyin.</li>
</ol>6. XRF tahlili ile mineral birikiminin belirlenmesi
<ol><li>Kültürün 35. gününde, sıvı nitrojenin yeterli olup olmadığını kontrol edin. XRF sistemini başlatın. Numune odasını açın ve dirsek uçlu forsepsli jelleri plakadan aletin numune aşamasının ortasına aktarın. Numune odasını kapatın ve kullanmadan önce cihazın soğuması için 30 dakika bekleyin.</li>
	<li>Çekim kurulumu için "Pozlama süresini" 35 ms'ye, "Spektrum aralığını" 0-40 keV'ye ve "Elektrik akımını" 770 μA'ya ayarlayın.</li>
	<li>Örnek aşamayı hareket ettirerek analiz için üç ila beş tarama alanı seçin.</li>
	<li>Algılama için elemanları (Ca ve P) seçin. Algılamayı başlatın ve sonuçları dışa aktarın. NOT: Ca ve P , hidroksiapatitte en bol bulunan elementlerdir.</li>
</ol>7. Fonksiyonel gen ekspresyonunun tanımlanması
<ol><li>Kültürün 1. gününde, 7. gününde, 21. gününde, 28. gününde ve 35. gününde, kültür ortamını çıkarın ve hücre-jel matrisini plakada buz gibi soğuk D-PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Dirsek uçlu forsepsli jelleri plakadan 2.0 mL'lik bir tüpe aktarın (kültür süresine göre, hücre-jel matrisi 35. günde kademeli olarak yaklaşık 0.1 mL'ye küçülür). Bir jelin bir tüpe yerleştirildiğinden emin olun. Her tüpe 1 mL fenol-kloroform ve iki steril paslanmaz çelik çırpma boncuğu (4 mm, bir lizasyon matrisi olarak) ekleyin. Tüpleri simetrik olarak mekanik çırpma homojenizatörünün önceden soğutulmuş numune yuvasına yerleştirin.</li>
	<li>Toplamda altı döngü ile 10 saniyelik bir duraklama ile her 1 dakikalık mekanik vuruşta çırpmayı 55 Hz frekansa ve 1 cm genliğe ayarlayın. Boncuk çırpmaya başlayın.</li>
	<li>Fenol-kloroform-izoamilachohol yöntemini kullanarak hücre-jel matrisinden toplam RNA'yı çıkarın. Rastgele heksamer primerleri ile 2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya ters çevirin.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR için β-aktin, Pdpn, Dmp1, Sost ve Fgf23'ü hedefleyen primerler tasarlayın (Tablo 2). β-Aktin, normalizasyon için kullanılan temizlik genidir. Pdpn10 ve Dmp1 11 genleri esas olarak pre-osteositlerde ve mineralize osteositlerde eksprese edilirken, Sost12 ve Fgf23 13 esas olarak olgun osteositlerde eksprese edilir.</li>
	<li>Tüpü, ısıtılmış kapağı 105 °C'ye ayarlanmış bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki PCR döngü ayarlarını kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 5 saniye boyunca 95 °C ve 35 döngü için 30 saniye boyunca 60 °C, 5 dakika boyunca 95 °C'de bir ilk denatürasyon adımı ve 30 saniye boyunca 60 °C'de bir son uzatma adımı. Kıvrım değişikliklerini ΔΔCt yöntemi ile analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokoldeki kritik bir nokta, spontan pıhtılaşmayı önlemek için 1. ve 2. adımların buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğidir. Bu yöntemde, nihai kollajen I konsantrasyonu 1.2 mg / mL idi. Bu nedenle, çeşitli üreticilerin farklı kollajenlerine uyacak şekilde optimal bir ddH2O hacmi hesaplanmalıdır.
İn vivo osteositogenez, osteoblastların yüzeyden trabeküler kemiğiniçine polar hareketini içerir 14. Bu protokol, hücreleri yönlü polarite olmadan m...

Osteositler, osteoblastlardan(1,2) türetilen terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Osteoblast osteoid tarafından gömüldükten sonra, osteositogeneze uğrar ve preosteositler oluşturmak için Pdpn genini, osteoidi mineralize etmek için Dmp1 genini ve kemik dokusunda olgun bir osteosit olarak işlev görmek için Sost ve Fgf23 genlerini eksprese eder3. Burada, osteositogenez sürecinde dendrit uzantısını ve işaretleyici gen ekspresyonunu tanımlamak için bir 3D kültür sistemi tanıtılmıştır.
IDG-SW3 hücreleri, transgenik farelerden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir birincil hücre hattıdır ve farklı ortamlarda kültürlendiğinde osteoblastı geç osteosit farklılaşmasına kadar genişletebilir veya çoğaltabilir4. MLO-A5, MLO-Y4 ve diğer hücre dizileri ile karşılaştırıldığında, fonksiyonel proteinlerin ekspresyon profili, kalsiyum tuzu biriktirme yeteneği ve IDG-SW3 hücrelerindeki çeşitli hormonlara verilen yanıtların, kemik dokusundaki primer osteositlerinkilerle aynı olma olasılığı daha yüksektir4.
2D sistemlerle karşılaştırıldığında, 3D kültür sistemleri, besin gradyanı, düşük mekanik sertlik ve çevreleyen mekanik aralık dahil olmak üzere in vivo hücresel büyüme ortamını taklit etme konusunda daha yeteneklidir (Tablo 1). Osteoblastik hücrelerin bir 3D sistemde kültürlenmesi için önceki yöntemlerin çoğu, 4,5,6 formülasyonlarında benzersiz bileşen olarak kollajen I'i kullandı, çünkü kollajen I lifleri kalsiyum ve fosfor birikimi bölgesi olarak hizmet eder. Bununla birlikte, osteoidde vazgeçilmez bir bileşen olan hücre dışı matriks, hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü 7,8 destekleyen geniş bir hücresel faktör grubu içerir ve görüntüleme gözlemi için şeffaf ve uygundur. Bu nedenle, bu protokol, osteositogenez çalışması için ikincil bir bileşen olarak Matrigel'i (bundan sonra bazal membran matrisi olarak anılacaktır) kullanır.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit</td><td>Hiplon</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Corning, NY, ABD</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>%7,5 (a/h) Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, MO, ABD</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich, MO, ABD</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>homojenizatör</td><td>BiHeng&nbsp; Biyoteknoloji, Şangay, Çin</td><td>SKSI</td><td></td></tr><tr><td>lazer konfokal floresan mikroskobu</td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Hücre Görüntüleme kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrisi</td><td>Corning, NY, ABD</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), glutamin içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21430079</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich, MO, ABD</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin</td><td>Hiklon</td><td>SH30256. </td><td></td>FS</tr><tr><td>stereo mikroskop</td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td>Zeiss Axio ZOOM. V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>X-ışını floresan</td><td>EDAX, ABD</td><td>KARTALI III</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -gliserofosfat</td><td>Sigma-Aldrich, MO, ABD</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

idg-sw3 Üç boyutlu hücre dışı matriste hücre kültürü

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Osteositler, osteoblastlardan terminal olarak farklılaşan proliferatif olmayan hücreler olarak kabul edilir. Kemik hücre dışı matrikste (osteoid) gömülü osteoblastlar, hücresel dendritler oluşturmak ve preosteositlere dönüşmek için Pdpn genini eksprese eder. Daha sonra, preosteositler, matriks mineralizasyonunu teşvik etmek ve böylece olgun osteositlere dönüşmek için Dmp1 genini eksprese eder. Bu sürece osteositogenez denir. IDG-SW3, osteositogenezin in vitro çalışmaları için iyi bilinen bir hücre hattıdır. Önceki birçok yöntem, kollajen I'i kültür matrisinin ana veya tek bileşeni olarak kullanmıştır. Bununla birlikte, kollajen I'e ek olarak, osteoid ayrıca hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü teşvik etmede önemli bir bileşen olan bir öğütülmüş madde içerir. Ek olarak, matris maddesi şeffaftır, bu da kollajen I-oluşturulan jelin şeffaflığını arttırır ve böylece görüntüleme teknikleri yoluyla dendrit oluşumunun araştırılmasına yardımcı olur. Bu nedenle, bu makale, IDG-SW3'ün hayatta kalması için kollajen I ile birlikte hücre dışı bir matris kullanarak bir 3D jel oluşturmak için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu çalışmada, osteositogenez sırasında dendrit oluşumu ve gen ekspresyonu analiz edilmiştir. 7 günlük osteojenik kültürden sonra, floresan konfokal mikroskop altında geniş bir dendrit ağı açıkça gözlendi. Gerçek zamanlı PCR, Pdpn ve Dmp1'in mRNA seviyelerinin 3 hafta boyunca sürekli arttığını gösterdi. 4. haftada, stereomikroskop, X-ışını floresan (XRF) testi ile tutarlı olarak mineral parçacıklarla dolu opak bir jel ortaya çıkardı. Bu sonuçlar, bu kültür matrisinin osteoblastlardan olgun osteositlere geçişi başarılı bir şekilde kolaylaştırdığını göstermektedir.

Canlı/ölü hücre boyamadan sonra, hücreler konfokal lazer mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Tüm hücreler kalsein-pozitifti (yeşil renk) ve sahada neredeyse hiç EthD-1-pozitif hücre (kırmızı renk) yoktu, bu da bu yöntemle yapılan jel sisteminin osteositogenez için oldukça uygun olduğunu gösteriyor (Şekil 1A, sol). Hücrelerin uzamsal dağılımını daha iyi belirlemek için, hücre dendritlerini jelin farklı derinliklerinde görüntülemek için sahte renkli bir görüntü seçildi; Kırmızı, jelin altınd...

Burada, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Osteogenez yoluyla oluşum ve gen ekspresyonunu analiz etmek için kollajen ile birlikte hücre dışı ölçümler kullanarak bir 3D sistem kurmak için bir protokolü detaylandırdık. Hücre dışı metrikler, kollajen tek formlu jelin şeffaflığını artırabilir ve görüntüleme teknikleri için dendrit oluşumunu keşfetmek için uygundur. Yavaşça başlamak için, 0,9 mililitre bazal membran matrisini buz üzerinde 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve bir kenarda tutun.Daha sonra, inkübatörden interferon gama ile takviye edilmiş dört mililitre tam ortamda IDG SW3 kültürlenmiş hücrelerin bir T25 ipini çıkarın. Kültür ortamını çıkardıktan sonra, hücreleri PBS pH 7.4 ile bir pipetle yıkayın. Daha sonra hücreleri 30 saniye boyunca 37 santigrat derecede 0.5 mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile tripsanize edin.3.5 mililitre tam ortam ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin. Santigrat emekli maaşının dört mililitresini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.Süpernatanı attıktan sonra, hücre paletini buz üzerinde tam ortamın bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın ve son hücre yoğunluğunu tam ortamla dört kez 10 ila mililitre başına beşinci hücreye ayarlayın. Buz üzerinde tutulan hücre dışı matrisin 0.9 mililitresine hazırlanan hücre süspansiyonunun 0.1 mililitresini ekleyin.Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Bir mililitre hücre matris karışımını ve bir mililitre önceden hazırlanmış kolajeni buzun üzerine yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Son karışımın 0.5 mililitresini 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin ve bir hücre jeli karışımı oluşturmak için bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.İnkübasyondan sonra, her bir oyuktaki hücre jel karışımına 0.5 mililitre osteojenik ortam ekleyin. Osteojenik farklılaşmayı 37 santigrat derecede başlatmak için bunu sıfır gün olarak düşünün. Her iki günde bir, ortamın yarısını taze osteojenik ortamla değiştirin ve 35 gün boyunca kültüre devam edin.Kalsiyum ve etidyum bir stok çözeltisini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin. İki mililitre DPBS'ye dört mikrolitre iki milimolar etidiyum, bir stok çözeltisi ve beş mikrolitre dört milimolar kalsiyum stok çözeltisi ekleyin ve iki mikromolar kalsiyum ve dört mikromolar etidyum elde etmek için iyice karıştırın. Kültürün birinci ve yedinci gününde hücre boyama yapmak için, 0.5 mililitre çalışma solüsyonunu 24 oyuklu plakanın kuyucuklarına pipetleyin ve hücre jel matrisini boyamak için oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin.Yeni bir 35 milimetrelik cam tabanlı kültür kabına yaklaşık 0,5 mililitre taze DPBS ekleyin ve numunelerin kontaminasyonunu veya kurumasını önlemek için kabı kapatın. Dirsek uçlu forseps kullanarak, lekeli hücre jel matrisini, hücre jel matrisine zarar vermeden veya kesmeden dikkatlice DPBS içeren kültür kabına aktarın. Etiketli hücreleri bir lazer konfokal floresan mikroskobu altında görüntüleyin.Lekeli hücre jeli matrisini içeren kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin. 10x objektif kullanarak göz merceğinden taranacak hücre jeli matrisinin bölgelerini seçin. Mikroskop taramasını ayarlamak için optik filtreleri seçin.Kalsiyumu standart bir floresan bant geçiren filtreyle yeşil olarak ve etidiyumu propidyum iyodür veya Texas kırmızı boyası filtreleriyle kırmızı olarak görüntüleyin. Tarama için çizgi modunu seçin, ardından havadar birimleri bir au'ya ayarlamak için çekim moduna tıklayın. 8 bit veri derinliği ve 1024 x 1024 piksel görüntü çözünürlüğü seçin.Ardından satır adımını seçin ve tarama hızını beş olarak ayarlayın. Z görüntü yığınını toplamak için, yeşil kanal sinyaline göre sürekli tarama yaparken örneğe odaklanarak taranacak hücre jel matrisinin üst ve alt konumlarını tanımlayın. Örneğin üst ve alt kısımları belirlendikten sonra, istediğiniz tarama çerçevesini seçin ve taramaya başlayın.Örnek, seçilen ayarlarla yukarıdan aşağıya doğru taranır ve bir görüntü galerisi oluşturulur. Uygun hücreleri belirlemek için, bir görüntü dilimi seçin. Yeşil ve kırmızı kanallar sırasıyla canlı ve ölü hücreleri gösterir.Hücre dendritini tanımlamak için, görüntü alma yazılımı ile 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için tek yeşil kanalı seçin, bir dizi gökkuşağı sözde renkli görüntü derinlik bilgisini gösterir. Alttaki dendritler kırmızı renkte, üsttekiler ise mavi renkte gösterilir. Farklı kültür günlerinde, kültür ortamını çıkarın ve jelleri plakada DPBS ile iki kez yıkayın.Hücre jeli matrisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plakaya sabitlemek için kuyucuğa DPBS'de 0.5 mililitre veya% 4 paraformaldehit ekleyin. Kuyucuktaki paraformaldehiti çıkarın ve hücre jeli matrisini daha önce gösterildiği gibi plakada DPBS ile iki kez daha yıkayın ve görüntüleme için her kuyucukta 0,5 mililitre DPBS bırakın. Plakayı stereo mikroskop tablasına yerleştirin ve 0.5x objektif kullanarak göz merceği boyunca en uygun konumu seçin.Görüntü, parlak alan altında otomatik pozlama kullanılarak plakadaki hücre jeli matrisinin tam alan görünümü. Kültürün 35. gününde, sıvı nitrojen seviyelerini kontrol edin ve XRF sistemini başlatın. Numune odasını açın ve dirsek uçlu forseps ile jelleri plakadan cihazın numune aşamasının ortasına aktarın.Numune odasını kapatın ve kullanmadan önce cihazın soğuması için 30 dakika bekleyin. Pozlama süresini 35 milisaniyeye ayarlayın. Spektrum aralığı sıfır ila 40 kilo elektron volt ve elektrik akımı 770 mikroamper edinim kurulumu için.Örnek aşamayı hareket ettirerek, analiz için üç ila beş tarama alanı seçin. Kalsiyum ve fosfor elementlerini seçin. Algılamayı başlatın ve sonuçları dışa aktarın.Farklı kültür günlerinde. Kültür ortamından çıkarılan hücre jeli matrisini daha önce gösterildiği gibi buz gibi soğuk DPBS ile iki kez yıkayın. Fenol kloroform izoamil alkol yöntemini kullanarak hücre jeli matrisinden toplam RNA'yı çıkarın.Daha sonra iki mikrogram toplam RNA'yı rastgele heksamer primerleri ile CDNA'ya ters çevirin. Tüpü bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. PCR sonrası iki delta CT yöntemi ile kıvrım değişikliklerini analiz edin.Konfokal lazer mikroskobu altında görüntülenen canlı ölü hücre boyama, tüm hücrelerin kalsiyum pozitif olduğunu ve jel sisteminin osteositogenez için oldukça uygun olduğunu gösteren neredeyse hiç etidyum bir pozitif hücre olmadığını gösterdi. Hücresel dendritler, yedinci günde osteojenik ortamda yavaş yavaş bir ağa yayıldı. Yedinci gün kültürünün sahte renkli bir görüntüsü, hücre androidlerini jelin altında ve üstünde farklı derinliklerde görüntüler.Belirtilen zamanlarda 24 oyuklu bir plakada hücreli ve hücresiz jelin tam alan görüntüleri görüntülenir. Jel matrisinin şeffaflığı, hücresiz jel matrisinin aksine 35. günde opak hale gelene kadar azalmaya devam etti. Opak jelin 35. gündeki XRF spektrumu, jelin tamamen kalsiyum ve fosfor birikintileri ile dolu olduğunu gösterdi.Gerçek zamanlı PCR ile analiz edilen birkaç belirteç geninin ekspresyonu, podoplanin ve dentin matriks proteini birinin mRNA seviyelerinin birinci günden 21. güne kadar sürekli arttığını ve mRNA seviyesinin 21. günden sonra azaldığını gösterdi. Fibroblast büyüme faktörü 23 ve sklerostin mRNA seviyeleri tüm aşamalarda sürekli olarak artmıştır. Kollajen bir ve bazal membran metrikleri hızlı bir şekilde jelleşir ve oda sıcaklığı.Bu nedenle, aksi belirtilmedikçe kullanılan tüm uçlar ve tüpler önceden soğutulmalıdır. Osteogenez sırasında herhangi bir ilginç olay görüntüleme teknikleri ile gözlemlenebilir. Dendrit oluşumu ve uzaması sırasında molekül etkisini lokalize etmek daha kolaydır.

idg-sw3-cell-culture-in-a-three-dimensional-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

dokuya özgü, hücre dışı matris (ECM) hücre fonksiyonunun önemli bir düzenleyicidir. Bu makalede, saf ECM türevli köpükler ve in vitro hücre kültürü modelleri ileri 3D uygulamaları için ya da ön-rejeneratif bioscaffolds gibi kimyasal çapraz bağlama yapılmasına gerek olmadan kültürdeki kararlı olan mikro taşıyıcıları sentezlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Burada, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı sistemde fibroblastlarla kültürlenen epitel hücrelerinin membrana nasıl stabil bir şekilde yapışabileceğini ve zar üzerinde büyüyebileceğini gösteriyoruz.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Öğrenin, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu hücre dışı matriste kültürleme protokolünü. Bu yöntem, osteogenez ve dentrit oluşumunu gelişmiş görüntüleme teknikleriyle incelemeyi kolaylaştırır.

IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü

Daha fazla video keşfet